Extracto
Objetivo
Para examinar el polimorfismo de nucleótido único (SNPs) en
MUC16 gratis (CA125) y
MUC1 gratis (CA15.3) en relación con el riesgo de cáncer de ovario y la supervivencia.
Métodos
Estamos genotipo germinal variantes de
MUC16 gratis (rs2547065, rs1559168, rs12984471, rs2121133) y
MUC1 gratis (rs2070803, rs4072037, rs1045253) utilizando muestras obtenidas de 758 casos de cáncer de ovario y 788 controles inscritos en la Nueva Inglaterra de casos y controles estudio entre 2003 y 2008. Se calcularon los ajustadas por edad odds ratios (OR) y los intervalos de confianza del 95% (IC) para el riesgo de la enfermedad usando relaciones incondicionales y politómicos de regresión logística y de riesgo (CR) para la supervivencia de Cox utilizando los coeficientes de riesgo proporcional. En un subgrupo de los casos, se compararon los valores de CA125 log-normalizadas por el genotipo utilizando modelos lineales generalizados.
Resultados
Los casos homocigotos para el alelo variante de
MUC16
SNP, rs12984471 , tenía peor supervivencia global (log-rank p = 0,03) y los niveles de CA125 superiores, especialmente los casos mayores de 65 años (p = 0,01). Para
MUC1
SNP rs4072037, mujeres, homocigotos para la variante G tenían una forma no significativa disminución del riesgo de tipos invasivos serosas pero elevado riesgo de tumores serosos limítrofes, borderline mucinoso y tumores invasivos y tumores endometrioide. Las mujeres con el alelo variante de
MUC16
SNP, rs2547065, especialmente aquellos que eran homocigóticos tenían un riesgo elevado de cáncer de ovario; pero esta asociación no se confirmó en un conjunto de datos independiente.
Conclusión
Esta pantalla dirigida de siete polimorfismos de
MUC16
y
MUC1
genes no se logró identificar y confirmar los efectos sobre el riesgo de cáncer de ovario en general. Sin embargo, puede haber efectos de
MUC16
rs12984471 en la supervivencia y
MUC1
rs4072037 en riesgo de tipos histológicos de cáncer de ovario que no sea invasivo serosa. Nuevos estudios se requieren
Visto:. KA Williams, Terry KL, Tworoger SS, Vitonis AF, Tito LJ, Cramer DW (2014) Polimorfismos de
MUC16 gratis (CA125) y
MUC1 gratis (CA15.3) en relación con el riesgo de cáncer de ovario y de supervivencia. PLoS ONE 9 (2): e88334. doi: 10.1371 /journal.pone.0088334
Editor: Surinder K. Batra, Universidad de Nebraska Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 18 Septiembre, 2013; Aceptado: 6 Enero 2014; Publicado: 13 Febrero 2014
Derechos de Autor © 2014 Williams et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El trabajo era con el apoyo de los números de subvención NIH R01CA054419, P50CA105009, R01CA49449, R01CA67272, R01CA50383, UM1 CA176726 y P01CA87969; Departamento de Defensa de la subvención número W81XWH-10-1-0280 y los eruditos en Medicina Oficina de la Escuela de Medicina de Harvard y el Departamento de Obstetricia y Ginecología del Hospital Brigham y de la Mujer. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, la decisión de publicar o preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Las mucinas humanas atados (MUC) son una familia de proteínas transmembrana grandes, fuertemente glicosiladas que tienen una amplia gama de funciones [1]. CA125, o MUC16, es el más grande de la familia glicoproteína mucina, y normalmente se expresa en el epitelio de revestimiento de diversos tejidos, especialmente la del aparato reproductor femenino [1]. CA125 es elevada en el suero de aproximadamente 82% de los pacientes con cáncer de ovario y se utiliza para predecir la recurrencia [2], [3]. CA15.3, o MUC1, se expresa también en el revestimiento epitelial de diversos tejidos, exhibiendo una fuerte expresión en la glándula mamaria y el tracto reproductor femenino durante el embarazo y la lactancia. CA15.3 se sobre-expresa en una amplia variedad de cánceres, incluyendo cáncer de mama y ovario [1], [4]. Aunque estos dos mucinas son mejor conocidos como marcadores tumorales, la evidencia sugiere que pueden desempeñar un papel en la metástasis del cáncer, el crecimiento tumoral y la supervivencia, la inhibición de la respuesta inmune, y el pronóstico [1], [5], [6].
Varios estudios han examinado la variación genética en los genes implicados en la glicosilación de CA125 y CA15.3 y el riesgo de cáncer de ovario, la observación de las asociaciones nula general [7], [8], [9], [10]; Sin embargo, hay pocos estudios de variación genética específica en
MUC16
o
MUC1
y su asociación con el riesgo de cáncer de ovario o de supervivencia. Por lo tanto, hemos examinado la asociación entre un conjunto específico de polimorfismos de nucleótido único (SNPs) en
MUC16 gratis (rs2547065, rs1559168, rs12914471, rs2121133) y
MUC1 gratis (rs2070803, rs4072037, rs1045253) en relación con el riesgo de cáncer de ovario y la supervivencia.
Métodos
Declaración de Ética
Juntas de Revisión Institucional del hospital Brigham y de la Mujer, Instituto de cáncer Dana Farber, y la Escuela de Medicina de Dartmouth aprobó los estudios y todos los participantes en el estudio firmaron un consentimiento informado.
Población de estudio y diseño em
los datos y las muestras provienen de la última fase de inscripción del estudio de caso de control de Nueva Inglaterra de cáncer de ovario 2003-2008 (NECC) . Los detalles relacionados con el caso y el control de inscripción para este estudio se describen en otra parte [11], [12]. En pocas palabras, de 1610 casos nuevos de cáncer de ovario identificados a través de las juntas de tumores hospitalarios y los registros de cáncer en todo el estado entre 2003 y 2008, 897 de los 1.238 elegibles de acuerdo en participar. Los controles fueron identificados a través de los libros de la ciudad en la lista de licencias del este de Massachusetts y de los conductores en New Hampshire. Los criterios de exclusión para los controles incluidos incapacidad para ponerse en contacto, historia de la ooforectomía bilateral, las barreras del idioma, o la reubicación fuera de la zona de estudio. De 2522 controles identificados de 1673 fueron elegibles y 857 de acuerdo en participar.
Después de consentimiento informado por escrito, información demográfica, historia reproductiva y médica, y los factores de estilo de vida se evaluaron mediante entrevistas personales y muestras de sangre heparinizada se recogieron.
genotipado
se extrajo el ADN y genotipado se realizó en el Dana-Farber /Harvard Cancer Center (DF /HCC) de alto rendimiento polimorfismo Core, una filial del Centro de Salud Socios para la medicina personalizada genética . Se extrajo el ADN a partir de muestras de la capa leucocitaria utilizando QIAmp (Qiagen, Chatworth, CA). Genotipado de
MUC16 gratis (rs2547065, rs1559168, rs12914471, rs2121133) y
MUC1 gratis (rs2070803, rs4072037, rs1045253) se efectúa utilizando 5 'ensayos de nucleasa (TaqMan®) en el 7900HT de Applied Biosystems Prism Sistema de Detección de Secuencia (Applied Biosystems, Foster City, California). Cebadores, sondas, y las condiciones de genotipificación están disponibles bajo petición. Repeticiones de 10% de las muestras se incluyeron para el control de calidad. El personal de laboratorio fueron cegados al estado de casos y controles y la ubicación de los controles de calidad.
Con base en los datos preliminares, hemos tratado de validar uno de los SNPs en un conjunto de datos independiente. Se utilizó muestras de 534 casos y 1513 controles de cohortes Estudio de Salud de Enfermeras (NHS /NHSII) [13]. El NHS incluye 121.700 participantes, 32.826 de los cuales proporcionaron muestras de sangre en 1990 y que dio 33,040 células bucales especímenes 2001-2004. El NHSII incluye 116,430 participantes, de los cuales 29.611 proporcionan sangre de 1996-1999 y 29,859 células bucales proporcionados desde 2004-2006. Los casos fueron identificados después de la recogida de muestras y tarde del 1 junio del 2010 (NHS) o 1 de junio de, 2009 (NHSII). La información demográfica sobre los participantes del NHS y NHSII se han descrito anteriormente [13]. En pocas palabras, los participantes de ambos grupos son predominantemente blancos (& gt; 96%), pero NHS es una cohorte mayor de NHSII que se refleja en la media de edad de los participantes (NHS: 65 años, NHSII: 49 años), alguna vez un parto (95% NHS , el 76% NHSII), y el uso de anticonceptivos orales nunca (45% NHS, el 81% NHSII).
niveles preoperatorios de CA125
Se revisaron todos los expedientes médicos e informes de laboratorio computarizados para los casos que recibieron atención del hospital Brigham y de la Mujer o el hospital general de Massachusetts (n = 809) [14]. Los valores de CA125 fueron resumidos para las mujeres cuyos niveles se había medido antes de la cirugía y /o quimioterapia neoadyuvante. Hemos sido capaces de recuperar los valores de CA125 en 353 de los casos genotipo en este estudio. Los datos sobre CA15.3 no estaban disponibles.
Análisis estadístico
Se utilizaron pruebas de chi-cuadrado para evaluar Hardy-Weinberg (HWE) para cada SNP entre los controles. regresión logística no condicional se utilizó para calcular las relaciones globales de posibilidades (OR) y los intervalos de confianza del 95% (IC 95%) de riesgo de cáncer de ovario ajustados por edad (continua), centro de estudios (Massachusetts o Nueva Hampshire), y la raza (blanca o no blanco). El alelo más común para cada SNP sirvió como grupo de referencia en los modelos de regresión. (Tipo heterocigotos vs salvaje o variante homocigótica vs tipo salvaje) co-dominante, recesivo (variante homocigotos frente a heterocigotos y de tipo salvaje), y por alelo (prueba de tendencia) se calcularon modelos. modelos de regresión multivariable, además, se ajustaron para la historia familiar de cáncer de mama inicio de ovario o temprano y una historia personal de cáncer de mama.
regresión logística politómica se utilizó para calcular OR (IC del 95%) por el riesgo de varios subtipos histológicos ajustado la edad, el centro de estudios, y la raza. Probabilidad ratio de pruebas se utilizaron para probar la heterogeneidad entre las distintas categorías histológicas (seroso borderline, serosa invasivo [incluye células de alto grado de transición y se mezcla serosa], mucinoso [limítrofe e invasiva], endometrioide o endometrioide mixta /células claras, de células claras, indiferenciado [incluye los tumores no especificados y Brenner]) comparar un modelo que permite la estimación de la asociación para variar según el tipo histológico de un modelo que restringe a una estimación de la asociación para todos los tipos histológicos.
Cox modelos de riesgo proporcional (HR) se utilizaron para examinar la asociación entre cada polimorfismo y la supervivencia, ajustando por el centro de estudios y la carrera y en un modelo secundario de la etapa (I-IV) y la histología (serosa, no serosa). Se han usado Co-dominante, recesivo, y por modelos de alelos como se describe en los métodos suplementarios (Métodos S1). El método de Kaplan-Meier se utilizó para estimar las curvas de supervivencia y calcular las estadísticas de log-rank.
Se calcularon los valores de CA125 medias geométricas de genotipo para cada
MUC16
polimorfismo. Los análisis estadísticos utilizando modelos de regresión lineal general, ajustado por edad, raza, y el tiempo entre la medición CA125 y el diagnóstico (≤ 30 días, & gt; 30 días, que falta), el uso de registro transformado niveles de CA125 continuas y una variable que representa el aumento de alelos variantes para cada polimorfismo ( 0, 1, 2). los niveles de CA125 pueden variar durante el ciclo menstrual, y los niveles varían entre mujeres pre y posmenopáusicas [15], [16], por lo que estratificado estos análisis en tres /categorías menopáusicas de edad (premenopáusicas, "media vida" posmenopáusicas (edad y lt; 65), y postmenopáusica "mayores" (edad & gt; = 65)). Todos los análisis se realizaron con SAS v 9.1 (SAS, Cary, Carolina del Norte) y el intercooler Stata 9 (StataCorp LP, College Station, Texas).
Resultados
Un total de 758 mujeres con ovario controles de cáncer y 788 se incluyeron en la muestra analítica final (Tabla 1). Para ambos casos y controles, con una media de edad fue de 54. Nuestra población de estudio consistió principalmente en mujeres de raza blanca (& gt; 95%) y la etnia blanca era más común entre los controles. En promedio, los controles tenían mayor número de partos, mayor duración de uso de anticonceptivos orales, y una mayor frecuencia de la ligadura de trompas, endometriosis o períodos menstruales dolorosos, y una historia personal de cáncer de mama. Antecedentes familiares de cáncer de ovario o de aparición temprana de mama, el tabaquismo y el estado menopáusico no difirió significativamente entre los casos y controles. Serosa invasivo (49,7%) fue el subtipo histológico más frecuente en los casos seguidos por endometrioide (17,8%).
Los siete polimorfismos estaban en equilibrio de Hardy-Weinberg y tuvo un éxito genotipado más de un 95%, excepto para rs2547065 (93%). En general, las frecuencias de alelos menores (MAF) que encontramos para nuestros controles eran comparables a las de las poblaciones HapMap Europea Europeo (CEU) (datos no mostrados). En el estudio NECC, uno de los cuatro
MUC16
polimorfismos se asoció con el riesgo de cáncer de ovario (Tabla 2). Para rs2547065 polimorfismo, se observó un aumento del riesgo de cáncer de ovario (por alelo O IC = 1,26, 95%: 1,09 a 1,47). El riesgo fue más evidente para el genotipo variante homocigótica, en comparación con el genotipo de tipo salvaje (OR CI = 1,68, 95%: 1.23 a 2.29). Sin embargo, rs2547065 polimorfismo no se asoció con el riesgo de cáncer de ovario (por alelo: OR = 1,05, IC del 95%: 0,91 a 1,21) en un conjunto de datos independiente que incluye 534 casos y 1513 controles de cohortes Estudio de Salud de Enfermeras (NHS /NHSII). No hubo heterogeneidad significativa según el tipo histológico para cualquiera de los
MUC16
polimorfismos.
En
MUC1
, ninguno de los polimorfismos que probamos se asociaron significativamente con el guardapolvo el riesgo de cáncer de ovario en el modelo por alelo. Mujeres que llevan dos copias del
MUC1
variante polimorfismo rs2070803 tenían un mayor riesgo de cáncer invasivo serosa de la significación estadística (OR = 1,35, IC del 95%: 0,99 a 1,86) en el modelo recesivo. Aunque se observó ningún riesgo significativo asociado con
MUC1
rs4072037 polimorfismo en general, se observó una heterogeneidad significativa por la histología cuando se evalúa el modelo recesivo para este polimorfismo (p-heterogeneidad = 0,02). Las mujeres homocigotos para la variante G del rs4072023 tenían una forma no significativa disminución en el riesgo para los cánceres invasivos serosas, pero el aumento del riesgo para los tumores borderline seroso (OR = 1,91; IC del 95%: 1,08 a 3,36), borderline mucinoso e invasiva (OR = 1,68, 95% CI 1,00-2,83), y endometrioid tumores (OR = 1,54, IC 95% 1,01 a 2,33). Ajustando por antecedentes familiares de cáncer de mama inicio de ovario o temprano y antecedentes personales de cáncer de mama no cambió las estimaciones para cualquiera de los
MUC1
o
MUC16
polimorfismos.
En el examen el efecto de los polimorfismos de mucina y la supervivencia, se observó una peor supervivencia global entre las mujeres portadoras del alelo variante de
MUC16
polimorfismo rs12984471 (log-rank p = 0,03; Figura 1 a), así como un aumento de la mortalidad (ajustada por la edad HR = 1,23 IC 95%: 1,02 a 1,48, Tabla 3). Estas asociaciones fueron más fuertes en las mujeres mayores de 65 años (log-rank p = 0,02; ajustada por edad HR = 1,53 IC del 95%: 1.7 a 2.19) (Figura 1B). La mortalidad fue del 57% mayor para las mujeres que eran homocigóticos para el alelo variante de rs12984471 (ajustada por edad HR = 1,57 IC del 95%: 1.9 a 2.28). Ajuste por el escenario y la histología atenúa la asociación (HR multivariable = 1,32 IC 95%: 0,91 a 1,92); etapa fue el predictor más fuerte de la supervivencia. No se observaron otras asociaciones entre los polimorfismos de mucina restantes y la supervivencia.
A. B. Todas las mujeres posmenopáusicas mujeres mayores de 65 años.
Por último, se evaluó la asociación entre el
MUC16
polimorfismos y los niveles séricos de CA125 medidos antes de la cirugía (Tabla 4). Entre todos los casos, se observó ninguna asociación lineal entre
MUC16
polimorfismos y CA125 niveles; Sin embargo, rs2121133 tenían los niveles más altos de CA125 de heterocigotos (319,9) y más bajo para las variantes homocigotos (110,0) (p = 0,03). Entre las mujeres posmenopáusicas de edad avanzada, el aumento de los alelos variantes del polimorfismo rs12984471 se asoció significativamente con el aumento de los niveles de CA125 (p = 0,02).
Discusión
El
MUC1 gen
se encuentra en 1q21-22, que es una región alterada con frecuencia en ambos trastornos neoplásicas y no neoplásicas.
MUC1
amplificación del gen debido al aumento del número de copias de genes se ha observado en ovario, mama, tiroides papilar y el cáncer gástrico [17], [18], [19], [20]. células mamarias neoplásicas se ha demostrado que tienen una alta frecuencia de ADN alterado dentro de la región de repetición de nucleótidos variable (VNTR) de MUC1- la región más grande de la esta proteína y el sitio de O-glicosilación [1], [21], [22 ]. MUC1 se ha demostrado ser esencial para la tumorigénesis del cáncer ovárico en modelos de ratón y es sobreexpresado en aproximadamente el 90-100% de los carcinomas serosos [23], [24], [25]. Los tres
MUC1
SNPs estudiados fueron seleccionados en base a las publicaciones anteriores que estudiaron las asociaciones entre los
MUC1
polimorfismos y los cánceres gastrointestinales [26], [27]. rs4072037 polimorfismo se ha correlacionado con los niveles séricos de MUC1 y se sabe que juega un papel en el corte y empalme alternativo [28], [29]. rs2070803 polimorfismo se encuentra aguas arriba de la
MUC1
gen en un bloque LD grande, y rs1045253 polimorfismo fue identificado previamente como un representante de la tagSNP
MUC1
región [30], [31], [ ,,,0],32]. Ninguno de estos tres polimorfismos riesgo o la supervivencia del cáncer de ovario en general afectadas. Las mujeres que eran homocigotos para la variante G alelo de rs2070803 tuvieron una elevación del 35% en el riesgo de cáncer de ovario seroso invasivo. Aunque nuestro hallazgo fue de significación estadística marginal, un estudio japonés encontró riesgo de "difundir" el cáncer gástrico tipo que se incrementa con la posesión del alelo G [31]. En las pruebas que hicimos para la heterogeneidad mediante el tipo histológico de cáncer de ovario, sólo el rs4072037 variado con un mayor riesgo de tipos distintos de serosa invasiva incluyendo especialmente seroso borderline, mucinoso, endometrioide y. En general, todos los tipos histológicos de tumores de ovario epiteliales, tanto benignas como malignas, expresan MUC1 en la superficie celular por inmunohistoquímica [33]. Sin embargo, un estudio reciente utilizando la expresión de genes propuso que la expresión de MUC1 es baja en un subtipo de tumores serosos invasivos [34].
La
MUC16
gen está localizado en 19p13, que se altera en una variedad de los cánceres, especialmente de ovario. En el carcinoma de ovario, 19p13 ha sido identificada como la banda cromosómica más frecuentemente implicado en la reorganización estructural [35], [36]. Esta región también se ha demostrado ser altamente amplificado en el carcinoma seroso de alto grado [37]. Polimorfismos rs12984471, rs1559168, rs2121133 son tagSNPs y fueron seleccionados para este estudio, ya que son representativos de diversas regiones del gen
MUC16
. Los alelos menores de rs12984471 y rs1559168 introducen mutaciones sin sentido, mientras que rs2121133 está dentro de un intrón [38]. rs2547065 polimorfismo fue seleccionado porque se ha estudiado previamente en relación con el cáncer de ovario epitelial [39] e introduce una mutación sin sentido que potencialmente podrían contribuir a una modificación funcional del producto génico. Entre los
MUC16
polimorfismos estudiados, observamos asociaciones entre rs2547065 y el riesgo de cáncer de ovario y entre rs12984471 y la supervivencia.
En un pequeño estudio que examinó dos
MUC16
variantes incluyendo rs2547065 , Bouanene et al. observó que el genotipo CC fue más frecuente en los casos (49%) que en los controles (34%), similar en dirección a lo que hemos observado, pero no significativo en su estudio que incluyó sólo 41 casos y 76 controles [39]. A pesar del hecho de que el genotipo homocigoto variante (CC) del polimorfismo rs2547065 se asoció con el riesgo de cáncer de ovario en general y cáncer de ovario seroso invasiva en los datos del NECC, no fuimos capaces de validar este hallazgo en datos independientes del Estudio de Salud de Enfermeras. Con los resultados positivos de nuestro estudio, resultados de apoyo del único estudio publicado en relación con este SNP, pero los resultados negativos de la NHS, será necesaria la validación y está previsto dentro de la Asociación Consorcio de cáncer de ovario.
MUC16
polimorfismo rs12984471 fue el único SNP asociados con la supervivencia. El alelo variante, que confiere una menor supervivencia entre todos los casos, también se correlaciona con los niveles séricos altos de CA125 en las mujeres posmenopáusicas, especialmente los mayores de 65. La posibilidad de que la asociación entre rs12984471 y la supervivencia puede tener una base biológica se sugiere por la posible consecuencias funcionales de la proteína MUC16. rs12984471 El polimorfismo se encuentra en la subunidad en gran parte no caracterizado extracelular donde la variante C es responsable de un missense conservador mutación cambia un glutamato a un aspartato [38], [40]. cambios de aminoácidos conservadores se teorizan para conferir 40% de probabilidad de modificación de la función de genes en comparación con una mutación silenciosa [41]. Por lo tanto, es plausible que las mutaciones sin sentido causadas por este polimorfismo puede influir en la función de la
MUC16
producto génico según lo sugerido por sus efectos sobre los niveles de CA125 en los casos.
En conclusión, nuestro estudio examinado cuatro SNPs en
MUC16 gratis (CA125) y tres SNPs en
MUC1 gratis (CA15.3) en relación con el riesgo de cáncer de ovario y la supervivencia en el estudio de Nueva Inglaterra de casos y controles. Uno de cada cuatro
MUC16
SNPs, rs2547065, se asoció con un mayor riesgo de cáncer de ovario. Una diversa
MUC16
SNP, rs12984471, se asoció con la supervivencia y también se correlacionó con los niveles séricos de CA125. De los tres
MUC1
SNPs, se ha observado una, rs4072037, que muestra una heterogeneidad significativa según el tipo histológico. Tuvimos la oportunidad de examinar uno de estos hallazgos, rs2547065 con un mayor riesgo, en los datos del Estudio de Salud de Enfermeras. El hallazgo no fue validado plantear la cuestión de azar en la explicación de nuestros hallazgos. Sin embargo, la asociación de rs12984471 en
MUC16
con la supervivencia tiene algún apoyo biológico en el que también se correlaciona con los niveles de CA125. Desde nuestra población de estudio se compone de las mujeres caucásicas principalmente, no fuimos capaces de generalizar nuestros resultados con otros grupos étnicos. Nuestro estudio no debe ser considerada definitiva porque nos centramos SNPs en oposición a la realización de un gen o genoma integral amplia investigación. La evaluación de un conjunto más amplio de etiquetado SNPs está prevista en la Asociación del Cáncer de Ovario Consorcio.
Apoyo a la Información
Métodos S1.
métodos complementarios sobre la edad y clasificación tipo histológico, los modelos estadísticos, y la selección de SNP y genotipado
doi: 10.1371. /journal.pone.0088334.s001 gratis (DOCX)
Agradecimientos
Nos gustaría dar las gracias a los participantes y el personal de las cohortes del NHS y NHSII por sus valiosas contribuciones, así como los siguientes registros de cáncer estatales por su ayuda: aL, AZ, AR, CA, CO, CT, dE, FL , GA, ID, IL, IN, IA, KY, LA, ME, MD, MA, MI, NE, New Hampshire, Nueva Jersey, Nueva York, Carolina del Norte, Dakota del Norte, Ohio, Oklahoma, Oregón, Pensilvania, Rhode Island, SC, TN, TX , VA, WA, WY. Además, este estudio fue aprobado por el Departamento de Comité de Investigaciones Humanos (DPH) Public Health Connecticut. Ciertos datos utilizados en esta publicación se obtuvieron del Departamento de Salud Pública. Los autores asumen la plena responsabilidad de los análisis y la interpretación de estos datos.