Extracto
Antecedentes
El cáncer colorrectal (CCR) es una de las principales causas de muerte en el mundo . Se necesitan con urgencia sensibles no invasivos métodos de diagnóstico de la pantalla, para mejorar sus tasas de supervivencia. Stable Micro RNA circulantes ofrece oportunidades únicas para el diagnóstico precoz de varias enfermedades, incluyendo el cáncer. Nuestro objetivo ha sido encontrar nuevos miRNAs de plasma que pueden ser utilizados como biomarcadores para la detección de CCR.
Metodología /Principales conclusiones
De acuerdo con los resultados de la elaboración de perfiles de miARN a cabo en la agrupación de las muestras de plasma se forman 10 pacientes con CRC o 10 controles sanos, un panel de miRNAs (HSA-miR-10a, -19a, -22 *, -24, -92a, 125a-5p, -141, -150, -188-3p, -192, -210, -221, -224 *, -376a, -425 *, -495, -572, -601, -720, -760 y hsa-let-7a, -7E) fueron desregulados en el plasma CRC con los cambios veces & gt ; 5. Después de la validación a gran escala de QRT-PCR realizado en otros 191 individuos independientes (90 CRC, 43 adenomas avanzados y 58 participantes sanos), se encontró que los niveles de plasma de miR-601 y miR-760 se redujo significativamente en la neoplasia colorrectal (carcinomas y adenomas avanzados) en comparación con los controles sanos. análisis de la curva ROC mostró que el plasma de miR-601 y miR-760 eran de un valor significativo para el diagnóstico de neoplasia avanzada. Estos dos miRNAs en conjunto producen una AUC de 0,792 con una sensibilidad del 83,3% y el 69,1% de especificidad para la separación de CRC de los controles normales, y producen una AUC de 0,683 con una sensibilidad del 72,1% y 62,1% de especificidad en los adenomas avanzados discriminantes de los controles normales.
Conclusiones /Importancia
plasma de miR-601 y miR-760 pueden servir potencialmente biomarcadores no invasivos como prometedores para la detección precoz del CCR
Visto:. Wang Q, Huang Z, Ni S, Xiao X, Xu Q, Wang L, et al. (2012) plasma de miR-601 y miR-760 son biomarcadores novedosos para la detección precoz del cáncer colorrectal. PLoS ONE 7 (9): e44398. doi: 10.1371 /journal.pone.0044398
Editor: Ajay Goel, Baylor University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 23 de febrero, 2012; Aceptado: 6 Agosto de 2012; Publicado: 6 Septiembre 2012
Copyright: © Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue parcialmente apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Grant Nos. 81000867 y 81071791), Ciencia y TechnologyCommission de la municipalidad de Shanghai (Grant No. 09JC1403700 y 10XD1401300), y subvenciones de inicio de investigación Mérieux. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción cuentas
CRC en todo el mundo por 600 mil muertes por año. En China, el CRC sigue siendo la cuarta causa más común de muertes relacionadas con el cáncer hasta la fecha [1], [2]. El estadio del tumor al momento del diagnóstico es el factor pronóstico más importante en el CCR, haciendo que la detección temprana de una importancia crucial en la reducción de la mortalidad y mejorar las tasas de cumplimiento. Se necesitan urgentemente nuevos biomarcadores para la detección temprana. adenomas avanzados suelen definirse como adenomas de 1 cm o más, y los que tienen componentes vellosos (o túbulo-vellosos) o displasia de alto grado [3], [4]. adenomas avanzados vinculan claramente en la cadena de adenoma benigno de CCR avanzado. Por lo tanto, la mayoría de las estrategias de cribado de CCR se centran en la tasa de detección de ambos CRC y adenomas avanzados.
MiRNAs son pequeños ARN no codificantes (18-22 nt de longitud) que regulan la expresión de genes diana en el post- nivel de la transcripción mediante la unión a ARNm diana. Desde su descubrimiento en 1993, expresiones alteradas de miRNAs se han asociado con muchos tipos de tumores, incluyendo CRC [5], [6]. Su asociación con la génesis tumoral indica su potencial como marcadores de diagnóstico y dianas terapéuticas [7], [8].
miRNAs circulantes se detectan de forma estable en el plasma /suero y sirven como biomarcadores para varias enfermedades [9], [10 ], [11], [12], [13], [14], lo que los marcadores no invasivos potencialmente útiles para el diagnóstico precoz o en la progresión del cáncer de monitoreo. Anteriormente hemos encontrado que los niveles elevados de miR-29a y miR-92a en el plasma tienen un valor significativo para el diagnóstico de CCR [15]. Para reforzar la eficacia diagnóstica de hacer circular miARN, es necesario identificar nuevos objetivos. En este estudio, se encontró que el plasma de miR-601 y miR-760 concentraciones podrían contribuir a la detección precoz del CRC de acuerdo con el perfil de chip y posterior validación a gran escala usando QRT-PCR.
Materiales y Métodos
Población de estudio
Un grupo de 10 CRC (incluyendo 5 en estadio II y 5 pacientes en estadio III) y 10 controles normales se prepararon para la primera miARN perfiles (Tabla S1). Independiente de edad y 191 individuos emparejados por sexo fueron reclutados en gran escala para la validación de QRT-PCR, incluyendo 90 pacientes con CRC (Fase I-IV), 43 pacientes con adenoma avanzado y 58 participantes sanos (Tabla S2, S3). muestras de tejidos emparejados utilizados para el análisis de la expresión de miRNAs seleccionadas fueron proporcionados por otros 19 pacientes con CRC (Tabla S4). Los pacientes con una historia previa de tumores malignos, CCR hereditario no asociado a poliposis o poliposis adenomatosa familiar fueron excluidos de este estudio. Se recogieron muestras de sangre antes de que se recogieron muestras de tejido de operación y después de la cirugía. Tumor fue efectuado de acuerdo con la Unión Internacional contra el Cáncer (UICC) directrices. El Comité Ético de Investigación Clínica del Hospital de Cáncer de la Universidad de Fudan aprobó los protocolos de investigación y presta su consentimiento informado por escrito se obtuvieron de los participantes.
Aislamiento de ARN
se obtiene una cantidad de 5 a 10 mililitros de sangre entera de cada participante. El plasma se obtuvo por centrifugación a 1200 g durante 10 min a 4 ° C. Para completar la eliminación de los componentes celulares residuales, muestras de plasma se volvió a centrifugar a 12.000 g durante 10 minutos más a 4 ° C. El plasma sobrenadante se congeló en alícuotas separadas a -80 ° C hasta su uso. Este procedimiento se llevó a cabo dentro de 2 horas después de la punción venosa. Un volumen de 600 l de plasma descongelado se calentó a 65 ° C durante 10 min y después se incubó a 42 ° C durante 1 h para desnaturalizar la proteína. El ARN total se extrajo del plasma de precalentamiento usando Mirvana PARIS Kit (Ambion, EE.UU.), eluyendo en 60 uL (95 ° C) agua libre de RNasa. A continuación, los ARN de plasma se concentraron en un volumen final de 20 l usando un Eppendorf Concentrator Plus 5301 (Eppendorf, Alemania). Para la normalización de los cambios de muestra de la muestra durante el aislamiento de ARN y el control interno como, mismas cantidades (25 fmol) de C. elegans sintética miARN-39 (cel-miR-39) se añadió a cada muestra desnaturalizada. El ARN total de los tejidos CRC fue extraído utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo previsto. La concentración de las muestras de RNA se cuantificó por NanoDrop ND-1000 (Nanodrop, EE.UU.).
Mirna perfiles
perfiles Mirna se realizó con un sistema miRCURY LNA ™ universal RT PCR microARN (Exiqon, Dinamarca ) el 2 combinaron muestras de plasma de 10 CRC (incluyendo 5 en estadio II y 5 pacientes en estadio III) y 10 controles normales. El método se basa en la transcripción inversa universal (RT), seguido de amplificación por PCR cuantitativa en tiempo real con LNA ™ cebadores mejoradas utilizando SYBR Green. cebadores pre-alícuotas LNA ™ PCR se pusieron en placas de 384 pocillos de PCR para cada reacción por pocillo [16]. Un volumen de 600 l de cada muestras de plasma se recogió y se mezcló uniformemente. El ARN total se preparó como se ha descrito anteriormente y se utilizó una cantidad de 500 ng para el siguiente perfil. Se detectó un total de 742 miRNAs objetivo y doblar los cambios de cada miARN expresión se calcularon.
Cuantificación de miRNAs por QRT-PCR
Alrededor del 30 ng enriquecido ARN se transcribe de forma inversa con un microARN inversa TaqMan Kit de transcripción (Applied Biosystems, EE.UU.) en un volumen de reacción de 10 l. productos de RT se utilizan como plantillas para el siguiente proceso de PCR después de una dilución de 1:10. Los niveles de expresión de miRNAs se cuantificaron por triplicado mediante qRT-PCR utilizando TaqMan humana MicroARN kits de ensayo (Applied Biosystems, EE.UU.) en un ABI 7900 HT instrumento QRT-PCR (Applied Biosystems, EE.UU.). Tanto pinchos en cel-miR-39 y miR-16 endógena se utilizaron como normalizadores para la cuantificación de miRNA de plasma, mientras que RNU6B de muestras de tejido.
Mirna Estabilidad en plasma
La misma muestra de plasma, divididos en varias alícuotas, se sometió a una serie de tratamientos, tales como la incubación a temperatura ambiente durante tiempos diferentes (1, 2, 4, 8, 16, 24 h) o sometiéndolos a diferentes números de ciclos de congelación /descongelación de temperatura de almacenamiento ( -80 ° C) y la temperatura ambiente (22 ° C). Para evaluar la estabilidad del plasma de miR-601 y miR-760, los valores de Ct detectados por QRT-PCR que refleja las concentraciones de las muestras experimentales se compararon con los que se someten los protocolos estándar.
Análisis estadístico
La expresión relativa de miRNAs fue analizado por el 2
- método △△ Ct. Se utilizó la prueba de Mann-Whitney para comparar la expresión de miRNAs en plasma entre los diferentes grupos. curvas (ROC) característica del receptor de la explotación y el área bajo la curva ROC (AUC) evaluaron la viabilidad de la utilización de plasma miARN como herramienta de diagnóstico del CCR. El índice Younden determina el umbral para las concentraciones de plasma miARN. La correlación entre características clínico y los niveles plasmáticos de miARN se determinó mediante la prueba de Mann-Whitney, prueba de la t-test o Χ2 de Student. Todas las pruebas fueron de 2 caras y un nivel de significación de P & lt; 0,05 (IC del 95%) se consideró estadísticamente significativo. El análisis estadístico se basó en el software SPSS 16.0 (SPSS Ltd, UK) y los gráficos se han generado con GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc, EE.UU.).
Resultados
Mirna perfiles
Después de excluir a varios genes miARN objetivos con valores de Ct & gt; 35 en muestras de cáncer por su extremadamente baja expresión, 86 miRNAs se expresan diferencialmente entre el CRC y el control de cambios veces con & gt; 2 (cuadro S5). Tanto el miR-29a y miR-92a se incluyeron en la lista de arriba regulada a medida que se informó anteriormente [15]. Algunos otros objetivos desregulados, como tiene-miR-95, -181b, -200C, -220 y -221, se informó anteriormente en el CCR [13], [17]. Los datos en bruto de los genes miARN perfiles se ha cargado en la base de datos GEO (GSE38716). Con el fin de reducir el alcance del estudio, un panel de 9 miRNAs hasta reguladas (HSA-miR-19a, -22 *, -24, -92a, -125a-5p, -210, -221, -376a y HSA let-7e) y un panel de 13 miRNAs-regulado (HSA-miR-10a, -141, -150, -188-3p, -192, -224 *, * -425, -495, -572, -601 , -720, -760 y hsa-let-7a) fueron seleccionados con los cambios veces & gt; 5. Al considerar nuestro objetivo de encontrar nuevos biomarcadores plasmáticos, 5 anterior informó de los objetivos (HSA-miR-92a, -141, -210, -221 y hsa-let-7a) fueron retirados [13], [17], [18], [19], [20], [21], [22], y se seleccionaron los 17 miRNAs restantes para su posterior validación a gran escala QRT-PCR.
Valor diagnóstico de miR-601 y miR-760 para CRC
para identificar los 17 miRNAs plasma expresados diferencialmente identificados por perfiles de expresión, sus niveles fueron medidos mediante qRT-PCR en 90 CRC y 58 controles normales normalizado a pinchos en cel-miR-39. Tanto el miR-601 y miR-760 se redujo significativamente en el plasma CRC en comparación con los controles (P & lt; 0,0001, Figura 1). análisis de la curva ROC indica su valor potencial de diagnóstico y las AUC para miR-601 y miR-760 eran 0,747 (IC del 95%: 0,666 hasta 0,828) y 0,788 (IC del 95%: 0,714 a 0,862), respectivamente. En un umbral de -11,50 para miR-601, la sensibilidad y especificidad óptima fueron 69,2% y 72,4% en la separación de CRC de los controles normales. En un umbral de -8,09 para el miR-760, la sensibilidad y la especificidad fueron del 80,0% y 72,4%, respectivamente. Análisis simultáneo de miR-601 y miR-760 mostró un AUC similar de 0,792 (IC del 95%: 0,719-0,865) como miR-760, con un 83,3% de sensibilidad y especificidad del 69,1%, lo que indica un efecto aditivo de los pobres 2 miRNAs (Figura 2). Hemos identificado previamente que el plasma de miR-29a y miR-92a tienen un valor significativo para el diagnóstico de CCR [15]. Para la mayoría de los casos en los que el estudio fue la misma que en el presente documento, se añadieron estos dos objetivos para análisis de la curva ROC combinado con miR-760. El AUC resultante aumentó a (CI 95%: 0,908 hasta 0,979) 0,943 con una sensibilidad del 83,3% y 93,1% de especificidad en la discriminación de CRC desde el control, lo que sugiere el efecto aditivo en el valor de diagnóstico de estos 3 miRNAs (Figura S1, S2). Además de miR-601 de estos tres miRNAs no mejoró su poder diferenciar entre pacientes con CRC y controles normales y resultó en una misma AUC de (IC del 95%: 0,907-0,978) 0,943. Además, no se encontraron diferencias significativas entre los pacientes y los controles de CRC en los 15 restantes miRNAs (
P Hotel & gt; 0,05, datos no mostrados). Cuando los datos de QRT-PCR se normalizó a miR-16 [15], el plasma de miR-601 y miR-760 todavía eran significativamente las reguladas en el CCR en comparación con los controles normales (
P = 0,002
de miR 601 y
P
. & lt; 0,0001 para miR-760, Figura S3)
validación a gran escala de miR-601 y miR-760 en muestras de plasma (n = 191). gráficos de dispersión de los niveles plasmáticos de miR-601 (A) y miR-760 (B) en sujetos sanos (n = 58), adenomas avanzados (n = 43) y pacientes con CRC (n = 90). Los niveles de expresión de los miRNAs se normalizaron a CEL-miR-39. La línea representa el valor de la mediana. Se utilizó la prueba de Mann-Whitney para determinar la significación estadística.
Valor diagnóstico de miR-601 y miR-760 para adenomas avanzados
Para continuar nuestra investigación sobre el valor diagnóstico del MIR -601 y miR-760 en la Convención de desarrollo, que mide su expresión en plasma en 43 adenomas avanzados, que se definieron como lesiones precancerosas del CRC. Los niveles plasmáticos de miR-601 y miR-760 se redujeron notablemente en los adenomas avanzados en comparación con los controles normales (
P = 0,018
tanto para el miR-601 y miR-760, figura 1). Tanto los 2 miRNAs podrían débilmente diferenciar los adenomas avanzados de los controles normales como lo demuestra el análisis de la curva ROC; y el AUC fue (IC del 95%: 0,530 a 0,747) 0,638 para el miR-601 y 0,682 (IC del 95%: 0,576-0,789) para miR-760. La sensibilidad y especificidad óptimas de miR-601 fueron 72,1% y 51,7% a un valor de corte de -10,73; estos valores de miR-760 fueron 69,8% y 62,1% a un valor de corte de -7,63. El análisis combinado de miR-601 y miR-760 no pudo mejorar la eficacia diagnóstica de miR-760 y mostró un AUC similar de 0,683 (IC del 95%: 0,576-0,789), con una sensibilidad del 72,1% y 62,1% de especificidad (Figura 2). Además, la expresión de miR-601 de plasma y miR-760 en los adenomas avanzados significativamente aumentó en comparación con los CRC (
P = 0,0174
de miR-601,
P = 0,0214
de miR-760, Figura 1). Cuando se normaliza a miR-16, miR-601 de plasma y miR-760 se mantuvieron las reguladas en los adenomas avanzados en comparación con los controles normales (
P = 0,0198
de miR-601 y
P = 0,0184
. de miR-760, Figura S3)
(a, B, C) miR-601 producirá una AUC de 0,747 IC (95%: 0,666 a 0,828) con una sensibilidad del 69,2% y el 72,4% de especificidad (corte off value = -11,50), y miR-760 producen un AUC de CI 0,788 (95%: 0,714 hasta 0,862) con la sensibilidad% 80,0 y 72,4% de especificidad (valor de corte = -8,09) para discriminar CRC de los controles normales. El análisis combinado de miR-601 y miR-760 reveló una AUC de 0,792 (IC del 95%: 0,719-0,865), con una sensibilidad del 83,3% y el 69,1% de especificidad. (D, E, F) miR-601 produjo una AUC de 0,638 (IC del 95%: 0,530 a 0,747) con un 72,1% de sensibilidad y especificidad del 51,7% (valor de corte = -10,73), y miR-760 reveló una AUC de (IC del 95%: 0,576-0,789) 0,682 con una sensibilidad del 69,8% y 62,1% de especificidad (valor de corte = -7,63) para discriminar los adenomas avanzados de los controles. El análisis combinado de miR-601 y miR-760 no mejoró la eficacia del diagnóstico, y dio un AUC similar de 0,683 (IC del 95%: 0,576 a 0,789). con una sensibilidad del 72,1% y 62,1% de especificidad como miR-760
asociación con características clínicas
Para demostrar la tendencia de disminución de plasma de miR-601 y miR-760 expresión en la Convención de desarrollo, los casos de CCR fueron estratificados además por su estadificación TNM. Los pacientes se dividieron en 5 grupos, a partir de adenomas avanzados (la lesión menos avanzada) a la Etapa IV CRC (la lesión más avanzada). En comparación con los controles normales, los niveles de plasma de miR-601 y miR-760 se redujeron en todos los 5 grupos. Más importante aún, este estaba en línea con la tendencia de la baja regulación de los niveles de los 2 miRNAs siendo más baja en pacientes en estadio IV y la más alta en pacientes en estadio I. Tanto los niveles plasmáticos de miR-601 y miR-760 se redujeron durante la progresión del CRC de normal a través de adenoma avanzado de la CRC (Figura 3). No se encontró asociación significativa entre estos 2 miRNAs y el género, la edad, el estado ganglionar, la localización del tumor, el tamaño del tumor o la histología. (
P Hotel & gt; 0,05, datos no mostrados) parcelas
Box de los niveles plasmáticos de miR-601 (A) y miR-760 (B) en sujetos normales (n = 58), adenomas avanzados (n = 43) y pacientes con CRC (n = 90) con diferente estadio TNM (26 con I, 25 con II, 29 con III y 10 con IV). Los niveles de expresión de los miRNAs se normalizan a CEL-miR-39. Las líneas dentro de las casillas indican las medianas. Se utilizó la prueba de Mann-Whitney para determinar la significación estadística.
El antígeno carcinoembrionario (CEA) es un biomarcador utilizado para el seguimiento de recurrencia y CRC no es un biomarcador de diagnóstico válida desde el punto de vista clínico por su baja sensibilidad y especificidad. Sin embargo, no hay biomarcadores potenciales ideales para el cribado de CCR hasta la fecha y CEA todavía se sirve como un indicador preliminar del tumor en el examen de salud. Para evaluar la posible complementación de plasma miARN y CEA para la detección precoz del CRC, los datos de CEA se compararon con el miR-601 y miR-760 niveles en 51 etapas I y pacientes en estadio II. Los valores de corte de miR-601 y miR-760 de análisis de la curva ROC fueron -11,50 y -8,09, respectivamente. El valor de corte para el CEA fue de 5,0 ng /ml (ln 5 = 1,609). MiR-601 o miR-760 identificaron otros 26 o 29 casos perdidos por el CEA solo, mostrando un mayor poder en la diferenciación de los CRC en fase inicial. El uso combinado de miR-601 y miR-760 podría detectar 30 casos perdidos-CEA en absoluto. análisis de la curva ROC mostró que la combinación de miR-601 y miR-760 podría mejorar la sensibilidad diagnóstica de CEA del 29,4% al 80,4%, con una AUC de 0,805 (IC del 95%: 0,457 a 0,683). (Figura S4)
miR-601 y miR-760 CRC expresión en tejidos
a los efectos de la excavación de la relación interna de la expresión de los genes miARN entre el plasma y las correspondientes muestras de tejido tumoral, miR-601 y miR-760 se midieron en el tumor tejidos de otros 19 casos de CCR. No se encontraron diferencias significativas para ambos 2 miRNAs entre el cáncer y tejidos no cancerosos (
P = 0,32
de miR-601 y
P = 0,43 para
miR-760, Figura 4). La liberación de los miRNAs por las células tumorales en la circulación se ve afectada por múltiples parámetros puede explicar la inconsistencia. Además, se desconoce si las células tumorales podrían cambiar los miRNAs que liberan en la sangre por otros órganos o células. Se necesitaba más grande de validación de muestras para confirmar el miR-601 y miR-760 expresión en tejidos de CRC.
No se encontraron diferencias significativas acerca de las concentraciones de miR-760 (B) miR-601 (A) y entre los tejidos y CRC tejidos emparejados no cancerosos (NCT) (n = 19). Los niveles de expresión de los miRNAs se normalizaron a RNU6B. La línea representa el valor de la mediana. Se utilizó la prueba de Mann-Whitney para determinar la significación estadística.
miR-601 y miR-760 Estabilidad en plasma
Los niveles plasmáticos de miR-601 y miR-760 se encontró que eran ser estables después de ser sometido a tiempo de incubación prolongada a temperatura ambiente, y los valores de Ct no mostraron fluctuaciones significativas. Los resultados similares fueron encontrados en el experimento siguiente ciclos de congelación-descongelación (Figura 5). Por lo tanto, se consideró que eran bastante estables en muestras de plasma y apenas se degrada durante la configuración del protocolo y almacenamiento. Sobre la base de estos resultados, se concluye que el miR-601 y miR-760, básicamente cumplen los requisitos para la aplicación clínica.
Los niveles plasmáticos de miR-601 y miR-760 se mantuvieron estables después de incubación a temperatura ambiente prolongada del 1 al 24 horas (a) o al menos 4 ciclos de congelación-descongelación (B).
Discusión
MiRNAs juegan un papel importante en la carcinogénesis. La desregulación de la expresión de los genes miARN se produce en varios tipos de cáncer, especialmente el miR-143 y miR-145 en el CCR [23]. MiRNAs pueden contribuir a estrategias terapéuticas como biomarcadores de diagnóstico y factores de pronóstico en el cáncer [5], [6]. Sin embargo, los métodos de detección basados en la biopsia permanecen invasiva y requiere mucho tiempo para la detección y seguimiento de pacientes con cáncer. miRNAs derivado de un tumor descritos por primera vez por Mitchell et al. muestran claramente que los miRNAs estables están presentes en el plasma humano y suero, lo que abre un campo muy amplio para la aplicación clínica [9], [24], [25], [26], [27].
Publicado informes circulantes de miRNAs en el CCR son limitadas. Sin embargo, Ng et al. encontró que miR-17-3p y miR-92 fueron significativamente elevados en el suero de pacientes con CRC con una reducción significativa después de la cirugía. Además validación con un conjunto independiente de 180 muestras indicó que miR-92 niveles en plasma pueden distinguir entre colorrectal y cáncer gástrico, enfermedad inflamatoria intestinal o sujetos normales [13]. Y ya se ha informado de que el plasma de miR-29a y miR-92a fueron significativamente hasta reguladas en pacientes con CCR con buenos valores de diagnóstico para la detección de CCR [15].
miR-601 y miR-760 eran de menos de 2 miRNAs preocupación en tumores malignos. MiR-601, que se encuentra dentro de
DENND1A
gen que hasta reguladas en el cáncer de cuello uterino, podría afectar a las vías de señalización del factor kappa B nuclear en células de cáncer de pulmón humano A549 [28], [29]. MiR-760, que se encuentra dentro del intrón-1 de
BCAR3
gen, está regulada por los estrógenos y tiene una menor expresión en los tejidos de CRC [30]. No hay estudios funcionales adicionales tienen desde que fue llevado a cabo en las 2 miRNAs. La información sobre sus relaciones con la carcinogénesis sigue siendo limitada, pero nuestros nuevos hallazgos sugieren que el plasma de miR-601 y miR-760 pueden actuar como marcadores de diagnóstico precoz adecuadas para CRC.
En este estudio, nos encontramos en primer lugar, el miR-601 y miR-760 se redujeron reguladas en el CCR de plasma por miARN perfiles y les validado por QRT-PCR a partir de un total de 17 seleccionados miRNAs. Hemos demostrado que los niveles plasmáticos de miR-601 y miR-760 se redujeron en la neoplasia colorrectal avanzada en comparación con los controles sanos, y que el miR-760 fue más prominente que el miR-601 como biomarcador CRC. De acuerdo con nuestra experiencia y estudios previos, el 11% de concordancia entre la detección de chip y validación fue baja pero aceptable. análisis de la curva ROC mostró débil expresión de estos 2 miRNAs podría contribuir a la detección precoz del CCR con una sensibilidad del 69,2% y el 72,4% de especificidad para el miR-601 (AUC = 0,747) y la sensibilidad del 80,0% y el 72,4% de especificidad para el miR-760 (AUC = 0,788). La combinación de estos biomarcadores complementa CEA en la detección de CCR en estadios iniciales (I y II) se llevó una AUC de 0,805 con una sensibilidad del 80,4% y el 65,5% de especificidad. Por otra parte, combinado miR-601 y miR-760 también podría discriminar adenomas avanzados de controles sanos que dan una AUC de 0,683 con una sensibilidad del 72,1% y 62,1% de especificidad. Más notablemente, los niveles tanto de miR-601 y miR-760 cayeron en estadios I y II CRC, que elevó fuertemente su valor potencial para la detección precoz del CCR. Aunque el valor diagnóstico de miR-601 y miR-760 podría caer lejos de ser óptimo, un panel de tres plasma miARN (miR-760, -29a y -92a) marcadores reveló una buena eficacia diagnóstica.
No hay consenso controles internos que son de importancia fundamental para la cuantificación exacta de los niveles de ARN con QRT-PCR se han establecido hasta la fecha. Se confirmó que fue existía una correlación lineal entre la cantidad de miARN sintéticos introducidos y los valores de Ct en QRT-PCR [31]. En este estudio, cel-miR-39 se añadió a cada muestra desnaturalizada durante los procedimientos de aislamiento de ARN para la normalización [32]. Además, también se utiliza el miR-16, un control interno sugerida por nuestro trabajo previo, para normalizar los datos de QRT-PCR y se obtuvieron resultados similares (Figura S3) [15]. Sin embargo, parecía que podemos tener una mejor AUC cuando la normalización con-miR-39 cel, por lo que se seleccionó cel-miR-39 para normalizar los datos QRT-PCR en este estudio (Figura S5).
Plasma Las muestras se pueden recoger de forma no invasiva y no son de duración limitada. Hemos establecido que miRNAs extraídos de una muestra de plasma circulante mínimo eran muy adecuados para los propósitos de cuantificación. En comparación con otras moléculas que contienen nucleótidos, tales como ADN y ARNm, miRNAs son más resistentes a la actividad de RNasa DNasa y, haciéndolos relativamente estable en la circulación. Hemos demostrado que el miR-601 y miR-760 se mantuvieron bastante estables en muestras de plasma y se sometieron a poca degradación después de incubación a temperatura ambiente prolongada o varios ciclos de congelación-descongelación.
Una limitación de este estudio ha sido que los conocimientos moleculares en el causa de la desregulación no se ha producido. los niveles de circulación miARN parecen reflejar la expresión tejido que ha sido demostrado en varios tipos de cáncer incluyendo el cáncer de próstata y cáncer de mama [9], [24]. Mientras que el miR-601 y miR-760 no se redujeron los niveles en los tejidos de CRC, que parecía no constan con la del plasma. Otra limitación de este estudio es que se encontraron valores similares, pero no complementarios de diagnóstico, entre estos dos miRNAs. Además de miR-601 no mejoró la diferencia de poder de miR-760 en discriminar la neoplasia colorrectal avanzado de los controles normales. Sin embargo, la identificación de plasma de miR-601 y miR-760 como biomarcadores debe ahora detectar con mayor precisión CRC en su etapa temprana. Más aún, la adición de miR-760 a otros dos miARN identificado previamente por nosotros revelamos un valor de diagnóstico mejorada significativa, lo que sugiere que un panel de marcadores plasmáticos de miARN puede mejorar la sensibilidad y especificidad de este ensayo para el cribado del CCR.
en conclusión, los niveles en plasma de miR-601 y miR-760 en el CCR y adenomas avanzados se redujo significativamente, lo que sugiere la posibilidad de que el plasma de miR-601 y miR-760 son nuevos biomarcadores para el diagnóstico clínico de la CRC, pero los mecanismos subyacentes de su disminución requerir una mayor investigación.
Apoyo a la Información
Figura S1.
plasma miR-29a y la expresión de miR-92a. Plasma miR-29a (A) y miR-92a (B) fueron significativamente hasta reguladas en los CRC en comparación con los controles normales (
P Hotel & lt; 0,0001,
P = 0,0005)
. Los adenomas se diferenciaron de forma simultánea de los controles normales (
P = 0,0015
,
P = 0.0003)
. La línea representa el valor de la mediana. Se utilizó la prueba de Mann-Whitney para determinar la significación estadística
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figura S2. análisis de la curva ROC
combinada de miR-29a, miR-92a y miR-760. Combinado análisis de la curva ROC de los 3 (miRNAs miR-29a, miR-92a y miR-760) produjo una AUC de 0,943 (IC del 95%: ,908-,979) con una sensibilidad del 83,3% y 93,1% de especificidad en la discriminación de CRC de los controles normales.
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Figura S3.
plasma miR-601 y miR-760 expresión normalizado por el miR-16. Tanto cel-miR-39 y miR-16 se podrían utilizar para la normalización. MiR-601 y miR-760 eran aún significativamente las reguladas en el CCR y adenomas avanzados en comparación con los controles normales cuando los datos de QRT-PCR se normalizó a miR-16. La línea representa el valor de la mediana. Se utilizó la prueba de Mann-Whitney para determinar la significación estadística
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figura S4.
sensibilidades de diagnóstico de miR-601 y miR-760 en comparación con el CEA para la etapa I y II CRC. Los valores de corte de miR-601 y miR-760 de análisis de la curva ROC fueron -11,50 y -8,09, respectivamente. El valor de corte para el CEA fue de 5,0 ng /ml (ln 5 = 1,609). (A, B) las clasificaciones de dos parámetros mostró que el 26 y 29 casos (fase I y II) perdidas por el CEA se suplementaria detectados por el miR-601 y miR-760, respectivamente. (C) miR-601 y miR-760 eran más potentes que la CEA en la diferenciación de la etapa I y II CRC de los controles sanos y el uso combinado de miR-601 y miR-760 podría detectado 30 casos perdidos-CEA en absoluto. (D) El uso combinado de los 3 marcadores produjo una AUC de 0,805 (IC del 95%: 0,457-0,683). Con una elevada sensibilidad del 86,3%
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Figura S5. análisis de la curva ROC de plasma
miR-601 y miR-760 normalizó a CEL-miR-39 o miR-16. (A, B, C) Normalizado para cel-miR-39, miR-601 de plasma producir una AUC de 0,713 (IC del 95%: 0,634-0,792) con 72,4% de sensibilidad y especificidad del 62,4% (valor de corte = -11,50) , y miR-760 producirá una AUC de 0,754 (IC del 95%: 0,682-0,826) con 72,4% de sensibilidad y especificidad del 72,2% (valor de corte = -8,08) para discriminar neoplasia avanzada colorrectal (CCR y adenomas avanzados) de los controles normales . El análisis combinado de miR-601 y miR-760 reveló una AUC de 0,824 (IC del 95%: 0,680 a 0824), con una sensibilidad del 74,4% y 70,0% de especificidad. (D, E, F) Normalizado de miR-16, miR-601 de plasma produjo una AUC de 0,668 (IC del 95%: desde 0,588 hasta 0,748) con un 74,1% de sensibilidad y especificidad del 53,4% (valor de corte = -7,63), y miR-760 reveló una AUC de 0,724 (IC del 95%: 0,651 hasta 0,798) con una sensibilidad del 87,9% y el 48,9% de especificidad (valor de corte = -4,81) para discriminar la neoplasia colorrectal avanzado de los controles normales. El análisis combinado de miR-601 y miR-760 reveló una AUC de 0,732 (IC del 95%: 0,661 hasta 0,803), con una sensibilidad del 43,6% y 94,8% de especificidad
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Tabla S1.
La información del paciente para miARN perfiles.
doi: 10.1371 /journal.pone.0044398.s006 gratis (DOCX)
Tabla S2.
La información del paciente para su validación a gran escala.
doi: 10.1371 /journal.pone.0044398.s007 gratis (DOC) sobre Table S3. Empresas El características patológicas de los adenomas avanzados.
doi: 10.1371 /journal.pone.0044398.s008 gratis (DOCX) sobre Table S4.
La información del paciente para la validación de los tejidos CRC pareadas.
doi: 10.1371 /journal.pone.0044398.s009 gratis (DOCX) sobre Table S5.
miRNAs desregulado en el plasma CRC con el FC & gt; 2.
doi: 10.1371 /journal.pone.0044398.s010 gratis (DOCX)