Extracto
Antecedentes
La mayoría (70%) de cáncer de ovario epitelial (COE) se diagnostican tarde. Se necesitan biomarcadores no invasivos que facilitan la detección de la enfermedad y predecir el resultado. Los microARN (miRNA) representan una nueva clase de biomarcadores. Este estudio fue identificar y validar los miRNAs plasma como biomarcadores en EOC.
Metodología /Principales conclusiones
Se evaluaron muestras de plasma de 360 pacientes EOC y 200 controles sanos de dos instituciones. Todas las muestras se agruparon en selección, formación y validación conjuntos. Se realizaron búsquedas en los miRNAs circulantes en plasma por la matriz de baja densidad TaqMan en el conjunto de cribado y marcadores identificados miARN /validados por reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real en el conjunto de entrenamiento. Los análisis de regresión característica de funcionamiento del receptor y logístico establecido el grupo miARN de diagnóstico, que se confirma en los conjuntos de validación. Encontramos más alta de plasma de miR-205 y una menor expresión let-7f en los casos que en los controles. MiR-205 y let-7F juntos proporcionado alta precisión diagnóstica para la EOC, especialmente en pacientes con enfermedad en estadio I. La combinación de estos dos miRNAs y carbohidratos antígeno-125 (CA-125) mejora aún más la exactitud de la detección. expresión miR-483-5p fue elevado en las etapas III y IV en comparación con en las etapas I y II, que era consistente con su patrón de expresión en los tejidos tumorales. Además, los niveles más bajos de let-7F son predictivos de mal pronóstico en pacientes con EOC.
Conclusiones /Importancia
Nuestros hallazgos indican que el plasma de miR-205 y dejar-7F son biomarcadores para la detección del cáncer de ovario que complementan CA-125; let-7f puede ser predictivo de pronóstico del cáncer de ovario
Visto:. Zheng H, Zhang L, Zhao Y, Yang D, F canción, Wen Y, et al. (2013) plasma miRNAs como biomarcadores de diagnóstico y pronóstico para el cáncer ovárico. PLoS ONE 8 (11): e77853. doi: 10.1371 /journal.pone.0077853
Editor: Jörg D. Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Alemania |
Recibido: 21 de junio de 2013; Aceptado: 2 Septiembre 2013; Publicado: 1 Noviembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Zheng et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (subvenciones 81.072.363), el programa de Changjiang eruditos y Equipo de investigación innovadora de la Universidad en China (Grant IRT1076), el Proyecto Nacional de Ciencia y Tecnológica clave (Grant 2011ZX09307-001-04) y la Fundación del Comité de Ciencia y Tecnología de Tianjin (Grant 09ZCZDSF04700). El banco de tejidos es apoyado conjuntamente por el Centro de Tianjin y la Fundación Nacional para la Investigación del Cáncer de EE. D. Y. Es Miembro Odyssey en el MD Anderson Cancer Center, y apoyado por el Diane Denson Tobola Fellowship en Investigación de Cáncer de ovario El compañerismo y Harold C. y Mary L. Fondo de Dotación diaria. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de ovario es la quinta causa principal de muerte por cáncer en mujeres en todo el mundo, y el cáncer de ovario epitelial (EOC) es la neoplasia ginecológica más letal [1]. Debido EOC suele ser asintomática y pruebas de detección pocos están disponibles, casi el 70% de las mujeres presentan con estadio avanzado (estadio III o IV) la enfermedad, con tasas de supervivencia a 5 años de menos del 30% [2]. Por el contrario, los pacientes que son diagnosticados con enfermedad en estadio I tienen una tasa de supervivencia a 5 años de hasta el 90%, y los pacientes con enfermedad en estadio II tienen una tasa de supervivencia a 5 años de hasta el 70% [3]. Por lo tanto, la detección temprana de EOC puede mejorar en gran medida los resultados clínicos. Se necesitan biomarcadores sensibles, no invasivos que pueden facilitar la detección y estadificación de la enfermedad y predecir el resultado terapéutico para mejorar las tasas de supervivencia y determinar tratamientos óptimos.
antígeno carbohidrato-125 (CA-125) es el biomarcador más utilizado para la detección del cáncer de ovario [4], pero sólo se eleva en aproximadamente 50% de los EOC estadio I y 70% -90% de los casos avanzados [5]. Por lo tanto, hay una necesidad crítica de nuevos biomarcadores que son más sensibles y específicos para la detección de EOC cuando se utiliza solo o en combinación con CA-125. Recientemente, los microARN (miARN), una familia de pequeños ARN regulador, surgió como posibles marcadores plasmáticos de enfermedades humanas, incluyendo el cáncer, debido a su relativa estabilidad en la circulación [6].
MiRNAs son pequeñas, no que codifican proteínas de ARN que el post-transcripcional regulan la expresión génica mediante la supresión de los ARNm diana específicas [7], [8]. miRNAs circulantes específicos se han asociado con diferentes tipos de tumores, incluyendo cáncer de pulmón [9], [10], cáncer de colon [11], [12], cáncer de próstata [13], cáncer de ovario [14], [15], y de páncreas cáncer [16], [17]. Taylor
et al.
[14] compararon los perfiles de miARN de exosomas derivados del tumor que habían sido aisladas a partir del suero de pacientes con cáncer de ovario con los de los tejidos tumorales emparejados de los mismos pacientes. Sin embargo, estos estudios se limitaron al tener tamaños de muestra pequeños y evaluar algunos factores clínicos. El propósito de este estudio fue identificar y validar los miRNAs que circula en el plasma humano para su uso como biomarcadores de diagnóstico y pronóstico en el cáncer de ovario. Hemos tratado de comparar estos miRNAs plasma identifid con CA-125, especialmente para aumentar la sensibilidad de detección de EOC en pacientes con niveles normales de CA-125 en suero.
Materiales y Métodos
Diseño y población del estudio
Hemos diseñado un multi-etapa, estudio de casos y controles anidados retrospectivo para determinar si los perfiles de miARN sérica puede utilizarse para predecir el desarrollo de EOC. Todas las muestras se agruparon en selección, formación y conjuntos de validación (Fig. 1). Un total de 560 muestras de plasma (360 casos y 200 controles) se obtuvieron de la Universidad Médica de Tianjin Instituto del Cáncer y el Hospital (TCIH) y el Centro de Cáncer de la Universidad de Medicina de Nanjing entre julio de 2007 y junio de 2010. Los casos y los controles fueron bien adaptado para la edad entre los conjuntos de entrenamiento y validación. Todos los pacientes habían sido EOC histopatología diagnosticado con cáncer de ovario primario. Todos los pacientes reclutados para este estudio no habían recibido quimioterapia o radioterapia antes de la extrae la sangre. Y todas las muestras de sangre se obtuvieron antes de la cirugía. La Federación Internacional de Ginecología y Obstetricia sistema de estadificación (FIGO) se usa para clasificar los casos. Todos los pacientes y controles fueron no relacionadas genéticamente étnicos mujeres chinas Han, que eran residentes permanentes de la zona urbana de Tianjin y Nanjing. Se excluyeron los controles con sistemas cardiovascular, respiratorio, digestivo, urinario, reproductivo y enfermedades endocrinas
Nos separaron las muestras en tres conjuntos:. detección, entrenamiento y validación. El conjunto de validación incluía dos fases para validar el mejor panel.
Los protocolos de estudio fueron aprobados por los comités de evaluación de Tianjin y Nanjing Center. Se obtuvo el consentimiento informado, y todos los participantes fueron entrevistados personalmente por entrevistadores entrenados usando una pre-prueba cuestionario para obtener información sobre los datos demográficos, historia menstrual y reproductiva, estilo de vida, la exposición del medio ambiente, y la historia familiar de cáncer. Después de la entrevista, se recogió una muestra de sangre venosa de 5 ml. Entre estos casos, las muestras de tejido de tumor de ovario 44 coincidentes se obtuvieron del centro de Tianjin para este estudio. EOC muestras de tejido tumoral y el tejido de ARN se obtuvieron de los tejidos Facility Banco de la TCIH, que recoge todos los tejidos de tumores sólidos de pacientes quirúrgicos cuando sea posible.
CA-125 niveles de las muestras de plasma fueron adquiridas de los registros médicos electrónicos de los dos centros. Se adquirieron datos de seguimiento de los pacientes, y la duración de la supervivencia se calculó a partir de la fecha del diagnóstico hasta la fecha de la muerte o el último seguimiento en marzo de 2012.
selección definidos
Para detectar generalizables firmas de miARN, se agruparon las muestras de suero de 10 casos en etapa temprana (etapa I), 10 casos en etapa tardía (etapa IIIc-IV), y 10 controles sanos, respectivamente, y se analizaron estas tres muestras de la piscina usando una matriz de baja densidad TaqMan (TLDA ajustado 2.0, Applied Biosystems) de selección de chip en la fase de descubrimiento. La versión 2.0 TLDA (v14 humana Sanger miRBase) incluyó 667 miRNAs humanos. los datos de microarrays se han depositado en el Centro Nacional de Información de Biotecnología de la expresión génica (NCBI) Omnibus (NCBIGEO GSE50472).
Conjunto de Entrenamiento
Los miRNAs identificados en la selección, previsto se validaron utilizando transcription- inversa cuantitativa reacción en cadena de la polimerasa (QRT-PCR) en muestras de plasma individuales de 76 pacientes EOC y 30 controles normales.
conjunto de validación
El conjunto de validación que comprende un proceso de dos fases. asociaciones prometedores del conjunto de selección y formación fueron evaluados en la fase de validación puse, que comprende 134 casos y 70 controles de Tianjin Centro. Se realizó entonces un análisis de funcionamiento del receptor de evaluación de riesgos característica basada en la curva (ROC) para determinar el efecto de discriminación de miRNAs plasma candidato. El conjunto de validación de fase II incluyó muestras de 77 casos y 50 controles EOC normales eran de Tianjin Centro y 73 casos de EOC y 50 controles normales eran de Nanjing Center.
Aislamiento de ARN
La sangre se recogió en tubos de EDTA (BD Biosciences) y se procesa para aislar el plasma. La sangre se centrifugó a 1200 g a temperatura ambiente durante 10 minutos, y el plasma sobrenadante se transfirió a un tubo fresco y se almacena a -80 ° C.
RNA fue aislado de las muestras de plasma de donantes sanos y pacientes con cáncer de ovario . En resumen, 250 l de plasma se descongeló en hielo y se centrifugaron a 14.000 g a 4 ° C durante 10 minutos para eliminar los linfocitos. A continuación, lisaron 200 l de sobrenadante con una cantidad igual de reactivo de lisis QIAzol (Qiagen, Shanghai, China). Para las mezclas de plasma utilizados para la detección de biomarcadores candidatos cáncer de ovario humano, hemos creado la muestra de la piscina mediante la combinación de 110 l de cada una de las 10 muestras. La piscina se mezcló por inversión y se centrifugó a 14.000 g durante 10 min; 1 ml de sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo para aislamiento de ARN. Para la normalización, 5 l de 25 fmol sintética
Caenorhabditis elegans
miARN cel-miR-39 se añadieron a cada muestra desnaturalizada. RNA fue aislado utilizando Small miRNeasy Mini (Qiagen) siguiendo el protocolo del fabricante excepto que el ARN se eluyó en 30 l de agua libre de nucleasa previamente calentado. Para aislar el ARN total a partir de tejidos de tumor de ovario, las muestras congeladas se homogeneizaron primero en el reactivo Trizol (Invitrogen, San Diego, CA) usando un homogeneizador Omni-Mixer (Omni International, Kennesaw, GA). El ARN total fue aislado utilizando el método estándar de TRIZOL (Invitrogen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La calidad de ARN total se verificó con un Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies).
Mirna perfiles
miARN expresión de la muestra de la piscina fue perfilado utilizando TLDA. En resumen, el ARN se transcribe de forma inversa utilizando el kit de transcripción inversa TaqMan miARN, y los ensayos TaqMan miARN multiplex RT, piscina humano Set. Una cantidad de 9,16 l de solución de ARN en plasma fue transcrito en 15 l de mezcla de RT. Los tubos se incubaron a 16 ° C durante 30 minutos, seguido de 42 ° C durante 30 minutos y 85 ° C durante 5 minutos. El kit de mezcla maestra TaqMan PreAmp (Applied Biosystems) está destinado a aumentar la cantidad de cDNA disponibles para el análisis antes de utilizar el TLDA. La mezcla de reacción de 25 l consistía en 2,5 l de cDNA diluido combinados con 12,5 l de TaqMan PreAmp Master Mix, 2,5 l de cebadores Megaplex preamplificador, y 7,5 l de agua libre de nucleasa. La etapa de pre-amplificación se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante. El producto se diluyó mediante la adición de 75 l de agua libre de nucleasa, y 9 l de la mezcla diluida se combinó con 450 l de PCR TaqMan Universal Master Mix y 441 l de agua libre de nucleasa. Después de cargar 100 l de cada mezcla de la piscina múltiplex, la matriz (TaqMan microARN humano matriz v2.0 Set) se centrifugó y se sella. La amplificación se realizó en un Applied Biosystems 7900 HT ciclador térmico (Applied Biosystems) utilizando las condiciones del ciclo recomendadas por el fabricante. Los datos fueron analizados mediante el software RQ Manager versión 1.2 y sistema de detección de secuencia 7900 2.4 (Applied Biosystems).
Mirna Cuantificación por tiempo real QRT-PCR
Para determinar los niveles de miARN en muestras de plasma, se utilizado el sistema ABI MIRT-PCR, con las siguientes condiciones: 2,5 l de ARN pequeños enriquecidos a partir de muestras de plasma o 10 ng de ARN total a partir de muestras de tejido fueron a transcripción inversa utilizando el kit de transcripción inversa TaqMan miRNA (Applied Biosystems) en 7,5 l de reacción amortiguar con los cebadores específicos de la diana. Los tubos se incubaron a 16 ° C durante 30 minutos, seguido de 42 ° C durante 30 minutos y 85 ° C durante 5 minutos. Después de cebado, una dilución 1:20 se utilizó como molde para la etapa de PCR usando TaqMan 2 × PCR Universal mezcla maestra (Applied Biosystems) en un ABI Prism 7900. Se midió pocillos por triplicado utilizando un volumen final de reacción de 15 l y la siguiente condiciones de ciclo: 10 minutos a 95 ° C, seguido por 50 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos y 60 ° C durante 1 minuto. Los 7900 Sequence sistema de detección por defecto de software 2.4 se utilizaron para calcular el cambio relativo en la expresión por la 2
-ΔΔCt método con una confianza del 95%.
Análisis estadístico
Los niveles relativos de miARN se cuantificaron utilizando el método 2
-ΔΔCt, y los datos se analizaron como el registro
10 de la cantidad relativa de los genes miARN objetivo. La significación estadística se determinó usando el Wilcoxon o
t-test
entre pacientes y controles. Las curvas ROC se generaron para evaluar la precisión diagnóstica de cada candidato miARN, y la sensibilidad y la especificidad del punto de corte óptimo se definieron como aquellos valores que maximizan el área bajo la curva ROC (AUC). Un modelo de regresión logística paso a paso se utilizó para seleccionar los marcadores de diagnóstico miARN sobre la base del conjunto de datos de entrenamiento. La correlación entre la supervivencia (supervivencia global [OS] y la supervivencia libre de progresión [SSP]) y miRNAs plasma se analizó mediante el método de Kaplan-Meier y log-rank test. Se utilizó un análisis de regresión de riesgos proporcionales de Cox para determinar si el plasma miARN fue un factor pronóstico independiente de EOC.
Se utilizaron los paquetes de software estadístico SAS versión 9.0 (SAS Institute, Cary, NC) y MedCalc (Mariakerke, Bélgica ). Las gráficas se generaron con GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA). Todas las pruebas estadísticas fueron de dos caras, y un
P
valor de. & Lt; 0,05 fue considerado significativo
Resultados
Características de los pacientes
Se recogieron 560 Las muestras de plasma (360 casos y 200 controles) y los datos clínicos y demográficos asociados para este estudio; los casos incluyeron 179 tumores serosos (49,7%), los tumores 86 endometrioide (23,9%), 33 tumores mucinosos (9,2%), 15 tumores de células claras (4,2%), y 47 adenocarcinomas, no especificado (NOS) (13,0%) . características de los participantes se presentan en la Tabla 1 y en la Tabla S1. Las distribuciones de la mayoría de los factores de riesgo fueron generalmente similares entre los pacientes y los controles (Tabla S1). En los pacientes, no hubo diferencia significativa en la distribución de los estadios de FIGO, el grado histológico, o los niveles de CA-125 entre los grupos de entrenamiento y validación (Tabla 1).
Mirna Screening
Uso de la viruta TLDA, que exhibió 667 miRNAs humanos para encontrar los diferentes significativamente los niveles de expresión de los genes miARN entre los casos y controles. A la pantalla de manera eficiente múltiples biomarcadores miARN candidatos, se generó por primera vez tres piscinas de alícuotas de plasma que habían sido derivadas de pacientes con EOC temprana y última etapa y controles sanos. En comparación con el grupo control, hubo 43 y 50 miRNAs que son expresados diferencialmente en el principio de su carrera y el caso de la última etapa de la piscina, respectivamente. Entre estos miRNAs significativos, hubo 30 miRNAs cruzados. Treinta miRNAs plasma expresados diferencialmente se identificaron entre los pacientes EOC y controles sanos (Fig. 2A y en la Tabla S2).
cribado (A) Un TLDA reveló cambios significativos miARN 30 de plasma entre los casos y controles. (B) En el conjunto de entrenamiento, hemos detectado 30 miRNAs significativas usando QRT-PCR y se encontró que 11 candidatos miRNAs fueron expresados diferencialmente por el volcán parcela. El -log
10 de
Los valores P
(eje y) se traza contra el registro
2 veces el cambio de entre los casos y controles (eje x). Cada símbolo es un código de color de acuerdo con la expresión media de la sonda a través de los dos grupos. Las líneas de puntos delinean los puntos de corte de forma significativa downregulated (izquierda) o upregulated miRNAs (derecha) en los casos. Un mapa de calor de los 11 miRNAs significativos se muestra a la derecha. (C, D) En fase de validación que, solamente el miR-205 (C, izquierda) y dejar-7F (D, izquierda) tenían niveles diferentes. Un análisis ROC indicó que las AUC de miR-205 y let-7F para diferenciar los casos y los controles eran 0,609 (IC del 95%: 0,538 a 0,677) y 0,780 (IC del 95%: 0,717-0,835)., Respectivamente
Niveles de plasma miRNAs de pacientes frente a los controles en el conjunto de entrenamiento
en el conjunto de entrenamiento, se utilizó QRT-PCR para detectar los mencionados 30 miRNAs significativos en un estudio de casos y controles que incluyó 76 casos de EOC y 30 controles sanos. Nueve miRNAs (miR-205, miR-200a, miR-184, miR-34a *, miR-141, miR-483-5p, miR-193b *, let-7e *, * y miR-363) se detectaron en mayor se detectaron niveles en los casos que en los controles, mientras que miR-98 y let-7f en niveles inferiores (ilustrados por un volcán parcela y mapa de calor, Fig. 2B).
los niveles de plasma miRNAs de pacientes frente a los controles en el fase de validación I Establecer
en la fase de validación puse, los perfiles de expresión de miRNAs 11 candidatos se evaluó utilizando el método de QRT-PCR en 134 casos y 70 controles EOC. MiR-205 y let-7f tenían diferentes niveles de expresión entre los casos y controles. En comparación con los controles, plasma miR-205 niveles fueron significativamente mayores (
P = 0,012)
niveles (Fig. 2C, panel izquierdo) y dejar-7F fueron significativamente más bajos (
P = 1,97
× 10
-10) en pacientes EOC (Fig. 2D, panel izquierdo).
se utilizó un análisis ROC para evaluar la sensibilidad y especificidad de los marcadores de plasma miARN dos candidatos. El AUC de miR-205 y let-7f eran 0,609 (IC del 95%, 0,538-0,677; sensibilidad = 30,1%, especificidad = 94,2%) (Figura 2C, el panel de la derecha.) Y 0,780 (IC del 95%, 0,717-0,835; sensibilidad = 66,9%, especificidad = 84,2%), respectivamente (Fig. 2D, panel derecho).
Combinación de miR-205 y Let-7F para EOC Diagnóstico
Un modelo de regresión logística por pasos se utilizó para estimar la potencia conjunta de miR-205 y let-7f en la predicción del riesgo de EOC en la fase de validación puse. MiR-205 y let-7F son eficaces para discriminar los casos de los controles [Fig. S1A; logit (P = EOC) = -0,610 a 3,075 × let-7f + 1,532 × miR-205 se utilizó para construir la curva ROC]. El ABC del panel miARN (let-7F y miR-205) fue de 0,831 (IC del 95%, 0,772 a 0,880; sensibilidad = 62,4%, especificidad = 92,9%) (Fig. 3A), que fue significativamente mayor que las AUC de miR-205 (
P Hotel & lt; 0,001). y dejar-7F (
P
= 0,008) solo (Fig. S1B)
Hemos establecido el miR-205 y let-7f del panel en fase de validación I y confirmada en muestras independientes en la fase II. En la fase I, (A) el AUC fue 0,831 (IC del 95%, 0,772 a 0,880; sensibilidad = 62,4%, especificidad = 92,9%) de los casos; (B) 0,895 (IC del 95%, 0,822 a 0,967; sensibilidad = 77,8%, especificidad = 90,0%) para los casos en etapa temprana frente a los controles; y (C) 0,814 (IC del 95%, 0,700-0,929; sensibilidad = 68,4%, especificidad = 92,9%) de baja CA-125 (& lt; 35 U /ml) de los casos frente a los controles. En la fase II, (D) el AUC fue de 0,813 (IC del 95%, 0,759-0,860; sensibilidad = 71,3%, especificidad = 82,0%) de los casos frente a los controles; (E) (IC del 95%, desde 0,699 hasta 0,853; sensibilidad = 70,0%, especificidad = 82,0%) 0,783 para los casos en etapa temprana frente a los controles; y (F) 0,726 (IC del 95%, 0,634-0,805; sensibilidad = 64,3%, especificidad = 72,0%) de baja CA-125 (& lt; 35 U /ml). casos frente a los controles
el panel de dos miARN también una distinción entre los casos en etapa temprana (etapa I) y controles, con una AUC de 0,895 (IC del 95%, ,822-,967; sensibilidad = 77,8%, especificidad = 90,0%, la figura 3B.). En la fase de validación puse, sobre 89,3% de los pacientes tenía EOC CA-125 de elevación, los otros pacientes no para ser detectados por CA-125. La precisión diagnóstica del panel miARN se evaluó de acuerdo con el nivel de CA-125. En el bajo CA-125 (& lt; 35 U /ml) grupo (n = 14, 10,7% de todos los casos, la Tabla 1) en la fase de validación puse, el AUC del panel miARN fue 0,814 (IC del 95%, 0.700 a 0,929;.. la sensibilidad = 68,4%, especificidad = 92,9%, la figura 3C)
Validación del Panel de miARN en la Validación Fase II Conjunto
el panel de dos miARN se evaluó adicionalmente en el II fase de validación conjunto de 250 muestras de plasma (150 pacientes EOC y 100 controles sanos). El ABC del panel miARN fue 0,813 (IC del 95%, 0,759-0,860; sensibilidad = 71,3%, especificidad = 82,0%, la figura 3D.) En toda la fase de validación de muestras II. El AUC fue de 0,783 (IC del 95%, 0,699 a 0,853;. Sensibilidad = 70,0%, especificidad = 82,0%, la figura 3E) en los casos en etapa temprana (etapa I) y controles, respectivamente. La precisión diagnóstica del panel miARN se evaluó a continuación, de acuerdo con el nivel de CA-125. En el bajo CA-125 (& lt; 35 U /ml) grupo (n = 14, 9,3% de los casos, la Tabla 1) de la fase de validación II, el AUC del panel miARN fue 0,726 (IC del 95%, 0,634 a 0,805; sensibilidad = 64,3%, especificidad = 72,0%, Fig. 3F).
niveles de plasma miARN y Supervivencia
a fin de determinar si el plasma let-7f y los niveles de miR-205 son predictivos del pronóstico, se realizó un análisis de la SG y SLP en todos los pacientes a partir de los conjuntos de entrenamiento y validación. Un análisis de Kaplan-Meier curvas de supervivencia no reveló una asociación entre let-7f o los niveles de miR-205 y OS (Fig. S2). Sin embargo, el plasma menor expresión let-7f se correlacionó significativamente con un mal SLP en todos los pacientes (
P = 0,006
, log-rank test) (Fig. 4A), especialmente en la etapa III y IV casos (
P = 0,002
, prueba de log-rank). Un análisis de regresión de Cox multivariado demostró que el plasma let-7f era un indicador pronóstico significativo de EOC de la SLP (HR = 2,07; IC del 95% = 1,27 a 3,37) (Tabla 2).
(A) Un análisis de la SLP para todos los pacientes (n = 360) revelaron que la reducción de los niveles plasmáticos de let-7f se asociaron con un mal pronóstico (
P
= 0,006). las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier etapa específica revelaron que los valores de
P
de la prueba de log-rank fueron 0,576 y 0,002 para las etapas I y II (B) y III y IV (C), respectivamente. Los datos de supervivencia se compararon mediante la prueba de log-rank, y dejar-7F niveles de expresión en los pacientes fueron definidas como de alto o bajo en relación con la mediana. NP, no progresión; P, la progresión.
Mirna Expresión en EOC Tejido
Se determinó si la expresión de miRNAs en el plasma en diferentes etapas se correlacionó con la que en la adecuación de los tejidos tumorales. Examinamos 11 miRNAs significativas (miR-205, miR-200a, miR-184, miR-34a *, miR-141, miR-483-5p, miR-193b *, let-7e *, miR-363 *, miR 98 y let-7f) del conjunto de entrenamiento en muestras de tejido tumoral emparejados. El análisis comparativo reveló que el tumor expresión de miR-483-5p, pero no let-7F, fue fuertemente correlacionada con la expresión de plasma (r = 0,541,
P = 1,52
× 10
-4) (Fig. S3A). También se encontró que el miR-483-5p se expresó en niveles más altos en estadio III y IV tejidos tumorales que en la etapa I y II (
P = 0,048
) (Fig. S3 B), en consonancia con los niveles en plasma (
P = 0,043
) (Fig. S3C). MIR-483-5p se expresó en niveles más altos en el plasma en estadios avanzados (estadios III y IV) que en las primeras etapas (estadios I y II) (Fig. S3C). No hay otros niveles de miRNA en plasma se correlacionan con los niveles en los tejidos tumorales.
Discusión
cuentas de EOC para neoplasias más de ovario. Desde el descubrimiento de CA-125 en 1981, numerosos estudios han documentado su papel como herramienta de diagnóstico y recurrencia en pacientes EOC [18], [19]. Aproximadamente el 80% de los pacientes con EOC tiene la elevación de CA-125. CA-125 es útil para el seguimiento de la enfermedad, la evaluación de la respuesta al tratamiento, y la detección de recidiva [20], [21]. Sin embargo, se realiza mal en la detección de las primeras etapas del desarrollo del cáncer de ovario [22]. Se necesitan nuevos marcadores de diagnóstico de cáncer de ovario para el cribado. En la actualidad, varios miRNAs circulantes se han identificado para su uso en diferentes tipos de cáncer [13], [23], [24], [25]. En este estudio, se encontró que let-7F y miR-205 son muy prometedores como biomarcadores de diagnóstico y progresivos en la EOC.
El uso de un proceso de validación rigurosa y un modelo de regresión logística, hemos demostrado que el let-7f- panel de miR-205 miARN tenía una alta precisión en el diagnóstico de EOC, especialmente en pacientes con enfermedad en estadio I. Es importante destacar que este panel se puede utilizar en baja-CA-125 para identificar los pacientes EOC en etapa temprana.
fue uno de los primeros mamíferos miRNAs que se identificó el /miR-98 la familia let-7 [26]. Let-7 se observó inicialmente en el nematodo
C. elegans
[27], y se han encontrado los niveles de expresión de muchos miembros de let-7-familia que se reduzca en varios tipos de cáncer [28], [29], [30], [31], [32]. Let-7f está implicada en procesos fisiológicos y patológicos, incluyendo la carcinogénesis [33]. Estudios previos han demostrado que actúa como un supresor de tumor en muchos tipos de cáncer, incluyendo el carcinoma renal de células [34], cáncer de tiroides papilar [35], y el cáncer gástrico [36]. La familia de los genes miARN let-7 se secreta selectivamente en el medio extracelular a través de los exosomas, que puede ser importante en la vigilancia del cáncer. Una disminución de let-7 en el medio extracelular, tal como en el plasma, puede crear así un entorno cáncer- y la metástasis de usar. En nuestro estudio, encontramos que el plasma let-7f se puede utilizar como un sistema de detección y EOC biomarcador pronóstico. En comparación con los controles sanos, pacientes con cáncer de ovario tienen menores niveles de plasma de let-7f. En pacientes EOC, estos niveles más bajos eran también predictivo de mal pronóstico.
miR-205 es un miARN altamente conservada entre diferentes especies, incluyendo los seres humanos. La familia de miR-200 (miR-200a, miR-200b, 200c miR-miR-141 y miR-429) y miR-205 se downregulated con frecuencia en el cáncer avanzado [37]. Los estudios han demostrado que, al dirigirse los represores transcripcionales de E-cadherina, ZEB1 y ZEB2, la familia miR-200 está implicado en la transición epitelio-mesenquimal transición (EMT) y la invasión del tumor [38]. El aumento de expresión de miR-205 también se ha observado en el adenocarcinoma de endometrio [39], cabeza y cuello escamosas líneas celulares de carcinoma de células [40], carcinoma de pulmón de células escamosas [41], y el cáncer de ovario [37]. Por el contrario, la reducción de expresión de miR-205 se ha descrito en el melanoma [42] y el cáncer de esófago [43], el riñón [44], de la vejiga [45], [46], de mama [47], y de próstata [48] . MIR-205 puede funcionar como un gen oncogen o tumor supresor, dependiendo del contexto celular. En nuestro estudio, el plasma de miR-205 se expresó en niveles más altos en los pacientes EOC que en los controles sanos. Sin embargo, no hubo diferencias en la expresión de miR-205 entre los tejidos tumorales de EOC y tejidos sanos adyacentes.
La pérdida de let-7 en los resultados de cáncer en la embriogénesis inversa y desdiferenciación [49], y miR-205 ha sido identificado como un potente regulador de la EMT [50]. Hallazgos recientes han conectado let-7 con el mantenimiento de células madre y sugieren una conexión entre la EMT y la formación de células madre. La conversión de una célula epitelial a una célula mesenquimal juega un papel clave tanto en el desarrollo embrionario y la invasión del cáncer y la metástasis. Las células que sufren EMT pierden sus características morfológicas epiteliales, reorganizar su citoesqueleto, y adquieren un fenotipo móviles a través de la subida y baja regulación de varias moléculas, incluyendo proteínas de unión estrecha y adherentes y marcadores mesenquimales. En EMT cáncer de ovario, let-7F y miR-205 participar en el proceso de EMT mediante el control de sus genes diana [49]. Los niveles circulantes de let-7F y miR-205 puede ser un reflejo del proceso de EMT; Por lo tanto, es importante investigar su papel en la regulación del medio ambiente extracelular.
Muchos estudios han demostrado que circula miRNAs en muestras de sangre se originan a partir de tejidos tumorales [14], focos inflamatorios [51], el daño de las células endoteliales [52 ], y las células mononucleares de sangre periférica normales y las plaquetas [53]. En este estudio, se analizaron los tejidos de cáncer de ovario y encontró que la expresión de miR-483-5p se correlacionó con los niveles plasmáticos. Este resultado sugiere que los exosomas derivados del tumor pueden explicar una pequeña parte del origen de plasma miRNA. Además, el aumento de la expresión de miR-483-5p se encontró en EOC avanzado que a principios de EOC, tanto en el tejido tumoral y el plasma. Para nuestro conocimiento, este es el primer estudio para encontrar que el miR-483-5p puede estar relacionado con la progresión del cáncer de ovario. Recientemente, el suero de miR-483-5p fue identificado como un posible biomarcador para detectar el carcinoma hepatocelular [54].
En resumen, hemos identificado el plasma let-7F y miR-205 como potenciales biomarcadores para el diagnóstico del cáncer de ovario, especialmente para la detección precoz del COE. Let-7f también puede ser un marcador de pronóstico de cáncer de ovario. miRNAs circulantes se han encontrado para ser biomarcadores estables, específicos y sensibles. Sobre la base de nuestros datos, proponemos que miRNAs específicos que están asociados con exosomas circulante son marcadores tempranos de cáncer de ovario y puede ser utilizado para determinar el estadio, el pronóstico y la respuesta al tratamiento.
información de apoyo
figura S1.
el rendimiento diagnóstico de miRNAs. (A) Los miRNAs se construyeron utilizando un modelo de regresión logística. (B) Los resultados de un análisis ROC indicaron que el miR-205 y el panel de let-7f discrimina entre los casos y controles. Las AUC-ROC de miR-205, let-7, y el panel de miARN (miR-205 y let-7f) para diferenciar los casos y los controles fueron 0,780, 0,609, y 0,831, respectivamente. El panel tenía una AUC = (IC del 95%: 0,772-0,880) 0,831, el cual fue significativamente mejorada en comparación con los dos solos miRNAs (miR-205 [
P Hotel & lt; 0,001] y dejar-7f [
P = 0,008
])
doi: 10.1371 /journal.pone.0077853.s001 gratis (TIF)
figura S2.
SLP y la SG de los pacientes por let-7f o el nivel de miR-205. Kaplan-Meier de supervivencia reveló que la baja expresión let-7f se asoció con la SLP (
P = 0,006
, Fig. A) pero no con OS (
P = 0,589
, Fig. B) . No hubo diferencias entre los niveles de miR-205 y la SSP (
P = 0,969
, C) u OS (
P = 0,576
, D). Los datos de supervivencia se compararon mediante la prueba de log-rank, y dejar-7f o los niveles de expresión de miR-205 se definieron como alto o bajo en relación con la mediana. NP, no progresión;