Extracto
Carcinoma de cabeza y cuello de células escamosas (HNSCC) es una causa importante de morbilidad y mortalidad que subraya la la necesidad de estrategias de quimioprevención seguros y eficaces. Dirigido a un receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) es atractiva en que es un evento crítico en la patogénesis precoz HNSCC. Sin embargo, los agentes actuales carecen de eficacia o tener una toxicidad inaceptable. Varios grupos han demostrado que el medicamento de venta libre, polietilenglicol (PEG) tiene notable eficacia quimiopreventivo contra la carcinogénesis de colon. Es importante destacar que, se informó de que este efecto está mediado a través de EGFR internalización /degradación. En el presente estudio, se investigó la eficacia de este agente quimiopreventivo contra el CECC, utilizando tanto el bien validado modelo animal de 4 NQO (4-nitroquinolina 1-óxido) modelo de rata y el cultivo celular con la línea celular humana CECC SCC-25. Hemos demostrado que la aplicación tópica diaria de 10% de PEG-8000 en la cavidad oral (lengua y pared de la cavidad) la iniciación de post 4NQO resultaron en una reducción significativa en la carga del tumor (tanto, el tamaño del tumor y los tumores /portador de un tumor de rata) sin ninguna evidencia de toxicidad . Los estudios inmunohistoquímicos representados disminución de la proliferación (número de células Ki67 positivas) y la reducción de la expresión de EGFR y su efectores ciclina D1 en la mucosa lingual de 4NQO-ratas tratadas con PEG. Hemos demostrado que el EGFR fue también significativamente downregulated en SCC-25 células por PEG-8000 con una inducción concomitante de G1-S del ciclo celular detención fase, que fue potencialmente mediada por p21 upregulated
CIP1 /WAF1. En conclusión, hemos demostrado, por primera vez, que el PEG tiene una eficacia prometedora y la seguridad como la eficacia quimiopreventivo contra la carcinogénesis oral,
Visto:. Wali RK, Kunte DP, De La Cruz M, AK Tiwari, Brasky J , Weber CR, et al. (2012) tópico polietilenglicol como agente quimiopreventivo Novel para el cáncer oral mediante la focalización del Factor de Crecimiento Epidérmico de respuesta. PLoS ONE 7 (6): e38047. doi: 10.1371 /journal.pone.0038047
Editor: David L. McCormick, IIT Research Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 26 Septiembre, 2011; Aceptado: 2 de mayo de 2012; Publicado: 4 Junio 2012
Derechos de Autor © 2012 Wali et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Financiación proporcionada por el Instituto Nacional de Salud U01CA111257, R21CA141112, 1R21CA156944-01, RO3CA139528, RO1CA156186. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. RKW, SS y HKR son co-fundadores de Pegasus Biosoluciones LLC. Hay uno provisional hasta la patente de los Estados Unidos. No hay productos en desarrollo o los productos comercializados que declarar. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
El carcinoma de células escamosas de la región de cabeza y cuello (CECC) es el sexto más frecuente cáncer en el mundo, que representan el 3% de todos los cánceres [1]. En 2010, sólo en los EE.UU. hubo un estimado de 49.000 nuevos casos y 11.500 HNSCC HNSCC de muertes relacionadas [2]. Es importante destacar que estas cifras no toman en cuenta la morbilidad severa de la desfiguración y aerodigestivo facial disfunción asociada con la cirugía /radioterapia. La prevención de esta enfermedad maligna, por lo tanto, representa un imperativo sanitario importante. Las modificaciones de ciertos factores de riesgo del estilo de vida sería lo ideal, pero difícil de lograr a pesar de grandes esfuerzos de salud pública contra el consumo de tabaco (tanto fumado y masticado), goma de nuez de betel, el consumo de alcohol y de estado del VPH (infección).
Por lo tanto , el interés se ha centrado en la quimioprevención dado que los grupos de riesgo están bien definidos para los esfuerzos de prevención primaria; aquellos con la transformación neoplásica temprana (leucoplasia oral) que puede ser identificado por un examen físico estándar. Una aplicación igualmente importante sería la quimioprevención secundaria (prevención segundo CECC primarias en pacientes con una historia previa de cáncer)
Se ha observado que incluso después de la resección del tumor con éxito (márgenes histopatológicamente claras).; ~ 20% de los pacientes aún pueden tener recurrencia de CECC en un sitio diferente (alrededor del 2% por año) [3]. Esto en gran medida se ha atribuido a et "campo de cancerización" [4]. De hecho, los estudios clásicos han sugerido que varios eventos mutacionales en la mucosa microscópicamente normal puede ser predictivo de HNSCC recurrente y la supervivencia general [5]. Este concepto de "mucosa condenado" es robusto no sólo para la prevención de la recurrencia (prevención secundaria) sino que también presenta un objetivo potencial para la quimioprevención primaria (pacientes sin cáncer pero que tienen lesiones premalignas).
Por lo tanto, la búsqueda de dianas moleculares en el mucosa premaligna ha sido un tema central en la prevención del CECC con el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) que recibe un poco de atención. EGFR es un evento temprano crítico en la CECC y se sobreexpresa en & gt; 80% de los CECC. la sobreexpresión de EGFR y el aumento de número de copias en las lesiones premalignas orales es un excelente predictor del riesgo de progresión a HNSCC [6]. Además, la sobreexpresión de EGFR se ha encontrado en la mucosa histológicamente normales de pacientes con CECC que indica que las alteraciones en la señalización del EGFR contribuye a la cancerización del campo se ve en estas [7] pacientes. Es importante destacar que la orientación de EGFR es un incondicional de las terapias anti-CECC que subraya la importancia de esta vía. Sin embargo, como con la mayoría de otros fármacos moleculares dirigidas, las principales cuestiones relativas al uso de agentes anti-EGFR (anticuerpos monoclonales, inhibidores de moléculas pequeñas, etc.) para la quimioprevención son sus altos costos para un uso prolongado y la toxicidad asociada, especialmente teniendo en cuenta que la mayoría de los pacientes ofrecieron agentes quimiopreventivos no tienen cáncer. Por lo tanto, la búsqueda de un mecanismo barato, bien tolerado para apuntar EGFR en la mucosa oral sería un gran paso adelante en el esfuerzo CECC quimioprevención.
Nuestro grupo ha estado explorando el polietilenglicol laxante de venta libre (PEG) para su notable potencia en la regulación negativa de EGFR y de este modo proporcionar una posible explicación para su eficacia quimiopreventivo del cáncer de colon (documentado por varios grupos en un número de modelos preclínicos) [8], [9], [10], [11], [12 ], [13]. Desde un punto de vista mecanicista, se observó que PEG resultó en una rápida internalización de EGFR unido a la membrana con la degradación proteosomal concomitante. Esto conduce a una disminución de ciclina D1 y CARACOL (implicada tanto en el cáncer colorrectal y CECC) transducción así los efectos antineoplásicos de PEG [13].
Por lo tanto, la hipótesis de que el PEG tópica puede ser un agente quimiopreventivo eficaz contra CECC . Para estos estudios se utilizó un carcinógeno bien validado, 4-nitroquinolina 1-óxido (4-NQO) modelo de rata tratada con CECC y de línea celular de cáncer escamoso, células SCC25. Dada la preocupación de que el PEG puede confundir el efecto con una interacción de la mucosa oral directa carcinógeno, se utilizó un diseño posterior a la iniciación utilizando el tamaño del tumor y la multiplicidad como nuestros criterios de valoración primarios y los biomarcadores intermedios bien validados de la proliferación como una variable secundaria. Nosotros, en el presente documento por primera vez, demuestra que la administración oral diaria tópica de PEG-8000 durante un corto intervalo disminuido significativamente la carga tumoral oral (tanto el tamaño del tumor y el número).
Materiales y Métodos
animales Estudios e inducción del tumor
Todos los animales protocolos fueron revisados y aprobados por el Comité de Cuidado y uso de animales Institucional de la Universidad NorthShore HealthSystem (IACUC Aseguramiento#A3444-01; protocolo#07-230). Veinticuatro ratas Fisher macho (F 344; 150-200 g; Harlan, Indianapolis, IN) fueron alojadas en un entorno de clima controlado (25 ° C de temperatura, 60% de humedad y un ciclo de 12 h de luz /día). Se proporcionaron dieciséis animales
ad libitum
comida para ratas y agua potable complementado con 4-nitroquinolina 1-óxido (4NQO; 20 ppm; Sigma Chemicals). agua suplementada 4NQO recién hecho se dispensó a las ratas en botellas opacas de luz que se reponía dos veces a la semana. Las 8 ratas restantes fueron proporcionados agua (grupo de control) potable. Después de 14 semanas, el agua 4NQO suplementado se reemplazó con agua normal y las ratas se asignaron al azar en dos grupos de tratamiento. El primer grupo (8 ratas) recibió una aplicación tópica diaria de 10% (W /V) PEG-8000 (la dosis /formulación eficaz en la quimioprevención del cáncer de colon) pintando el bucal suelo /techo de la cavidad oral de rata utilizando un pincel de pelo (# 4) para un máximo de 3-4 minutos. Para estos tratamientos, las ratas fueron sedados ligeramente en una cámara de anestesia isoflurano /oxígeno bien regulada. El segundo grupo (8 ratas), sirviendo como el control, se sham pintado con el pincel humedecido en solamente solución salina. Este régimen se continuó durante 14 semanas adicionales. En la necropsia, las lenguas de rata se escindieron y se sometieron a evaluación de tumor macroscópico. Las secciones se cortaron la lengua, se fija con formalina, embebido en parafina, seccionadas y sometidos a procesamiento histológico e inmunohistoquímico.
Conde del tumor y el volumen
Las lenguas disecados fueron examinados para detectar la presencia de tumores manifiestos. Número total de tumores (& gt; 0,2 cm) en cada lengüeta se contaron y se midió el volumen del tumor (tamaño) de acuerdo con la fórmula ancho x longitud x altura x π /6 [14]. Las evaluaciones histológicas para la presencia de atipia epitelial y la displasia en el tejido de la lengua no afectado se realizaron después de la tinción con hematoxilina y eosina.
inmunohistoquímica (IHC) Análisis
Las secciones de lengüeta se sometieron a análisis IHC para determinar el efecto de PEG sobre la expresión de marcadores de proliferación Ki67, EGFR y ciclina D1. Cuatro micras secciones embebidas en parafina fueron montadas en Superfrost
+ diapositivas (Vector Laboratories, Burlingame, CA) y desparafinaron primero por cocción a 55-60 ° C durante 1 hora y después someter a dos lavados de 5 minutos en xileno. Las secciones de tejido fueron entonces hidrataron en serie graduada de lavados de etanol. La recuperación del epítopo se realizó sometiendo las diapositivas de tejido para el microondas presión (Nordic Ware, Minneapolis, MN) en una solución de antígeno desenmascarar (Vector Laboratories). actividad peróxido endógena se inactivó mediante tratamiento con 3% de H
2O
2 en metanol durante 10 min y la unión no específica fue bloqueada por incubación de las secciones de tejido con suero de caballo al 5% durante 1 hora a temperatura ambiente. Las secciones fueron incubadas a 4 ° C durante 4-6 horas con anticuerpos primarios [anti-Ki67 (1:250; AbCam, Cambridge, MA), anti-EGFR (1:200; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) y anti-ciclina D1 (1:100; Tecnología de Señalización celular, Danvers, MA)], seguido de anticuerpos secundarios biotinilados apropiados. Los complejos antígeno-anticuerpo se detectaron con el kit Vectastatin Elite ABC (Vector Laboratories) usando 3, 3 '-diaminobenzidine (DAB) como cromógeno (Vector Laboratories). Para los controles negativos, las secciones se procesan en la ausencia de los anticuerpos primarios. Las muestras se contratiñeron en solución de hematoxilina de Gill y el color azul estabilizado por un segundo lavado 20 en carbonato de litio saturado (1 g /100 ml). IHC fue marcado por el patólogo (CW) sin conocimiento previo del plan de tratamiento. Se utilizó una escala semi-cuantitativo para evaluar la inmunorreactividad de las células epiteliales escamosas basales. La extensión de la tinción se graduó y obtuvo como 0, tinción negativa; 1+, & lt; 10% de reactividad, 2 + 10-50% reactivo, y para 3+ & gt;. Reactividad positiva del 50% [15]
Cell Cultura y
SCC-25 células fueron obtenido a partir de American Type Tissue Culture (ATCC), Rockville, MD. Estos son pobremente células escamosas diferenciadas obtenidas de lengua humana. La identidad y la calidad de estas células fueron autenticadas por la ATCC. Las células se cultivaron en DMEM /F-12 medios de comunicación (que contienen 2,5 mM de L-glutamina, HEPES 15 mM, piruvato de sodio 0,5 mM, y bicarbonato de 1,200 mg /L de sodio) suplementado con 400 ng /ml de hidrocortisona (Sigma /Aldrich), 10% de FBS (ATCC), y 0,5% Pen /Strep (ATCC). Para evaluar el efecto de PEG, estas células fueron tratados con PEG-8000 o vehículo (PBS) durante 24 h. Las células se recogieron a continuación y se sometieron a transferencia de Western y fluyen análisis de citometría.
Ensayo de proliferación celular
El número de células se evaluó mediante WST-1 (4- [3- (4-yodofenil) -2 - (4-nitrofenil) 2H-5-tetrazolio] -1, disulfonato) de ensayo 3-benceno de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN). Brevemente, se cultivaron SCC-25 células en placas de 96 pocillos en un volumen final de 100 l y luego se incubaron con 10 l de reactivo WST-1 a 37 ° C durante 30 min en un humidificado 5% CO
2 incubadora. Se determinó la conversión de sal de tetrazolio en formazán por espectrofotometría a 440 nm de absorbancia (Molecular Devices, Sunnyvale, CA):
Ciclo Celular Análisis
SCC-25 células fueron incubadas con vehículo (solución salina tamponada con fosfato.; PBS) o 10% de PEG en un humidificado 5% CO
2 incubadora a 37 ° C durante 24 h. Las células se lavaron posteriormente en PBS /albúmina de suero bovino (BSA), se tripsinizaron, se resuspendieron en fresco PBS /BSA y se fijaron en 70% de etanol a -20 ° C durante 30 min. Después de 2 lavados, las células se incubaron durante 3 h (a temperatura ambiente) en solución de PBS /BSA que contienen yoduro de propidio (PI; 40-g /ml, Sigma) y RNasa A (200 mg /ml; Sigma). Las células se sometieron a medición del contenido de ADN usando citometría de flujo (Becton Dickinson Labware). Los datos se expresaron como porcentaje de células en G
O-G
1 a G
2-M poblaciones y CellQuest 3,1 programa de software fue utilizado para el desarrollo de histogramas de frecuencia de contenido de ADN.
análisis de transferencia Western
Western Blot se aplica usando técnicas estándar. Brevemente, 30 mg de proteína se sometió a SDS-PAGE, se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ), se bloquearon con BLOTTO al 5% y se sondaron con anticuerpos específicos, incluyendo antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA), P21
cip1 /WAF1, ciclina D1, receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). Xerograms se desarrollaron con un aumento de quimioluminiscencia (Santa Cruz Biotechnology). Las imágenes fueron adquiridas a través UVP sistemas de bio-imágenes y analizados utilizando el software Labworks 4.6. La uniformidad en la carga de proteínas se logró mediante la normalización tras la palpación membranas con anti-β-actina (1:1000).
Métodos Estadísticos
Los valores se expresaron como media ± SE, lo indicado. Los valores de densitometría cuantitativas se compararon mediante la prueba de Student pareada. Las diferencias con p & lt; 0,05 se consideraron estadísticamente significativos
Resultados
inducida 4NQO PEG inhibe el tumor oral iniciación y progresión
El modelo de carcinogénesis oral inducida 4NQO rata es una forma rutinaria. modelo usado para estudios de quimioprevención CECC que comparte varias características con la carcinogénesis humana CECC, en términos de eventos moleculares de varios pasos y los cambios secuenciales en las características histopatológicas de la mucosa cavidad oral [16], [17]. Una de las otras ventajas de este modelo es la relativamente alta especificidad hacia los tumores de cabeza y cuello, así como efecto debilitante mínimo sobre la salud general de las ratas. Como se muestra en la Figura 1 (A), en la necropsia (14 semanas después del final del tratamiento con el carcinógeno), las ratas tratadas con 4NQO desarrollado múltiples tumores grandes en la cavidad oral, principalmente procedente de lengua y algunos de la mucosa orofaríngea. La administración de PEG-8000 durante 14 semanas después de terminar el tratamiento 4NQO demostró dos cambios importantes: las ratas 1) PEG-8000 tratados desarrollaron tumores significativamente menores (volumen del tumor) que sus homólogos de la misma edad y 4NQO con el tratamiento combinado (~58% de disminución; p = 0,02); 2) el número de tumores en general (tumores /tumor de rata cojinete) en ratas tratadas con PEG-8000 también fue inferior a las ratas de tratamiento emparejados por edad y 4NQO cuales no recibieron PEG-8000 en cualquier punto (~ 25% de reducción; p = 0,05 ) (Figura 1B). Estos resultados implican que la aplicación de PEG-8000 puede reducir eficazmente la formación de nuevos tumores (inhibición de la iniciación), así como detener la progresión de los tumores preexistentes hacia HNSCC avanzada (inhibición de la progresión).
El primer grupo recibió un diario (3-4 minutos) la aplicación tópica de 10% de PEG-8000 a través de la pintura oral y el segundo grupo fue pintado simulada (grupo de control PEG). Este régimen se continuó durante 14 semanas adicionales antes de la eutanasia. Las ratas se sacrificaron después de 14 semanas y la cavidad oral sometido a evaluación de tumor macroscópico de tumores totales (≥0.2 cm). Como se muestra, las ratas tratadas con 4NQO desarrollado múltiples tumores grandes en la cavidad oral en su mayoría procedente de lengua y pocos de la pared de la cavidad oral. PEG redujo el número de tumores en general (rata portadores de tumores /tumor) (p = 0,05) y el crecimiento de los tumores (volumen del tumor) en comparación con sus homólogos de la misma edad (p = 0,02). El volumen del tumor (tamaño) se midió de acuerdo con la fórmula ancho x longitud x altura x π /6.
PEG Suprime premalignas epitelial hiperproliferación
Una regulación temporal y espacial precisa de la difusa proliferación celular es una característica importante de las primeras etapas de la carcinogénesis CECC, y sirve como una herramienta importante para evaluar la eficacia de los agentes quimiopreventivos. En el modelo de rata tratada 4NQO de la carcinogénesis CECC, hiperproliferación celular generalizada en el epitelio de la lengua ha sido reportado anteriormente [18]. La evaluación microscópica de la mucosa en las ratas tratadas con 4NQO reveló muchas regiones localizadas de leve a moderada displasia epitelial en lengua morfológicamente normal y mucosa oral que se normalizaron por PEG (Figura 2A). Para estudiar más a fondo los efectos de la aplicación de PEG-8000 sobre la proliferación de la mucosa de la lengua /oral de las ratas tratadas con 4NQO, hemos examinado la expresión inmunohistoquímica del antígeno nuclear Ki67, un marcador bien definido de la proliferación. Para ello, se han evaluado un total de 1000 células epiteliales en 6-7 campos en 400 × magnificación y todos los valores se utilizaron para los índices de rotulación. Como se muestra en la Figura 2A y B, 4NQO-tratamiento aumentó significativamente la proliferación en la mucosa lingual morfológicamente normales como se muestra (número de células epiteliales marcados con Ki67 /por campo óptico: 30 + 8 en 4NQO-grupo de tratamiento frente a 14 + 6 en emparejados controles; p & lt; 0,01). La aplicación tópica de PEG-8000 índices de proliferación dramáticamente normalizados en ratas tratadas 4NQO (número de células epiteliales marcados con Ki67 /por campo óptico: 30 + 8 en ratas tratadas con 4NQO-solo vs. 17 + 4 en las ratas tratadas con 4NQO tratados con PEG-8000, la reducción de ~43%; p & lt; 0,01). En el epitelio de la mucosa de las ratas tratadas con 4NQO, en contraposición al epitelio escamoso normal donde la proliferación está limitada al compartimiento basal, la zona de proliferación extiende al compartimento supra-basal del epitelio escamoso estratificado lengua. Sin embargo, la aplicación de PEG-8000 contenía la zona proliferativa de nuevo al compartimiento basal del epitelio escamoso estratificado, lo que indica fuertes efectos anti-proliferativos de este agente tópico
Como se muestra (panel superior; Figura 2A)., 4NQO- secciones de rata tratados reveló muchas regiones localizadas de leve a moderada displasia epitelial de la mucosa que aparece morfológicamente normal que se normalizó por PEG [mayor aumento (63 ×; imagen recortada) inserciones demuestran la presencia de figuras de mitosis en el grupo NQO tratados con 4 solos]. Para estudiar más los efectos de PEG en la mucosa hiper-proliferación, se realizó el análisis inmunohistoquímico de antígeno nuclear Ki67, un marcador bien definido de la proliferación. Un total de 1000 células epiteliales se evaluaron de 6-7 campos. Como se muestra (panel inferior; Figura 2A-B), 4NQO-tratamiento aumentó la proliferación en la mucosa lengua morfológicamente normales como se muestra por el aumento de número de células epiteliales marcados con Ki67 /por campo óptico en comparación con la edad emparejado controles libres de carcinógenos. (P & lt; 0,01). La aplicación tópica de PEG por otro lado reduce drásticamente el número de células epiteliales marcados con Ki67 /por campo óptico (p & lt; 0,01).
PEG regula a la baja de la lengüeta de la mucosa EGFR y ciclina D1 Expresión en 4 NQO- las ratas tratadas
sobreexpresión de EGFR en las lesiones premalignas de cabeza y cuello se correlaciona con el aumento del riesgo de progresión a la CECC y pobres supervivencia [19], [20]. Por lo tanto, la modulación de la expresión de EGFR puede servir como el elemento clave de una estrategia de quimioprevención. Varios grupos, incluyendo el nuestro han demostrado previamente que los efectos antiproliferativos y quimiopreventivos de PEG contra la carcinogénesis colorrectal son mediada por EGFR, como la administración de PEG-gavages en ratas tratadas con carcinógenos redujo significativamente la proliferación en la mucosa del colon a través de la regulación por disminución de la expresión de EGFR [13]. Por lo tanto, investigamos si un mecanismo similar fue implicado en las acciones de quimiopreventivos tópica PEG-8000 contra CECC. Las secciones de la lengua se fijaron con formalina y se examinaron mediante inmunotinción para evaluar los cambios en los niveles de expresión de EGFR. Como se muestra en la Figura 3A y B, la aplicación tópica de PEG-8000 redujo significativamente la intensidad, así como el número de áreas que sobreexpresan EGFR en ratas tratadas 4NQO donde la expresión de línea de base EGFR fue mucho mayor que la lengua mucosa /oral de ratas de control sanos. Esto implica la regulación por disminución de EGFR como uno de los posibles mecanismos para la quimioprevención inducida por PEG de HNSCC. Además, demostró que PEG redujo significativamente la expresión de la ciclina D1, un efector aguas abajo de EGFR que se sobreexpresa en HNSCC [21] y el que provoca la resistencia a los fármacos terapéuticos tales como cisplatino [22] y gefitinib [23].
Como se muestra (panel de la izquierda - la Figura 3A y 3B), la expresión de EGFR de línea de base en la mucosa lengua de 4NQO ratas fue mayor que el de las ratas de control (p & lt; 0,00001). La aplicación tópica de PEG sin embargo, causó una disminución significativa en la expresión de EGFR (p & lt; 0,005). Además, la aplicación tópica de PEG a las ratas 4-NQO causó efectos similares en la expresión de ciclina D1, uno de los efectores corriente abajo de EGFR. (Panel derecho - la Figura 3A y 3B)
PEG inhibe la proliferación celular e induce la detención del ciclo celular en células SCC-25
Para entender el mecanismo de acción de PEG sobre la proliferación celular en HNSCC; se utilizó un
in vitro
modelo de cultivo celular (línea celular de carcinoma escamoso; SCC-25) para examinar el efecto de PEG sobre la proliferación y la distribución del ciclo celular. Como se muestra en la Figura 4A, el ensayo de proliferación WST-1 reveló una disminución dependiente de la dosis en el crecimiento de las células SCC-25 cuando son tratados con PEG durante 24 h, con una disminución máxima de 43% obtenida en el 10% de PEG-8000. Por lo tanto, para los experimentos posteriores 24 h tratamientos de 10%-8000 PEG se utilizaron. Los resultados de inmunotransferencia mostraron que el PEG también causó ~ 50% de disminución marcador de proliferación, PCNA (Figura 4B). la detención del ciclo celular es uno de los mecanismos importantes de agentes quimiopreventivos. Para investigar el efecto de PEG-8000 en la distribución celular se realizó un análisis de citometría de flujo de células PI etiquetados. Nuestros resultados muestran que el tratamiento 24 h de SCC-25 células con 10% de PEG-8000 dio lugar a una marcada reducción de células en fase S (proliferativas) (62% de control del vehículo; p & lt; 0,002) y un aumento significativo en G2-M células de fase (138% de control del vehículo; p & lt; 0,001) (Figura 4C). Estos resultados indican claramente que el tratamiento PEG induce la detención del ciclo celular en las células hiperproliferativas, y por lo tanto podría ayudar a restaurar la homeostasis celular mediante la modificación de las tasas alteradas de crecimiento de células cancerosas y la muerte.
Como se muestra (Figura 4A), no había una disminución dependiente de la dosis en el crecimiento celular, con disminución máxima de 43% obtenida en el 10% de PEG-8000. La Figura 4B muestra una disminución ~ 50% en la expresión de PCNA marcador de proliferación por PEG. La Figura 4C muestra el efecto de PEG sobre la distribución del ciclo celular. Las células tratadas con PEG 24 h se tiñeron con yoduro de propidio y se analizaron por citometría de flujo. PEG bloqueado células en la fase S (un 62%) y, correspondientemente, aumenta las células en la fase G2-M (un 38%).
El tratamiento de células SCC-25 con PEG Disminuye EGFR y ciclina D1 y modula la expresión de p21 Ciclo celular proteína reguladora
CIP1 /WAF1
Desde nuestro
in vivo
experimentos con ratas 4NQO, EGFR y ciclina D1 eran los dos objetivos importantes regulados negativamente por PEG; hemos querido estudiar si se observaron efectos similares en las líneas celulares CECC. En primer lugar, realizamos experimentos de inmunotransferencia para evaluar la expresión de EGFR y ciclina D1 a 24 h de tratamiento de PEG-8000 en células SCC25. En consonancia con la
in vivo
experimentos hemos encontrado que el tratamiento de células SCC25 con PEG-8000 causó una disminución significativa EGFR (~ 45% en comparación con el control del vehículo; p & lt; 002) y ciclina D1 (~57% en comparación con vehículo de control; p & lt; 0,005) la expresión (Figura 5 A). En la quimioprevención del cáncer de colon inducida por PEG, hemos demostrado previamente que la detención del ciclo celular inducida por PEG-8000 implica una regulación al alza mediada por EGFR de un inhibidor de la quinasa dependiente de ciclina, p21
CIP1 /WAF1 [24]. En un protocolo experimental similar, se encontró que PEG-8000 de hecho provocó un aumento ~54% en la expresión de p21 (p & lt; 0,001) en SCC25 células (Figura 5B). Otros estudios están en marcha para caracterizar las vías ascendentes implicados en la modulación de estos reguladores del ciclo celular en células SCC25 por tratamiento con PEG
.
Como se muestra en la Figura 5A, en consonancia con los
in vivo
experimentos PEG causados una disminución significativa EGFR (~ 45% en comparación con el control del vehículo; p & lt; 002) y ciclina D1 (~57% en comparación con el control del vehículo; p & lt; 0,005) la expresión. En un protocolo experimental similar (Figura 5B), PEG-8000 causó aumento ~54% en la expresión de p21 (p & lt; 0,001).
Discusión
en este documento demuestran, por primera tiempo, que la aplicación tópica de PEG-8000 ofrece una protección eficaz contra el desarrollo del cáncer oral. Nuestros datos de cultivo de células que muestran los efectos antiproliferativos de PEG en células SCC-25 se complementa con la disminución de la carga tumoral en el modelo CECC-4-rata NQO bien validado (cuando se administra en la fase posterior a la iniciación). Desde un punto de vista mecanicista, se demuestra la regulación a la baja de EGFR con la inhibición concomitante del eje de la ciclina D1-proliferación.
CECC debe ser eminentemente chemopreventable porque el los grupos de riesgo son fácilmente identificables tanto para la prevención primaria (tabaco de mascar, alcohol, HPV etc) y la prevención secundaria. Esto se debe a que los pacientes con CECC un solo tumor primario tienen un riesgo significativo de desarrollar segundos tumores primarios en los próximos decenios. Además, los pacientes con leucoplasia oral (prevalencia de ~ 0,5%) que generan una tasa de transformación maligna de ~ 5% por año pueden beneficiarse de este quimioprevención [25]. Por lo tanto, el PEG para la prevención CECC representa una estrategia potencialmente clínicamente viable.
En este sentido, numerosos agentes quimiopreventivos, como los AINE [26], la vitamina E [27] y el ácido retinoico [28] han sido probados contra CECC pero han fracasado, ya sea debido a la falta de eficacia o la toxicidad [29]. Por ejemplo, un reciente ensayo aleatorizado de fase II, celecoxib a 100 ó 200 mg dos veces al día se encontró que era ineficaz en el control de las lesiones orales premalignas y tenía una toxicidad sistémica significativa como efectos secundarios cardiovasculares [30]. Del mismo modo, se encontró que los retinoides para ofrecer sólo una protección modesta contra el desarrollo de SCC en pacientes leucoplasia, y con un perfil de efectos secundarios inaceptables [31]. El único otro agente que ha mostrado resultados alentadores hasta la fecha ha sido el extracto de té verde (GTE), que, al tiempo que no alcanzó significación estadística en la tasa de respuesta clínica de las lesiones premalignas orales, aumentó aún más la duración mediana de progresión (27,5 a 46,4 meses ) [32].
La falta de resultados convincentes con agentes quimiopreventivos estándar ha conducido a un interés en la utilización de un enfoque agente candidato molecularmente definido [33]. Se han realizado dos estudios exhaustivos recientes que evalúan el paisaje mutacional de HNSCC [34], [35]. Estos estudios revelaron un número de genes que son comúnmente alterados en HNSCC. Sin embargo, la mayoría de los eventos tempranos putativo (por ejemplo, p53 y NOTCH1) parecen ser los genes supresores de tumores que generalmente no son "druggable" (inhibición más probable que sea beneficioso para los proto-oncogenes). Por lo tanto, para la prevención del cáncer, no sólo lo hacen candidato objetivos tienen que ser proto-oncogenes, pero estas lesiones deben ser difusa presente en la mucosa oral de pacientes en situación de riesgo, especialmente en las lesiones premalignas orales (OPLS; que comprende principalmente de la leucoplasia). EGFR se ha demostrado que es un objetivo en el tratamiento de HNSCC con ambos anticuerpos monoclonales e inhibidores de moléculas pequeñas como componentes clave de la arsenal terapéutico. Además, nuestros datos demuestran claramente una regulación al alza profundo en EGFR en la mucosa oral /lengua histológicamente normal en las ratas tratadas 4NQO. La importancia de EGFR en la carcinogénesis temprana se destaca por un reciente ensayo clínico que demostró que en la mayor parte de la OPL, EGFR regulación al alza (tanto por el número de copias y la expresión) se correlacionó con alto riesgo de progresión a la malignidad franca [36], [37]. Desde una perspectiva EGFR quimiopreventivo puede ser un objetivo importante como se revela por la evaluación mecánica de extracto de té verde para la quimioprevención del cáncer.
Nuestros datos indican que el PEG puede causar una regulación a la baja dramática de EGFR tanto en cultivo celular y en el premaligna mucosa oral, consistente con nuestra extensa datos de PEG en la carcinogénesis colorrectal. De hecho, PEG es uno de los agente quimiopreventivo más potente contra el cáncer colorrectal [8], [38]. La eficacia de PEG en el cáncer de colon ha sido apoyado por los datos epidemiológicos preliminares [39]. Desde una perspectiva mecanicista, nuestro laboratorio ha demostrado previamente que EGFR se downregulated por PEG en cultivo celular y en cancerígeno de colon (azoximetano) modelo de rata tratado con, [13]. Este efecto parece ser a través de la internalización de la membrana con la subsiguiente degradación proteosomal. Las consecuencias aguas abajo parecen seguir el paradigma de EGFR → → CARACOL cadherina E → β-catenina → Tcf la regulación transcripcional [13]. Es importante destacar que el carácter integral de EGFR se demostró por la demostración de que el EGFR desmontables (a través de shRNA) embota la eficacia quimiopreventivo de PEG en este modelo de cáncer de colon. Los estudios están actualmente en curso para determinar el mecanismo exacto por el cual PEG internaliza EGFR. Además, de acuerdo con nuestros datos actuales en HNSCC, hemos demostrado anteriormente, tanto en modelos de cultivos celulares y animales de cáncer de colon, que inducida por PEG regulación a la baja EGFR suprime la proliferación potencialmente a través de la ciclina D1. Además, el G1 → S detención del ciclo celular de fase observada puede ser mediada, al menos en parte, a través de la inducción de la p21
CIP1 /WAF1, una ciclina inhibidor de quinasa dependiente, que puede proporcionar otra modalidad de la supresión de la proliferación [24].