Extracto
El cromosoma 8q24 se amplifica comúnmente en muchos tipos de cáncer, especialmente cáncer de pulmón. Los polimorfismos en esta región están asociados con el riesgo de diferentes tipos de cáncer. Para investigar la relación entre los tres polimorfismos de nucleótido único (SNPs) (rs1447295, rs16901979 y rs6983267) en 8q24 y el riesgo de cáncer de pulmón, se realizó un estudio de asociación en dos poblaciones Han chinos: una población de la provincia de Zhejiang (576 pacientes de casos y 576 de control sujetos), mientras que el otro era de la provincia de Fujian (576 pacientes de casos y 576 controles). Se encontró que rs6983267 se asoció significativamente con un mayor riesgo de cáncer de pulmón en ambas poblaciones. En comparación con el genotipo TT, el genotipo GG se asoció con una significativa 1.555 veces más riesgo de cáncer de pulmón [95% intervalo de confianza (IC) 1,218 a 1,986,
P
= 4.0 × 10
-4 ]. Este efecto fue más pronunciado en los no fumadores [odds ratio (OR) = 2,366; IC del 95%: 1,605 a 3,488,
P
= 1,4 × 10
-5]. Los análisis estratificados por la histología reveló que el genotipo GG rs6983267 fue el más asociado con los pacientes con otros tipos histológicos (OR = 3,012; IC del 95%: 1,675 a 5,417,
P
= 2,3 × 10
-4). El genotipo AA de rs1447295 se asoció con un mayor riesgo para el adenocarcinoma en comparación con el genotipo CC (O IC = 2.260, el 95% 1,174-4,353,
P = 0,015
). Por otra parte, el genotipo GG de rs6983267 se asoció con una peor supervivencia en la población de Zhejiang (razón de riesgo (HR) = 1,646; IC del 95%: 1,099 a 2,464,
P = 0,016
). No se observó asociación para rs16901979. Estos resultados sugieren que las variaciones genéticas en 8q24 pueden desempeñar papeles importantes en el desarrollo y progresión del cáncer de pulmón
Visto:. Zhang X, Q Chen, Él C, W Mao, Zhang L, X Xu, et al. (2012) Polimorfismos en 8q24 se asocian con el cáncer de pulmón de riesgo y la supervivencia en los chinos Han. PLoS ONE 7 (7): e41930. doi: 10.1371 /journal.pone.0041930
Editor: Georgina L. Hold, Universidad de Aberdeen, Reino Unido
Recibido: 10 de mayo de 2012; Aceptado: June 29, 2012; Publicado: 27 Julio 2012
Derechos de Autor © 2012 Zhang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo recibió el apoyo de subvención de la Agencia de Ciencia y Tecnología de Taizhou (111ky07-7). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón sigue siendo la principal causa de muerte por cáncer en hombres y mujeres en todo el mundo. En China, el cáncer de pulmón representó 536,407 nuevos casos de cáncer y 475,768 muertes registradas en 2005 [1]. En las últimas décadas, las tasas de incidencia y mortalidad por cáncer de pulmón han aumentado notablemente debido al envejecimiento de la población y el aumento continuo del consumo de tabaco en China [1], [2], [3], [4]. Aunque el consumo de cigarrillos es la causa principal de cáncer de pulmón y contribuye a más de 80% de los casos [5], sólo una pequeña fracción de los fumadores desarrollan cáncer de pulmón. Este hallazgo indica que los factores genéticos también afectan el riesgo de cáncer de pulmón. Aunque se han hecho esfuerzos para identificar los factores genéticos para el cáncer de pulmón, los conocimientos actuales para evaluar el riesgo de cáncer de pulmón sigue siendo limitada
.
Recientemente, algunos estudios de asociación de genoma completo (GWAS) han encontrado que las variantes en el cromosoma 8q24 están relacionados al riesgo de varios tipos de cáncer, incluyendo cáncer de mama, próstata, vejiga, colorrectal, y cáncer de ovario, entre múltiples poblaciones de estudio [6], [7], [8], [9], [10], [11], [12 ], [13], [14], [15], [16], [17]. Además, las variantes en 8q24 se han encontrado para ser asociado con la susceptibilidad a cáncer gastrointestinal superior [18], [19], [20], osteosarcoma [21], cáncer de tiroides [22], [23], [24], y cáncer de cerebro [25]. Esta región abarca aproximadamente 600 kb y se considera como un área de gen-pobre, con relativamente pocos genes predichos, incluyendo DQ486513, CB104826, y DQ515897, así como POU5F1P1 pseudogene. El v-myc proto-oncogén de mielocitomatosis se ha determinado que el gen relacionado con el cáncer más cercana a la región asociada con el cáncer en GWAS homólogo de oncogén viral (aviar) (MYC). potenciadores de la transcripción en esta región se ha demostrado que interactuar físicamente con el promotor MYC [26], [27] y, potencialmente, ser afectados por las variantes asociadas con el cáncer [28].
Tres bloques genómicas adyacentes (1-3 regiones ) en 8q24 se han asociado con el riesgo de cáncer de próstata [29]. Los polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs más significativos) se rs1447295 en la región 1, rs16901979 en la región 2, y rs6983267 en la región 3 [29]. Estos SNP y variantes adicionales 8q24 han sido validados por estudios de asociación posteriores. Además, estos SNPs se han encontrado para ser asociado con otros tipos de cáncer [8], [9], [18], [19], [20], [21], [30]. Puesto que la región 8q24 cromosómico se amplifica comúnmente en tejidos de cáncer de pulmón [31], [32], [33], [34], variantes genéticas en 8q24 puede estar asociado con la susceptibilidad al cáncer de pulmón. Además, SNPs en 8q24 pueden afectar los niveles de expresión de genes relacionados con el cáncer [26], [27], [35], que se cree que desempeñan un papel en la carcinogénesis del cáncer de pulmón. En el presente estudio, se seleccionaron un SNP de cada región para evaluar la posible asociación de estos SNPs con cáncer de pulmón en los chinos Han.
Resultados
Características de la Población
Las características de los pacientes con cáncer de pulmón y los sujetos de control incluidos en este estudio se resumen en la Tabla 1. Más hombres que mujeres fueron incluidos entre los pacientes de casos y controles, pero las diferencias de sexo entre estos grupos no fueron significativas (
P Hotel & gt ; 0,05), lo que sugiere su coincidencia adecuada. La edad media de la población era de 58,2 años, y no se encontraron diferencias significativas en la edad entre los controles y los pacientes con cáncer de pulmón (
P Hotel & gt; 0,05). el tipo histológico de cáncer de pulmón entre los dos grupos de pacientes no difirió significativamente (
P Hotel & gt; 0,05), pero no se detectaron diferencias significativas en el estadio y el grado (todo el
P Hotel & lt; 0,05).
Asociación análisis de rs1447295, rs16901979 y rs6983267 en 8q24
las distribuciones de genotipo de los SNPs rs1447295, rs6983267 y rs16901979, estaban en equilibrio de Hardy-Weinberg (HWE) en ambos casos y controles. En el equipo de prueba, la frecuencia de la rs6983267 genotipo GG fue notablemente mayor en los pacientes con cáncer de pulmón (24,9%) que en los controles (20,5%) (Tabla 2). El genotipo GG se asoció con una [= 1,532, intervalo de odds ratio (OR) 95% de confianza (IC) 1,090 a 2,153,
P = 0,014
] modestamente mayor riesgo. Del mismo modo, en el conjunto de validación, el genotipo rs6983267 GG se asoció con un aumento de 1.591 veces en el riesgo de cáncer de pulmón (
P
= 0,010). Aunque no es estadísticamente significativa, el genotipo rs6983267 GT también aumenta el riesgo de cáncer de pulmón (
P = 0,062
). Sin embargo, no hubo diferencias significativas entre los dos SNPs restantes (rs1447295 y rs16901979) y el cáncer de pulmón en ambas poblaciones. El análisis agrupado final mostró que el genotipo GG rs6983267 (OR = 1,555; IC del 95% = 1,218 a 1,986,
P
= 4.0 × 10
-4) y el genotipo GT (OR = 1,311, 95% CI = 1,066 a 1,613,
P
= 0,01) se asociaron con un aumento significativo del riesgo de cáncer de pulmón. Después se combinaron los genotipos GG y GT, la diferencia se mantuvo estadísticamente significativa (OR = 1,386; IC del 95% = 1,141 a 1,684,
P
= 0,001). Por otra parte, las asociaciones siguieron siendo significativas incluso después de la corrección de Bonferroni (es decir,
P Hotel & lt; 0,05 /3 = 0,0167).
Los análisis estratificados por la histología utilizando conjuntos agrupados de casos y controles mostraron que el genotipo AA rs1447295, así como la GG rs6983267 y genotipos GT se asociaron con un aumento débil pero significativa en el riesgo de adenocarcinoma ajustado por edad, sexo y tabaquismo (OR = 2,260; IC del 95%: 1,174 a 4,353,
P = 0,015
; OR = 1,330, IC 95% 1,003-1,763,
P = 0,048
; OR = 1,327, IC 95% 1,049-1,679,
P = 0,018
, respectivamente) (Tabla 3). El genotipo GG rs6983267 se asoció con el riesgo de carcinoma de células escamosas (OR = 1,775, 95%
IC
1,201 a 2,625,
P
= 0,004). Además, los individuos con el genotipo GG rs6983267 o GT fueron significativamente al aumento de riesgo de otros tipos de cáncer de pulmón (OR = 3,012; IC del 95%: 1,675 a 5,417,
P
= 2,3 × 10
-4 ; OR = 1,986; IC del 95%: 1,157 a 3,408,
P = 0,013
, respectivamente), incluyendo el carcinoma adenoescamosa y carcinoma indiferenciado. Sin embargo, no se observó asociación para rs16901979.
Además, examinó la asociación entre los tres SNP y el cáncer de pulmón estratificados por la conducta de fumar en todos los individuos (Tabla 4). El genotipo GG rs6983267 se asoció significativamente con un mayor riesgo de cáncer de pulmón en los no fumadores, pero no se observó ninguna asociación de antiguos y actuales fumadores. Por otra parte, hubo una diferencia leve pero significativa en la frecuencia de rs6983267 genotipo GT entre los casos y controles en los actuales fumadores (OR = 1,446; IC del 95%: 1,032 a 2,027,
P = 0,032)
. Sin embargo, no hubo interacción significativa entre el consumo de tabaco y el genotipo en la susceptibilidad al cáncer de pulmón. Dado que el número de ex fumadores en este estudio fue pequeño y la frecuencia del genotipo AA rs1447295 fue baja, se combinaron los grupos de AA y de los genotipos de CA en una sola. El análisis logístico reveló que AA y AC combinado tenía un menor riesgo de cáncer de pulmón que el genotipo CC (OR = 0,478, IC 95% 0,254-0,898,
P = 0,022
). No se observó ninguna otra asociación significativa entre rs16901979 y el riesgo de cáncer de pulmón, estratificada por el consumo de tabaco.
Asociación de rs1447295, rs16901979 y rs6983267 con la supervivencia
Se incluyeron todos los pacientes con cáncer de pulmón en el análisis de supervivencia. Para rs6983267, se observó una asociación con la supervivencia del cáncer de pulmón en la población Zhejiang. Los individuos con el genotipo GG tenían un tiempo medio de supervivencia (MST) de 17,6 meses, aquellos con el genotipo GT tenido un MST de 18,6 meses, y aquellos con el genotipo TT tenido un MST de 24,4 meses (log-rank test,
P
= 0,036) (Figura 1A). En el modelo de riesgos proporcionales de Cox, se encontró que la razón de riesgo (HR) fue significativamente mayor para los individuos con el genotipo GG en comparación con aquellos con el genotipo TT después de ajustar por edad, sexo, tabaquismo, estadio tumoral, histología y el grado histológico ( HR = 1,646; IC del 95%: 1,099 a 2,464,
P = 0,016
) (Tabla 5). La supervivencia era pobre, especialmente para los pacientes con tumores en estadio III o IV (HR = 1,993; IC del 95%: 1,128 a 3,521,
P = 0,018
) (Figura 1B). Ningún otro SNP se encuentra asociado con la supervivencia. No se encontró asociación con la supervivencia en la población de Fujian se observó
A:. Todas las pacientes con cáncer de pulmón. B:. Pacientes con tumores en estadio III-IV
Discusión
En el presente estudio, se examinó si los SNPs en el cromosoma 8q24 relacionados con la susceptibilidad a la mama, próstata, vejiga , colorrectal, de tiroides y cáncer de ovario [6], [7], [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16 ], [23] también están asociados con el riesgo de cáncer de pulmón en la población china Han. Se encontró que el genotipo GG de rs6983267 se asoció significativamente con un mayor riesgo de cáncer de pulmón y la disminución de la supervivencia en los chinos Han.
8q24 aberración es un evento frecuente en el cáncer de pulmón [31], [32], [33] , [34]. MYC, localizado en 8q24.1, es un oncogén bien establecida implicado en el crecimiento celular, la proliferación, diferenciación y apoptosis. sobreexpresión desregulada de MYC es responsable de una amplia gama de cánceres humanos. El rs6983267 se encuentra 335 kb aguas arriba del gen myc. Estudios recientes han demostrado que los mapas rs6983267 a factor de transcripción 7-2 como motivo y formas interacciones de largo alcance (TCF7L2) con MYC [27], [36]. En comparación con el alelo T de rs6983267, el alelo G se ha informado que tienen de unión in vitro e in vivo TCF7L2 más fuerte y para mejorar la actividad de Wnt [36], [37]. Además, muchos estudios han demostrado que el genotipo GG de rs6983267 se asocia con un riesgo significativamente mayor de varios tipos de cáncer [9], [30], [38]. Park et al. [20] informó de ninguna asociación entre rs6983267 (OR = 1,02,
P
= 0,80) y el cáncer de pulmón, pero se encontró que el genotipo GG aumentó el riesgo de cáncer de pulmón en los fumadores nunca (OR = 1,45,
P = 0,024
). Wokolorczyk et al. [38] examinó 738 pacientes con cáncer de pulmón y 1910 sujetos de control y se encontró que el genotipo GG rs6983267 no se asoció significativamente con el riesgo de cáncer de pulmón en comparación con el genotipo TT (OR = 0,98,
P
= 0,9). Sin embargo, esta asociación no se ha evaluado en chino. En este estudio se analizaron tres SNPs (rs1447295, rs16901979 y rs6983267) y encontramos que sólo rs6983267 se asoció significativamente con un mayor riesgo de cáncer de pulmón en los chinos Han. Estos resultados fueron diferentes de los estudios previos en los que no hubo correlaciones significativas entre rs6983267 y el cáncer de pulmón [20], [38]. Dado que el efecto de un gen de susceptibilidad baja penetrancia en el riesgo de enfermedad puede ser modificado por otros genes, así como por factores ambientales, las diferencias étnicas en las bases genéticas y diferentes factores de riesgo que podrían explicar, en cierta medida, los resultados discrepantes. Además, rs6983267 se asoció significativamente más con otros tipos histológicos de cáncer de pulmón, seguido por el carcinoma de células escamosas, y débil pero significativamente asociado con adenocarcinoma. Estos resultados indican que pueden existir diferentes mecanismos en la patogénesis molecular de los diferentes tipos histológicos de cáncer de pulmón.
La exposición a carcinógenos del tabaco puede inducir daño en el DNA grave y por lo tanto promover la formación de tumor. En este estudio, se encontró que el aumento del riesgo de cáncer de pulmón con el genotipo GG rs6983267 fue más pronunciado entre los no fumadores, mientras que no se encontraron correlaciones significativas en current- y los ex-fumadores. Una posible explicación de esto es que los no fumadores pueden ser más propensos a haber estado expuestos a factores de riesgo desconocidos asociados con el cáncer de pulmón, como los contaminantes ambientales. Pueden existir diferentes mecanismos de carcinogénesis entre no fumadores y current- /former-. Nuestro resultado es diferente del anterior estudio, en el que rs6983267 GG fue un factor de riesgo en vez fumador [20]. Las diferentes poblaciones de estudio y enfoques analíticos podría ser responsable de los resultados contradictorios. Además, se encontró una asociación significativa del alelo A de rs1447295 con un bajo riesgo de cáncer de pulmón en los ex-fumadores. Sin embargo, Park et al encontró que este alelo se asoció con un mayor riesgo de cáncer de hígado en nunca fumadores [20]. Dado que el número de ex fumadores en esta población era muy pequeña para un estudio de asociación de casos y controles, nuestros hallazgos sobre el alelo A de rs1447295 tienen más probabilidades de falso positivo debido a las múltiples comparaciones. Se debe tener precaución en la interpretación de este resultado a pesar de que es estadísticamente significativa. Se necesitan más estudios con mayor número de sujetos para confirmar estos hallazgos.
myc amplificación se ha demostrado que se correlaciona con mal pronóstico de los pacientes con cáncer de pulmón [31], [32], [34]. Desde los rs6983267 alelo G del riesgo se ha demostrado que tienen una afinidad más fuerte para TCF7L2 y puede inducir la expresión mejorada MYC [27], [36], rs6983267 podría estar asociado con la supervivencia en pacientes con cáncer de pulmón. En este estudio, se encontró que rs6983267 genotipo GG se asoció con una peor supervivencia notablemente en la población de Zhejiang. Este efecto fue más pronunciado en pacientes con estadio III o IV del tumor. Este resultado está de acuerdo con las consecuencias funcionales de este polimorfismo. Por el contrario, no se encontró asociación entre rs6983267 y la supervivencia en la población de Fujian. Parte de esta disparidad puede explicarse por los porcentajes distintos de estadio de la enfermedad y el grado histológico, así como los diferentes enfoques de tratamiento utilizados. Cicek et al. examinó 393 pacientes con cáncer de colon y no encontró ninguna asociación entre rs6983267 y la supervivencia [39]. Sin embargo, Dai et al. examinado 170 pacientes con cáncer colorrectal y se encontró que el alelo T se asoció a peor supervivencia [40]. Estos resultados sugieren que puede existir una relación más compleja o específicos de tumor. A medida que nuestro estudio se limitó a los chinos Han con el cáncer de pulmón, los resultados pueden no ser generalizables a otras etnias. Además, el tamaño de la muestra para el análisis de supervivencia fue relativamente pequeño, lo que provocó con ello una interpretación cautelosa de los resultados. La investigación adicional en un grupo de población más grande es necesario aclarar esta relación.
En resumen, los resultados de nuestro estudio sugieren que los SNPs en 8q24 están asociados con la susceptibilidad al cáncer de pulmón en los chinos Han. Además, rs6983267 genotipo GG se asoció con una pobre supervivencia en la población de Zhejiang. Para nuestro conocimiento, este es el primer estudio que investigó las posibles asociaciones entre SNPs en 8q24 y cáncer de pulmón en una población del este de China. grandes estudios adicionales están garantizados para mejorar nuestra comprensión de las contribuciones de los factores genéticos en el cáncer de pulmón.
Materiales y Métodos
Los sujetos
En este estudio, hemos realizado un estudio de asociación en dos conjuntos independientes de los sujetos. El equipo de prueba incluyó 548 pacientes con cáncer de pulmón y 556 sujetos de control. Los casos de pacientes tenían un diagnóstico confirmado de cáncer de pulmón en la histología y fueron reclutados en el Hospital Central de Taizhou, Zhejiang, entre 2003 y 2010. Los sujetos control sin cáncer fueron los visitantes del hospital que llegaron a la clínica para un examen de salud de chequeo anual entre 2007 y 2010. El conjunto de validación consistió en 453 pacientes con cáncer de pulmón y 507 sujetos de control de la provincia de Fujian. Los pacientes de casos fueron pacientes consecutivos con diagnóstico histológico de cáncer de pulmón matriculados del Hospital Fuzhou pulmonar entre 2008 y 2010. El control de los sujetos eran individuos libres de cáncer seleccionados de un grupo de voluntarios sanos que visitaron el hospital durante el período de 2008-2010. Los datos epidemiológicos se recogieron por entrevistadores entrenados que no eran conscientes de las asignaciones a los grupos utilizando un cuestionario estandarizado específico para obtener información detallada sobre los participantes factores demográficos, hábitos personales, historial médico, antecedentes familiares de cáncer, así como la historia de la exposición ocupacional y ambiental . Los sujetos del estudio fueron clasificados en tres grupos en función de su consumo de tabaco. Los no fumadores fueron los que indicaron que habían fumado menos de 100 cigarrillos en su vida y no eran fumadores actuales. Los fumadores fueron clasificados en ex fumadores y los fumadores actuales. Los ex fumadores fueron los que informaron de fumar al menos 100 cigarrillos durante su vida y que no eran fumadores actuales, mientras que los actuales fumadores fueron los que informaron de que todavía estaban fumando en el momento de su diagnóstico de cáncer de pulmón. Las personas que se sabe que tienen una historia familiar de cáncer, se excluyeron los antecedentes de cualquier tipo de cáncer aparte del cáncer de pulmón, el cáncer o metástasis de otros orígenes o desconocidos. Los sujetos control fueron emparejados a los pacientes de casos basados en el sexo y la edad (± 5 años). Todos los casos de pacientes y sujetos control no estaban relacionados étnicos chinos Han. Este estudio fue aprobado por los comités de ética del Hospital Central de Taizhou y el Hospital de Fuzhou pulmonar, y el consentimiento informado por escrito se obtuvo de todos los participantes antes de entrar en el estudio
.
Nuestro punto final fue la supervivencia global desde el diagnóstico histológico inicial. Los pacientes que estaban vivos o perdidos durante el seguimiento fueron censurados en la fecha del último contacto. Los que murieron de otras causas fueron censurados en la fecha de su muerte. Por otra parte, los pacientes perdidos durante el seguimiento en el primer año fueron excluidos del análisis.
Genotipado
Las muestras de sangre se obtuvieron de todos los participantes en el estudio. ADN genómico fue extraído por medio de ADN genómico universal Kit de Extracción versión 3.0 (Takara, Dalian, China) de acuerdo con el protocolo del fabricante, y las muestras de ADN se almacenaron a -20 ° C.
Hemos seleccionado el más fuerte de una sola asociación de SNPs de cada región cromosómica: rs1447295 de la región 1, rs16901979 de la región 2, y rs6983267 de la región 3. La genotipificación se realizó por el método de reacción de polimerasa en cadena de detección de la reacción de ligación (PCR-LDR). Los cebadores fueron diseñados por el software del Primer 3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/input.htm). Los tres pares de cebadores son los siguientes: 1) rs1447295: 5'-GCCTACGCCTACTCCTGGTCT-3 '(hacia delante) y 5'-CTCCCAGATTTTCCCATACCC-3' (hacia atrás); 2) rs16901979: 5'-AGTGTGGGGTCTTTGTTGTGG-3 '(hacia delante) y 5'-CAGCAGTCTCCCTGTCTTTGG-3' (hacia atrás); 3) rs6983267: 5'-ATGAAGGCGTCGTCCAAATGA -3 '(hacia delante) y 5'-TTGGCTGGCACTGTCTGTATA -3' (inverso). Las reacciones de amplificación se llevaron a cabo en un volumen final de reacción de 15 l que contienen 0,3 mmol /L de cada trifosfato de desoxinucleósido, 10 mmol /L de Tris-HCl, 50 mmol /L KCl, 2 mmol /L de MgCl2, solución de Q 20% (Qiagen, Hilden, Alemania), 0,16 mol /L de cada cebador, 10 ng de ADN genómico, y 1 U Taq (Takara, Dalian, china). Los parámetros de ciclación fueron: 94 ° C durante 3 min, seguido de 10 ciclos de 94 ° C durante 30 s, 64 ° C durante 30 s con un C decremento 0,5 ° de la temperatura de recocido por ciclo y 72 ° C durante 30 s, seguido por 30 ciclos de 94 ° C durante 30 s, 59 ° C durante 30 s y 72 ° C durante 30 s, y un paso de extensión final a 72 ° C durante 5 min. Después de la amplificación, los productos PCR fueron incubadas con 2 U phosophatase alcalina de gamba (Fermentas, Vilnius, Lituania) y 4 U de exonucleasa I (Fermentas, Vilnius, Lituania) a 37 ° C durante 1 h, y luego desnaturalizados a 95 ° C durante 10 minutos .
Los cebadores LDR fueron: 1) rs1447295: 5'-GTGCCATTGGGGAGGTATGTAAAAA-3 '(Un cebador específico), 5'-TTTGTGCCATTGGGGAGGTATGTAAAAC-3' (cebador específico C) y 5'-GTGCTATGGAAAAAAAGCAACAGGA-FAM-3 '(FAM común cebador marcado extremo 3'); 2) rs16901979: 5'-TTTTTGTTAATGATTTAGCATTACTTATA-3 '(A cebador específico), 5'-TTTTTTTTGTTAATGATTTAGCATTACTTATC-3' (cebador específico C) y 5'-TCTGGCAAATGGTATTTTTGAGATATTT-FAM-3 '(FAM común cebador marcado extremo 3'); 3) rs6983267: 5'-TTTTTTTTTCCTTTGAGCTCAGCAGATGAAAGG-3 '(cebador específico G), 5'-TTTTTTTTTTTTCCTTTGAGCTCAGCAGATGAAAGT-3' (T cebador específico) y 5'-CACTGAGAAAAGTACAAAGAATTTTTTTTTTT-FAM-3 '(FAM común cebador marcado extremo 3'). Una mezcla que contiene 7,5 pmol de cada cebador FAM común LDR marcado se fosforila en una mezcla de reacción de quinasa 15-l que contiene 1 x tampón de ligasa T4 y 10 U de quinasa de T4 (Takara, Dalian, China). La mezcla se incubó a 37 ° C durante 1 h, seguido de 10 min a 65 ° C y el almacenamiento a 4 ° C. LDRs se llevaron a cabo en un volumen final de 20 l incluyendo 9 l de producto de PCR purificado, 1 x tampón de ADN ligasa Taq, 250 fmol de cada cebador LDR, 8 U Taq ADN ligasa (New England Biolabs, Beverly, Mass, EE.UU.). Los parámetros LDR fueron las siguientes: 30 ciclos de 30 s a 94 ° C y 4 minutos a 55 ° C. Los productos se analizaron en LDR ABI 3730 analizador de ADN (Applied Biosystems, CA, EE.UU.).
noventa y seis seleccionados al azar muestras fueron reevaluados por secuenciación de ADN para confirmar la exactitud del método de genotipificación reacción de detección PCR-ligación, la cuyos resultados fueron consistentes con los genotipos identificados por secuenciación directa. Además, 96 muestras seleccionadas al azar fueron genotipo por duplicado y se obtuvieron los mismos resultados (100% de reproducibilidad).
El análisis estadístico
Las medias de las variables cuantitativas se compararon mediante Estudiante de
t
prueba. Se utilizó la prueba de Chi-cuadrado exacto de Fisher para comparar variables categóricas entre los pacientes de casos y controles. HWE se calculó mediante la prueba de Chi-cuadrado de bondad de ajuste en ambos grupos de pacientes y de control. Corrección de múltiples ensayos se llevó a cabo utilizando el método de Bonferroni. Para evaluar la relación entre los 3 SNP y el riesgo de cáncer de pulmón, las RUP y su IC del 95% se calcularon mediante análisis de regresión logística multivariante, ajustado por edad, sexo y tabaquismo, para evaluar la relación entre cada uno de los tres SNP y el riesgo de cáncer de pulmón. El análisis de supervivencia se realizó mediante el método de Kaplan-Meier con la prueba de log-rank. Cox modelos de riesgos proporcionales también se utilizaron para ajustar por edad, sexo, tabaquismo, estadio tumoral, la histología y el grado histológico.
P Hotel & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo. Todas las pruebas fueron de dos caras, y todos los análisis estadísticos se realizaron con SPSS 17,0 paquete de software (SPSS Inc, Chicago, EE.UU.).