Extracto
Antecedentes
Los microARN (miARN), endógena pequeña ARN no codificante, se detectan de manera estable en el plasma humano. El diagnóstico temprano de cáncer gástrico (GC) es muy importante para mejorar el efecto de la terapia y prolongar la supervivencia de los pacientes. El objetivo fue identificar si cuatro miRNAs (miR-223, miR-21, miR-218 y miR-25) estrechamente asociados con el proceso tumoral o metástasis de GC pueden servir como nuevos biomarcadores potenciales para la detección de GC.
Metodología
inicialmente se midieron los niveles plasmáticos de los cuatro miRNAs en 10 pacientes con cáncer gástrico y 10 sujetos control sanos por transcripción reversa cuantitativa reacción en cadena de la polimerasa (QRT-PCR), y luego compararon los resultados de miARN de plasma con las expresiones en los tejidos de cáncer de ocho pacientes GC. Por último, la presencia de miR-223, miR-21 y miR-218 en el plasma fue validado en 60 pacientes con cáncer gástrico y 60 sujetos control sanos, y se analizaron las áreas bajo las que operan (ROC) curvas características de estos miRNAs.
resultados
Se encontró que los niveles plasmáticos de miR-223 (
P Hotel & lt; 0,001) y miR-21 (
P Hotel & lt; 0,001) fueron significativamente mayores en pacientes con cáncer gástrico que en los controles sanos, mientras que el miR-218 (
P Hotel & lt; 0,001) fue significativamente menor. Los análisis de la República de China cedió los valores de AUC de 0,9089 para el miR-223, 0.7944 para miR-21 y 0,7432 para el miR-218, y el análisis ROC combinado reveló el valor AUC más alta de 0,9531 en la discriminación de pacientes con cáncer gástrico de los controles sanos. Por otra parte, los niveles plasmáticos de miR-223 (
P Hotel & lt; 0,001) y miR-21 (
P
= 0,003) fueron significativamente mayores en los pacientes con estadio I GC que en los controles sanos. Por otra parte, los niveles plasmáticos de miR-223 fueron significativamente mayores en los pacientes con GC
pylori
infección por Helicobacter (Hp) que los que no (
P = 0,014
), y significativamente más altos en los sujetos de control sanos con la infección por Hp, que los que no tienen (
P = 0,016
).
Conclusiones
plasma de miR-223, miR-21 y miR-218 son nuevos biomarcadores potenciales para la detección de GC .
Visto: Li B, Zhao ilo, Guo G, W Li, Zhu Ed, Luo X, et al. (2012) plasma microARN, miR-223, miR-21 y miR-218, como potenciales biomarcadores novedosos para la detección del cáncer gástrico. PLoS ONE 7 (7): e41629. doi: 10.1371 /journal.pone.0041629
Editor: Ajay Goel, Baylor University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: Diciembre 21, 2011; Aceptado: June 27, 2012; Publicado: July 30, 2012
Copyright: © Li et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por una beca de la Fundación de Ciencias Naturales de China (SNCF, N ° 81071412). Los donantes tenían papel en la recolección de datos y análisis, pero no papel en el diseño del estudio, la decisión de publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer gástrico es el cuarto cáncer más común en el mundo y la segunda causa principal de muerte por cáncer en ambos sexos en todo el mundo. Las tasas de mortalidad más altas se estiman en Asia Oriental [1]. La tasa de supervivencia a 5 años para el cáncer gástrico es inferior al 20% -25% en los EE.UU., Europa y China [2]. En la actualidad, la resección quirúrgica completa es el tratamiento más eficaz, que ofrece una excelente posibilidad de curación (90%) para los pacientes con cáncer gástrico precoz [3]. Para el cáncer gástrico avanzado, a pesar de la cirugía curativa, alrededor del 80% de los pacientes mueren dentro de un corto tiempo de recurrencia locorregional (87%) y /o metástasis a distancia (30%) [4]. Por lo tanto, la mejora en el diagnóstico precoz podría aumentar la probabilidad de curación en pacientes con cáncer gástrico precoz o prolongar la supervivencia de los pacientes con estadio temprano GC. Sin embargo, la mayoría de los GC en etapa temprana son difíciles de detectar [5]. Los marcadores séricos convencionales para GC, tales como antígeno carbohidrato 19-9 (CA 19-9) y el antígeno carcinoembrionario (CEA), falta la suficiente sensibilidad y especificidad para facilitar la detección temprana.
Los microARN (miRNA) son pequeñas, no -coding ARN que regulan la expresión génica posttranscriptionally. La expresión aberrante de miRNAs se ha correlacionado con varias enfermedades, entre ellas el cáncer [6]. Estudios previos han indicado que los perfiles de expresión de tejido miARN se pueden considerar como biomarcadores de diagnóstico en el cáncer [7] - [9]. Sin embargo, este método de diagnóstico está limitada en su eficacia como muestras de tejido no son convenientes para acceder y son invasivos de obtener. Un número cada vez mayor de los papeles están reportando que los miRNAs circulantes se detectan de forma estable en varios fluidos corporales, incluyendo suero y plasma [10], [11]. MiRNAs circulantes como nuevos biomarcadores estables sería uno de los medios más prometedores de diagnóstico, debido plasma y suero son de fácil acceso y no invasiva de obtener. Recientemente, varios de suero o plasma de biomarcadores miARN prometedores para la detección de GC se han identificado [12], [13].
Para explorar esa novela plasma firmas miARN pueden distinguir a los pacientes con GC (GC particularmente en etapa temprana) de ser saludables controles, se seleccionaron cuatro miRNAs (miR-223, miR-218, miR-25 y miR-21), que se había informado que están alteradas con frecuencia en el tejido GC y estrechamente correlacionado con la tumorigénesis o metástasis de GC [14] - [21] . Supusimos que los niveles plasmáticos de los tres miRNAs (miR-223, miR-218 y miR-25) fueron aberrante en pacientes con cáncer gástrico, así como los de miR-21, lo que sugiere que esta firma puede servir como un biomarcador para la detección de GC [12]. Sin embargo, no se han identificado los niveles plasmáticos de miR-21 en pacientes con cáncer gástrico en diferentes estadios TNM. En este estudio, se compararon los niveles plasmáticos de los cuatro miRNAs en pacientes con cáncer gástrico a controles sanos, y se evaluó la viabilidad de las cuatro miRNAs como nuevos biomarcadores no invasivos para la detección de GC.
Materiales y Métodos
pacientes y muestras
Todas las muestras se obtuvieron de individuos que consienten acuerdo con los protocolos aprobados por la Junta de Revisión Ética de la Tercera Universidad médica Militar. En total, 70 pacientes con GC antes de cualquier tratamiento y 70 sujetos control sanos desde el Hospital Sudoeste (Chongqing, China) fueron incluidos en nuestro estudio entre 2010 y 2011. Para los 70 pacientes GC, se analizó la histología de los tejidos GC, incluyendo 56 adenocarcinoma, 13 de adenocarcinoma mucinoso y 1 carcinoma de células en anillo de sello, y determinado las localizaciones tumorales, incluyendo 34 en el cuerpo gástrico, 24 en antro gástrico, 8 en cardias gástrico y 4 en otros (superior del estómago, el ángulo gástrico, muñón gástrico). Los pacientes GC se clasifican de acuerdo a los estadios TNM clínicos, incluyendo 12 en estadio I (edad media, 53 años [rango, 36-70 años]; 8 varones, 4 mujeres), 11 en estadio II (edad media, 61 años [rango, 36-77 años]; 7 varones, 4 mujeres), 36 en estadio III (mediana de edad, 55 años [rango, 30-71 años]; 26 varones, 10 mujeres) y 11 en estadio IV (edad media, 53 años [rango , 46-66 años]; 9 varones, 2 mujeres) .El estado de infección por Hp se probaron utilizando anticuerpos anti-HP kits de diagnóstico ELISA (S20010005), (BEIJING BEIER BIOINGENIERÍA CO, LTD), que muestra 43 pacientes con infección por Hp GC. y 27 sin. A los 70 sujetos de control sanos, se incluyeron 44 hombres y 26 mujeres, y la edad media fue de 51 años [rango, 26-75 años]. Los resultados de la prueba mostraron infección por Hp 31 sujetos control sanos con infección por Hp y 39 sin. (Tabla 1).
plasma libre de células fue aislado de todas las muestras de sangre dentro de 2 horas de la recogida usando un protocolo de dos pasos (1500 rpm durante 10 min, 12.000 rpm durante 2 min) para evitar la contaminación por ácidos nucleicos celulares. El plasma se transfirió a un tubo nuevo, dejando una altura fija de 0,5 cm plasma sobrenadante por encima del sedimento para evitar perturbar el sedimento [11]. Se almacenó a -80 ° C en 450 ml de alícuotas. Ocho pares de muestras de tejido se obtuvieron de los ocho pacientes GC con mayores niveles de plasma de miR-223 y miR-21, y menores niveles de plasma de miR-218 que los controles sanos después de la resección quirúrgica, y aproximadamente cortados a cuadrados de 1 mm y se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido.
la extracción de RNA
Un total de ARN fueron extraídos de 400 l de plasma utilizando el Kit de mirVana PARIS (Ambion) de acuerdo con el protocolo del fabricante, y se eluyó con 105 l de pre-calentado ( 95 ° solución C) de elución. Para permitir la normalización de los cambios de muestra de la muestra en la etapa de aislamiento de ARN, 10 l de 0,05 M
C sintética. Se añadió elegans
miR-39 (ARN sintético oligo-nucleótidos sintetizados por GenePharma) a cada muestra desnaturalizada después de combinar la muestra de plasma con desnaturalización Solution [11]. Para los tejidos congelados, el ARN total se extrajo usando el reactivo TRIzol (Invitrogen) según el protocolo del fabricante, y finalmente se resuspendió en 60 l de (95 ° C) de agua pre-calentada libre de nucleasa.
Quantitative inversa transcriptasa reacción en cadena de la polimerasa (QRT-PCR)
La reacción de transcripción inversa se llevó a cabo utilizando un Taqman MicroARN Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). cDNA fue sintetizado en 5 volúmenes l que contenía 1,67 l de extracto de ARN, 0.5μl de 10 × tampón de transcripción inversa, 0,05 l de dNTP 100 mM, 0.063 l de RNasa Inhibidor (20 T l
-1), 0,33 l de Mutiscribe la transcriptasa inversa (50 U l
-1), 0,5 l de cebador específico de gen y 1.887 l de agua libre de nucleasa. Las reacciones se incubaron a 16 ° C durante 30 min, seguido de 42 ° C durante 30 min, luego 85 ° C durante 5 min antes de ser mantenido a 4 ° C. El ADNc sintetizado se diluyó 2 veces con agua libre de armas nucleares. Cuantitativos reacciones de PCR se llevaron a cabo usando 2 l de solución de cDNA, 5 l de TaqMan 2 × Perfect Master Mix (Takara), 0,25 l de genes específicos de cebadores /sonda (TaqMan® microARN ensayos, Applied Biosystems. Tabla S1) y 2,75 l de agua libre de nucleasa en un volumen final de 10 l, y la ejecución en un Bio-Rad IQ5 (Bio-Rad Laboratories, Inc) termociclador. Las mezclas de reacción se incubaron a 95 ° C durante 2 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s y 60 ° C durante 30 s. El ciclo umbral (
C
t) Los valores se calcularon con el software de Bio-Rad iQ5 2.1 Optical System Standard Edition 2.1.94.0617.
Las concentraciones plasmáticas miARN se calcularon utilizando un estándar curva construida usando miRNAs sintéticos [22]. El miRNAs de referencia estándar se amplificaron para cada reacción. Sin embargo, la expresión de miRNAs de las muestras de tejido se normalizó el uso del 2
-ΔΔ
C
t método de la
C
t valores de los miRNAs de interés en relación con RNU6B.
La normalización de datos experimentales QRT-PCR a partir de plasma usando sintético C. elegans miR-39
C. elegans
miR-39, que carece de homología de secuencia con miRNAs humanos, fue seleccionado para normalizar los datos experimentales QRT-PCR. cantidades conocidas de
C sintética. elegans
miR-39 se diluyeron para producir
C
t valores dentro de la
C
rangos de los valores t de las curvas de calibración miARN. Nos empíricamente añadieron 10 l de 0,05 M
C sintética. elegans
miR-39 hasta 400 l de plasma después de combinar la muestra de plasma con solución desnaturalizante. El
C. elegans
miR-39 se amplificó, así como otros miRNAs. La siguiente fórmula se utiliza para ajustar la
C
t valores de miRNAs (miR-223, miR-21, miR-218 y miR-25) en todas las muestras de plasma: Normalized_
C
valor de t para el miARN en la muestra = Raw_
C
t valor - [(SpikeIn_ Average_
C
valor t de la muestra dada) - (Median_ SpikeIn_
C
t)] [11]. El normalized_
C
valor de t se utilizó para calcular la concentración de cada uno de los genes miARN.
Análisis estadístico
Se utilizó la prueba de Mann-Whitney para comparar las diferencias en las concentraciones plasmáticas de miARN y miARN las relaciones entre el grupo de cáncer y el grupo sano. Una de dos caras χ
2 se utilizó la prueba para comparar las diferencias de género, edad o estado de infección por Hp entre los pacientes con cáncer gástrico y los controles sanos. Se utilizó la prueba ANOVA para analizar la relación entre los niveles de miR-21, etapas, miR-218 y miR-223 TNM. Receptor de curvas características de funcionamiento (ROC) y el área bajo la curva ROC (AUC) se utilizaron para evaluar la viabilidad de usar los niveles plasmáticos de miRNAs como herramientas de diagnóstico para la detección de GC. El índice Youden se utilizó para seleccionar los valores óptimos de corte. Un
valor de P Red de menos de 0,05 fue considerado estadísticamente significativo. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software SPSS 13.0 y gráficos se generaron utilizando GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc, Caligornia).
Resultados
Caracteriza de Sujetos
Ciento cuarenta sujetos, incluyendo 70 pacientes con cáncer gástrico y 70 sujetos control sanos, fueron reclutados en este estudio. No se encontraron diferencias significativas en el género o la edad entre los pacientes con cáncer gástrico y los controles sanos (
P = 0,371
,
P = 0,398
, χ
2 de prueba, respectivamente). estado de infección por Hp fue significativamente diferente entre los pacientes con cáncer gástrico y los controles sanos (
P = 0,042
) (tabla 1).
Evaluación de la RT-PCR cuantitativa para la medición de los miRNAs en plasma
para definir el rango dinámico y la sensibilidad de los genes miARN cuantificación mediante PCR en tiempo real, los miRNAs un solo filamento sintético se diluyeron 10 veces en serie de concentraciones del 0,1 al 0,000001 fmol de miR-223, miR-218, miR 25, y miR-21 en la recomendación del Grupo de Referencia GenePharma miARN. La linealidad de la RT-PCR cuantitativa entre los valores logarítmicos de los miRNAs de entrada y el
C
valores de t se confirmó para cada miARN sintético, miR-223, miR-218, miR-25 y miR -21 (R
2 = 0,997, R
2 = 0,998, R
2 = 0,993 y R
2 = 0,999, respectivamente) (Figura 1).
Decenal doblar dilución en serie de miRNA sintético se utiliza para generar las curvas estándar. La linealidad fue confirmada dentro de estas concentraciones de miR-21, miR-223, miR-218 y miR-25 de 0,1 a 0,000001 fmol. (
miR-21
: y = 14,77 + -3.337x (R
2 = 0,999);
miR-223
: y = -3.121x + 17.37 (R
2 = 0,997);
miR-218
: y = -3.071x + 17.79 (R
2 = 0,998);
miR-25
: y = -3.114x + 17.47 ( R
2 = 0.993)).
selección preliminar de plasma miRNAs que puede supervisar GC
Cuatro miRNAs, miR-223, miR-218, miR-25 y miR -21, se expresaron de manera aberrante en los tejidos GC. Para investigar si los niveles de los cuatro miRNAs presente disregulación en el plasma de los pacientes con GC, que inicialmente se midieron los niveles en plasma de los cuatro miRNAs en 10 pacientes GC y 10 controles sanos. Como era de esperar, los niveles plasmáticos de miR-223 y miR-21 fueron significativamente mayores en pacientes con cáncer gástrico que en los controles sanos (
P Hotel & lt; 0,001), mientras que el miR-218 fueron significativamente más bajos (
P
& lt; 0,001). Sin embargo, los niveles plasmáticos de miR-25 no fueron significativamente diferentes entre los pacientes de GC y los controles sanos (
P
= 0,970) (Figura 2 (A-D)). Se ha informado de que los niveles de miR-21 en plasma GC podrían reflejar los de tejido GC primario [12]. Para investigar si los niveles de tres miRNAs (miR-223, miR-218 y miR-21) en el plasma CG pueden reflejar aquellos en los tejidos GC primaria, hemos probado los niveles de los tres miRNAs en ocho pares de tejido GC y el tejido normal adyacente las muestras de los pacientes 8 GC cuyos niveles de miR-223 de plasma, miR-21 fueron significativamente mayores, y miR-218 fue significativamente menor. Como se muestra en la Figura 2E, los niveles de expresión de miR-223 fueron más altos en los tejidos GC primarios que en los controles en siete de los ocho pacientes analizados (87,5%) y miR-21 en ocho pacientes (100%), mientras que miR-218 fue más bajo en siete pacientes (87,5%), lo que sugiere que los niveles de estos tres miRNAs en el plasma GC reflejan aquellos en los tejidos GC primaria.
gráficos de puntos de dispersión de los niveles plasmáticos de cuatro miRNAs en pacientes con cáncer gástrico (CG, n = 10) y sujetos de control sanos (NC, n = 10). representaciones gráficas de puntos de dispersión muestran los niveles plasmáticos de
miR-223 gratis (A),
miR-21 gratis (B),
miR-218 gratis (C) y
miR-25 gratis (D). Las líneas en las gráficas de puntos de dispersión indican las medianas. (E) Bares de los niveles de expresión de miR-223, miR-21 y miR-218 en los tejidos GC primarios y tejidos normales emparejados. Los niveles de expresión de miR-223 fueron mayores en los tejidos GC primarias en siete de los ocho pacientes analizados (87,5%) y miR-21 en ocho pacientes (100%), mientras que el miR-218 fue más bajo en siete pacientes (87,5%) que en tejidos normales emparejados. Todos los ensayos se repitieron tres veces por duplicado.
Los niveles plasmáticos de miR-223, miR-21, miR-218 y miR-25 se validaron en Gran Escala
Para evaluar los niveles plasmáticos de cuatro miRNAs anteriormente como marcadores de diagnóstico para la detección de GC, se añadieron otros 60 pacientes GC y 60 sujetos sanos de control en este ensayo de validación. Como se muestra en la Figura 3, los niveles de miR-223 y miR-21 fueron significativamente mayores en el plasma GC que en el control (
P Hotel & lt; 0,001), mientras que el miR-218 fue significativamente menor (
P Hotel & lt; 0,001). Sin embargo, los niveles plasmáticos de miR-25 no fueron significativamente diferentes entre los pacientes con cáncer gástrico y los controles sanos (
P = 0,082)
(Figura S1). Los valores de concentración de los cuatro miRNAs medidos en el plasma de los sujetos se muestran en la Tabla S2. Los análisis de la curva ROC se realizaron para evaluar el valor diagnóstico de los tres miRNAs plasma y reveló que los tres miRNAs plasma fueron biomarcadores valiosos para distinguir GC de los controles normales con AUCs (áreas bajo la curva ROC) de CI 0,9089 (95%: 0.8598 a 0.9580 ) para el miR-223, 0.7944 (IC del 95%: 0,7211-0,8677) de miR-21 y 0,7432 (IC del 95%: 0,6628 a 0,8236) para el miR-218. En el valor de corte óptimo de 0,7286 con el valor de la sensibilidad + especificidad-1 considerado como máximo para miR-223, la sensibilidad y especificidad fueron del 84,29% y el 88,57%; en el valor de corte de 0,5000 para el miR-21, la sensibilidad y la especificidad fueron del 74,29% y 75,71%, y en el punto de corte de 0,3858 para el miR-218, la sensibilidad y la especificidad fueron del 94,29% y 44,29%. Para elevar el valor diagnóstico, la curva ROC combinación de los análisis se realizaron (miR-223 multiplicado por el miR-21) dividido por el miR-218. La relación de (miR-223 × miR-21) /miR-218 se obtiene el valor más alto de AUC de 0,9531 (IC del 95%: 0,9222 a 0,9839) y el valor de corte óptimo de 0.7715, la sensibilidad y la especificidad fueron del 84,29% y 92,86% , lo que indica que la firma combinación tiene un valor diagnóstico potencial fuerte para la detección de GC.
los diagramas de caja muestran las concentraciones plasmáticas de miR-223 (a), el miR-21 (B), el miR-218 (C) y (miR-223 × miR-21) /miR-218 (D) en pacientes GC (GC, n = 70) y controles sanos (Carolina del Norte, n = 70). Las líneas dentro de las casillas indican las medianas. Los bigotes de los diagramas de caja: Min Max. Las gráficas de las características de funcionamiento del receptor (ROC) curva demuestran que el área bajo la curva (AUCs) de miR-223 (E), el miR-21 (F), el miR-218 (G) y (miR-223 × miR-21) /miR-218 (H) para distinguir los pacientes GC de los controles sanos. El intervalo entre el 5
º y 95
º percentiles denota el nivel de confianza y los resultados del informe muestran como fracción. Todos los ensayos se repitieron tres veces por duplicado.
Los niveles plasmáticos de miR-223, miR-218 y miR-21 en pacientes con GC diferente estado clínico
Los niveles plasmáticos de se analizaron estas tres miRNAs en los pacientes con cáncer gástrico en diferentes estadios TNM (12 con I, 11 con II, con 36 III o IV con 11) para determinar si los tres miRNAs plasma pueden detectar GC-etapa temprana. Como se muestra en la Figura 4A, los niveles plasmáticos de los tres miRNAs no fueron significativamente diferentes a través de cuatro etapas (miR-223,
P = 0,244
; miR-218,
P = 0,664
; MIR -21 de plasma,
P = 0,596
), sin embargo, cada una de las cuatro etapas incluyendo pacientes en estadio I tuvieron significativamente elevados de miR-223 y miR-21 en comparación con los controles sanos (P & lt; 0,01), y miR -218 fue significativamente menor en el estadio II, III y IV (
P Hotel & lt; 0,01), mientras que el miR-218 no fueron significativamente diferentes entre los pacientes en estadio I y los controles sanos (
P
= 0,071). Además, se compararon los niveles de los tres miRNAs en el plasma de los pacientes con cáncer gástrico con metástasis a los que no. Como se muestra en la Figura 4B, los niveles plasmáticos de los tres miRNAs no presentaron diferencias significativas entre los pacientes con metástasis de GC y los que no (miR-223,
P = 0,320
; miR-218,
P
= 0,979;. miR-21,
P = 0,310
)
(A) los diagramas de caja de las concentraciones plasmáticas de miR-223 (panel izquierdo), el miR-21 (panel central ) y miR-218 (panel derecho) en los controles sanos (NC, n = 70) y el cáncer gástrico (GC, n = 70) de los pacientes en diferentes estadios TNM (12 con I, 11 con II, 36 con III y 11 con IV ). parcelas (B) de la caja de las concentraciones plasmáticas de miR-223 (panel izquierdo), el miR-21 (panel central) y miR-218 (panel derecho) en pacientes con cáncer gástrico con o sin metástasis. Las líneas dentro de las casillas indican las medianas. Los bigotes de diagramas de caja: Min Max
Relación entre los niveles plasmáticos de miR-223, miR-21, miR-218 y Hp estado de infección de sujetos
Además. , hemos probado el estado de la infección por Hp en los 140 sujetos como se describió anteriormente, y se analizaron los niveles plasmáticos de los tres miRNAs en los 70 pacientes GC (43 con infección por Hp y 27 sin ella) y los 70 sujetos de control sanos (31 con infección por Hp y 39 sin ella), para evaluar la relación entre los niveles plasmáticos de los tres miRNAs y el estado de la infección por Hp de los sujetos. Como se muestra en la Figura 5, los niveles plasmáticos de miR-21 (
P = 0,875
,
P = 0,527
) y miR-218 (
P = 0,097
,
P = 0,539
) no fueron significativamente diferentes entre los pacientes con infección por Hp GC y los que no, y entre los controles sanos con infección por Hp y los que no, respectivamente. Sin embargo, el miR-223 fue significativamente mayor en los pacientes con infección por Hp GC que los que no (
P = 0,014)
, y significativamente mayor en los controles sanos con infección por Hp, que los que no tienen (
P
= 0,016). Los niveles plasmáticos de miR-223 (
P Hotel & lt; 0,001) y miR-21 (
P Hotel & lt; 0,001) fueron significativamente elevados en los pacientes con infección por Hp GC o cuya cuando se compara sin con los controles sanos con infección por Hp o cuyas fuera, mientras que el miR-218 fue significativamente menor (
P Hotel & lt; 0,05). Estos datos proporcionan fuertes evidencias de que las tres firmas de miARN puede distinguir pacientes con cáncer gástrico con o sin infección por Hp de los controles sanos.
Los diagramas de caja de las concentraciones plasmáticas de miR-223, miR-21 y miR-218 en pacientes con cáncer gástrico con
H. pylori
infección (Con, n = 43) y los que no (Sin, n = 27), y en sujetos control sanos con
H. pylori
infección (Con, n = 31) y los que no (Sin, n = 39). Nota: *,
P Hotel & lt; 0,05; **,
P Hotel & lt; 0,01. Los diagramas de caja muestran los niveles plasmáticos de miR-223 (A), el miR-21 (B) y miR-218 (C). Las líneas dentro de las casillas indican las medianas. Los bigotes de diagramas de caja: Min. Max a
Discusión
En este estudio, los niveles de cuatro miRNAs (miR-223, miR-218, miR-21 y miR 25) en el plasma de 70 pacientes GC y 70 controles sanos fueron analizados. En concordancia con los estudios previos de Tsujiura et al [12], nuestro ensayo también mostró que los niveles significativamente más altos en plasma de miR-21 en pacientes GC. Se encontró que los niveles de miR-223 fueron significativamente mayores en el plasma GC que en el control, mientras que el miR-218 fue significativamente menor. Los análisis de la República de China combinado reveló una mayor AUC de 0.9531 con una sensibilidad 84.29% y 92.86% de especificidad para la relación de (miR-223 × miR-21) /miR-218 en la discriminación de la GC de los controles. También se analizaron los niveles plasmáticos de miR-223, miR-21, miR-218 en pacientes con cáncer gástrico en diferente estado clínico (TNM o metástasis) y la relación entre los niveles plasmáticos de los tres miRNAs y el estado de la infección por Hp de los sujetos.
Aunque miR-223 se ha informado de que se expresa exclusivamente en casi la médula ósea [23], su sobreexpresión se ha observado en muchos tipos de cáncer, como el carcinoma de esófago [16], carcinoma hepatocelular [24], y GC [14], [15]. Recientemente, Xiaohua Li informó que miR-223 solamente se sobreexpresa en células de cáncer gástrico metastásico y estimuló la migración gástrico células de cáncer no metastásico y la invasión [25]. ¿Por qué los niveles plasmáticos de miR-223 fueron significativamente mayores en los pacientes con estadio temprano de GC? En el microambiente GC, muchas células asociadas a tumores, tales como macrófagos, células mieloides, células dendríticas y células T, tienen la capacidad de liberar los exosomas, que traslado tanto mRNA y microRNA a otras células o de la circulación [26]. Para las primeras etapas del GC, miR-223 podría ser de hasta regulado en algunas células asociadas a tumores y entregado a la sangre periférica a través de exosmes. La evidencia reciente indica que el miR-223 liberado por los macrófagos fue transportado en células de cáncer de mama y regula la invasividad de las células del cáncer de mama [27]. Se ha demostrado que la restauración de miR-218 suprime la expresión Robo1 e inhibe la invasión de células de cáncer gástrico y metástasis
in vitro
y
in vivo
[17]. La sobreexpresión de miR-218 dio lugar a una significativa disminución de la actividad de crecimiento celular y la invasión celular de las células AGS comparación con la del control [20]. Gao C et al [21] informaron de que los niveles de expresión de miR-218 se redujeron significativamente en los tejidos de GC, en la mucosa gástrica infectada por H. pylori, y en H. pylori células AGS-infectado. En nuestro estudio, los niveles plasmáticos de miR-218 no fueron significativamente diferentes entre los pacientes con infección por Hp GC y los que no, o entre los sujetos de control sanos con infección por Hp y los que no. Los niveles de miRNAs pueden ser diferentes entre el plasma y la mucosa gástrica GC. MiR-21 se sobreexpresa en varios tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de mama [28], el cáncer de pulmón [29], el cáncer de colon [30], y GC [18], [19]. Aunque Tsujiura et al [12] informó de que los niveles plasmáticos de miR-21 fueron significativamente elevados en pacientes con cáncer gástrico, no se han identificado sus niveles en plasma de pacientes con cáncer gástrico en diferentes machos TNM.
El aumento de número de trabajos reportados que los miRNAs circulantes pueden servir como biomarcadores no invasivos para la detección de GC. Recientemente, Liu Hanshao informó que el suero miR-378 fue significativamente elevado en los pacientes con GC estadio TNM I, lo que sugiere que esta firma miARN puede servir como un nuevo biomarcador no invasivo para la detección temprana de GC [31]. Pero el estado de infección por Hp en los pacientes con cáncer gástrico y controles sanos no fueron mencionados. Es bien conocido que la infección por Hp es una de las principales causas de GC, incluyendo adenocarcinoma gástrico, linfoma MALT gástrico. Si los niveles de plasma /suero de los miRNAs circulantes específicos solamente se dysregulated en pacientes con cáncer gástrico con la infección por Hp, pero no en los que no, los miRNAs pueden servir como biomarcadores para la detección de pacientes con infección por Hp en lugar de la detección de pacientes con GC.
en este estudio, aunque se analizaron los niveles plasmáticos de miR-223, miR-21 y miR-218 en pacientes con cáncer gástrico en diferentes etapas TNM, el número de muestras GC en fase inicial fue modesto. El número de miRNAs plasma analizadas en conjunto de entrenamiento fue limitado. En el futuro la investigación, es posible acceder a un mayor número de muestras de GC de etapas tempranas para evaluar el papel de plasma de miR-223, miR-21, miR-218 u otros miRNAs plasma asociada con GC en la detección temprana de GC.
para el propósito de buscar biomarcadores basados en sangre eficaces para la detección de GC para prolongar la supervivencia de los pacientes con GC temprano, muchos investigadores se han centrado en circulación miRNAs, que recientemente se ha informado para servir como un biomarcador efectiva y no invasiva para la detección de varios tipos de cáncer u otras enfermedades [32] - [35]. Aunque la sensibilidad y la especificidad de los biomarcadores circulantes miARN para la detección de GC son mucho más altas que la de los biomarcadores séricos (CA19-9 y CEA) que se utilizan en la actualidad, es un largo camino por recorrer antes de circular miRNAs como un diagnóstico clínico se utilizan para detectar GC , debido a que los niveles de un miARN circulante pueden ser significativamente mayor o menor en diversas enfermedades. Los estudios futuros de biomarcadores circulantes miARN pueden centrarse en la combinación de los perfiles de expresión de miRNAs en circulación de todas las enfermedades comunes para obtener los biomarcadores específicos para la detección de la enfermedad única. Aunque Jianning Canción [36] recomienda el miR-16 y miR-93 genes de referencia como adecuados para el análisis de miARN suero de pacientes con cáncer gástrico y controles sanos, el tamaño de la muestra es modesto. Los métodos de normalización utilizados para determinar los niveles de miRNAs circulantes deben unificarse.
En conclusión, hemos identificado que los tres miRNAs plasmáticas (miR-223, miR-21 y miR-218) pueden servir potencialmente como nuevos biomarcadores no invasivos para la detección de GC. Ya sea que el miR-223 y miR-21 tienen la capacidad para detectar GC-etapa temprana serán identificados en estudios futuros.
Apoyo a la Información
Figura S1.
Validación de los niveles plasmáticos de miR-25 en pacientes con cáncer gástrico y controles sanos. Los diagramas de caja de las concentraciones plasmáticas de miR-25 en pacientes GC (GC, n = 70) y controles sanos (Carolina del Norte, n = 70). Las líneas dentro de las casillas indican las medianas. Los bigotes de los diagramas de caja: Min Max. No se observó ninguna diferencia significativa entre los pacientes con cáncer gástrico y sujetos control sanos
doi:. 10.1371 /journal.pone.0041629.s001 gratis (TIF)
Tabla S1. Empresas El microARN madura y los cebadores /sonda detectó AB Identificación ensayo.
doi: 10.1371 /journal.pone.0041629.s002 gratis (DOCX)
Tabla S2. Empresas El valores de concentración de los cuatro miRNAs medidos en el plasma de los sujetos.
doi:. 10.1371 /journal.pone.0041629.s003 gratis (XLSX)
Reconocimientos
Agradecemos a Yun Zhao para el apoyo técnico