Extracto
A pesar de ser una vitamina esencial, ácido fólico se ha implicado para mejorar tumoral crecimiento, como lo demuestran los informes sobre la sobreexpresión del receptor de folato alfa (FRα) en carcinomas. La función de otro transportador de folato, portadora reducida de folato (RFC), es en gran parte desconocida. En este estudio se investigó el papel de los folatos, FRα y RFC en los cánceres de ovario. Hemos demostrado FRα ARNm y la sobreexpresión de la proteína y la reducción de la expresión RFC en asociación con la amplificación del gen FRα y promotor hipermetilación RFC, respectivamente. FRα sobreexpresión se asocia con la progresión tumoral mientras que la expresión RFC incurrió en un resultado clínico favorable. Tal patrón de expresión recíproca también se observó en líneas celulares de cáncer de ovario. El folato se muestra para promover la proliferación de células cancerosas, la migración y la invasión
in vitro
, y regular a la baja la expresión de E-cadherina. Este efecto fue bloqueado después de que cualquiera caída estable de FRα o sobreexpresión ectópica de RFC. Este fenómeno hasta ahora no declarada sugiere que, RFC puede servir como un socio de equilibrio de FRα y conferir un efecto protector en los pacientes con altos carcinomas de ovario FRα-expresión, como se evidencia por sus supervivencias prolongadas global y libre de enfermedad. En conclusión, nos informe sobre el impacto paradójico de FRα (putativo oncogénico) y RFC (supresor tumoral putativo) en tumores malignos humanos. FRα y RFC pueden potencialmente ser explorados como objetivo terapéutico o marcador pronóstico, respectivamente. Recomendamos precaución y la investigación adicional sobre los suplementos de folato en pacientes con cáncer
Visto:. Siu MKY, DSH Kong, Chan HY, Wong ESY, Ip PPC, Jiang L, et al. (2012) Por paradójico impacto de dos receptores de folato, FRα y RFC, en cáncer de ovario: efecto sobre la proliferación celular, invasión y el resultado clínico. PLoS ONE 7 (11): e47201. doi: 10.1371 /journal.pone.0047201
Editor: Ming Tat Ling, Universidad de Tecnología de Queensland, Australia |
Recibido: 1 de junio de 2012; Aceptado 10 de septiembre de 2012; Publicado: 7 Noviembre 2012
Derechos de Autor © 2012 Siu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por fondos del Instituto americano para la Investigación del cáncer del Premio post-doctoral y la Universidad de capital semilla Hong Kong, y la Conferencia y la Beca de Investigación de la Universidad de Hong Kong. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
carcinomas de ovario representan la mortalidad más alta entre todos los cánceres ginecológicos en el mundo [1], [2]. Si bien la incidencia de carcinomas de ovario varía entre los diferentes grupos étnicos, su incidencia en los países asiáticos es una tendencia creciente [3], [4]. Las razones de esto permanecen en gran parte desconocida o controversial. Varios factores de riesgo del estilo de vida han sido implicados. Estos incluyen la dieta, la obesidad, la fertilidad y los estados de paridad. Por otro lado, se ha convertido en una creencia general de que el alto consumo de micronutrientes tales como el ácido fólico, la vitamina C, la vitamina E puede proteger contra el cáncer [5]. Por lo tanto, una mejor comprensión de los efectos de los elementos nutricionales en la carcinogénesis es importante para mejorar las estrategias de prevención y tratamiento del cáncer.
El folato es una vitamina B soluble en agua que se encuentra en la mayoría de los vehículos. Una alta ingesta de folato en la dieta se ha informado a asociarse con un riesgo menor de desarrollar cáncer de ovario, en particular, los que consumen alcohol [6], [7], [8], [9]. Está estrechamente relacionado con su función en la síntesis de ADN y su implicación en la vía metabólica de metionina relacionado esencial para la metilación del ADN. La deficiencia de ácido fólico por lo tanto conduce a la hipometilación del ADN, la expresión del gen alterado y la incorporación errónea de uracilo en el ADN, lo que lleva a daño en los cromosomas, todos los cuales son factores clave para la carcinogénesis [10], [11]. Parecería que el ácido fólico es una importante vitamina esencial en el funcionamiento normal de las células, y para impedir la iniciación del cáncer. Sin embargo, cada vez hay más pruebas que demuestran que el ácido fólico puede de hecho mejorar la progresión del cáncer en los carcinomas establecidos de colon y recto, mama y próstata [12], [13], [14].
absorción de folato implica varios transportistas , tales como los receptores de folato, y portador de folato reducido (RFC) [15], [16]. alfa receptor de folato (FRα), una proteína de membrana anclada-glicosil-fosfatidilinositol sola cadena, aumenta la absorción de ácido fólico a través de endocitosis. Su sobreexpresión se ha informado en los cánceres de ovario, lo que implica que puede promover el crecimiento del tumor [17], [18], [19], [20]. RFC es un transportador de expresión ubicua de los folatos naturales y antifolatos clásicos, y puede controlar la absorción de folato de una manera bidireccional [16]. Se encontró pérdida de RFC con los efectos posteriores de la deficiencia de folato para promover la progresión del cáncer en el cáncer colorrectal [16], [21]. Por tanto, sería lógico suponer que estos dos transportadores de folato, FRα y RFC, ejercen diferentes efectos en la progresión del cáncer.
Aunque se ha establecido la sobreexpresión de FRα en los cánceres de ovario, el estado de expresión y los papeles funcionales de RFC permanecen en gran parte desconocido. En este estudio, se determinó la expresión perfiles, genéticos y epigenéticos de FRα y RFC en el epitelio normal del ovario y cáncer de ovario, y se correlacionó con parámetros clínico. También se evaluaron sus roles funcionales y posibles objetivos de abajo sobre la proliferación celular, la migración y la invasión en relación con folato en el cáncer de ovario. Hemos tratado de comprender mejor las funciones de ácido fólico y sus transportadores en la carcinogénesis de ovario, y explorar los posibles efectos de la ingesta de folato en pacientes con cáncer.
Materiales y Métodos
Las muestras clínicas y líneas celulares
ciento cincuenta y tres muestras fijadas en formalina y embebidos en parafina de los tumores de ovario, incluyendo 11 quistes de inclusión /cistoadenomas benignos (22-63 años, edad media, 50 años), 19 tumores borderline (20~46 años, con una media de edad , 30 años), 83 carcinomas (34 a 83 años, con una media de 51 años) de los diferentes subtipos histológicos y 44 correspondientes focos metastásicos (Tabla 1), se recogieron en el Departamento de Patología, hospital Queen Mary, de la Universidad de Hong Kong. Todos los pacientes fueron sometidos a cirugía y 67 pacientes con cáncer de ovario fueron también tratados con quimioterapia incluyendo platino /paclitaxel. El período de seguimiento varió desde cinco hasta 209 meses (media 63 meses). También se recuperaron treinta y tres muestras clínicas seleccionadas al azar de los tumores de ovario y sus homólogos normales correspondientes, incluyendo las trompas de Falopio y /o los ovarios contralaterales, con bloques congelados disponibles. Se obtuvo el consentimiento de todos los pacientes y el uso de estas muestras clínicas fue aprobado por Junta Institucional de la Universidad de Hong Kong /Hospital de Hong Kong Autoridad West Cluster (HKU /HA HKW IRB) (número Junta de Revisión Institucional: UW10-129) Comentario . Hematoxilina eosina secciones de los bloques congelados de cada muestra fueron revisados por dos de nosotros (ANYC y ICPP) para confirmar el diagnóstico y para asegurar que más de 80% las células tumorales estaban presentes en los bloques tumorales.
Dos líneas inmortalizadas de células epiteliales de ovario, la manguera y la manguera de 6-3 17-1, y nueve líneas celulares de cáncer de ovario, Skov-3, OVCAR-3, Ovča 420, OVCA433, OC316, Dov13, ES-2, TOV21G, SW626 (ATCC; Manassas, VA). se cultivaron como se ha descrito anteriormente [22], [23]
-PCR en tiempo real (qPCR)
El ARN total a partir de muestras clínicas congeladas y líneas celulares de cáncer era extraído utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen). la contaminación de ADN genómico se eliminó por tratamiento con tratamiento DNasa I (Invitrogen). 2,5 g ARN total fue inverso transcrito por la transcriptasa inversa Superscript (Invitrogen, San Diego, CA). El ADN genómico fue extraído mediante fenol /cloroformo (Invitrogen). qPCR se realizó con ABI Prism 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA) como se describe [22], [23], [24]. Las secuencias de cebador para la evaluación de la expresión de ARNm de FRα, RFC y GAPDH (como control interno) fueron los siguientes: sentido FRα, 5'-AAGTGCGCAGTGGGAGCT -3 ', y antisentido, 5'-CATTGCACAGAACAGTGGGTG -3'; RFC sentido, 5'-CGAAACCTCGGCTTCGGAGC 3 'y antisentido, 5'-GCACGTAGTAGACCACCAGG -3'; GAPDH sentido, 5'-TCCATGACAACTTTGGTATCGTG 3 'y antisentido, 5'-ACAGTCTTCTGGGTGGCAGTG -3'. La pureza de la PCR se confirmó mediante electroforesis en gel. Las secuencias de cebador (sentido, 5 'GTATGCATGGCTTCCTGCAGG 3', y antisentido, 5 'ACTTGTTAAACCCTGTAGAGAGG -3') para la evaluación de FRα número de copias de genes se diseñaron basándose en la secuencia genómica del intrón 3 y el intrón 4 de FRα (base de datos Ensemble). TRAT1 se utilizó como gen de referencia [25]. muestras de cáncer de ovario que tienen ≥ aumento de dos veces de sus homólogos normales correspondientes se consideraron como positivos para la amplificación del gen FRα.
Immunoblotting
Se recogieron las células con tampón de lisis (0,125 M Tris, pH 6,8 a 22 ° C que contiene 1% NP-40 (v /v), EDTA 2 mM, 2 mM de N-etilmaleimida, PMSF 2 mM, ortovanadato 1 mM de sodio y 0,1 mM okadate de sodio] y se aclaró por centrifugación a 4 ° C. Protein concentración se determinó por DC (detergente compatible) de ensayo de proteínas (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) 20 g de proteína se resolvió mediante SDS-PAGE, se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno, y se hibridó con anticuerpos específicos para FRα (1:1000.; Alexis bioquímicos, San Diego, CA; ALX-804-439), RFC (1:1000; Affinity BioReagents; Golden, CO; PA1-9553), E-cadherina (1:5000; Biosciences BD; Palo Alto, CA; 610182 ), y la actina (1:1000; Sigma, St. Louis, MO;. A5060) y anticuerpos secundarios apropiados (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) Las transferencias fueron desarrolladas por quimioluminiscencia (ECL) Plus sistema de detección (Amersham, Arlington Heights, Reino Unido), y se visualizó con película de rayos X (Grupo Galeno Médico, Chattanooga, TN) [22], [23], [24].
la inmunohistoquímica
la tinción inmunohistoquímica fue realizado como se describe en los informes anteriores [22], [23], [24]. Para FRα inmunohistoquímica, las secciones de parafina fueron tratados con el anticuerpo del receptor de cabra anti-folato conjugado con peroxidasa de rábano picante (1:200; Abcam, Cambridge, MA; ab20572). Puesto que el anticuerpo anti-FRα de Alexis bioquímicos utilizados para inmunotransferencia no tuvo resultado satisfactorio en la inmunotinción utilizando secciones de parafina, se utilizó otro anticuerpo de Abcam. A pesar de que este anticuerpo puede reconocer otras isoformas de FR, se reportaron las isoformas beta y gamme de FR que se expresa predominantemente en la placenta y las células hematopoyéticas, pero no en otros tejidos [26], [27]. Por tanto, este anticuerpo puede utilizarse para detectar FRα inmunoreactividad en los cánceres de ovario. Para RFC inmunohistoquímica, anticuerpos contra RFC pollo (1:200; Affinity Bioreagents) se aplicó, seguido de biotina-conejo IgG anti-pollo (H + L). peróxido de 3-diaminobencidina-hidrógeno se utilizó como cromógeno. Se llevó a cabo la recuperación de antígeno de microondas usando tampón de citrato (pH 6,0). La omisión o sustitución del anticuerpo primario con suero IgG preinmune fue utilizado como un control negativo. Intensidad en las células epiteliales teñidas se puntuó como 0 (negativo), 1 (leve), 2 (moderada), y 3 (fuerte). El porcentaje de células teñidas se calificó como 0 (& lt; 5%), 1 (5% -25%), 2 (26% -50%), 3 (51% -75%) y 4 (& gt; 75%) . La inmunorreactividad se evaluó mediante la multiplicación de la intensidad de la tinción por el porcentaje de células teñidas para dar un material compuesto un compuesto "Histoscore" [22], [23]. Los niveles altos y bajos de FRα y RFC fueron definidos por "HistoScores" cortados en medio.
La desmetilación tratamiento
Skov-3 y OVCA420 células fueron tratadas con 0, 5 ó 10 mM 5- aza-2 'desoxicitidina (5-aza-DC, un inhibidor de la metilación del ADN) durante 72 horas [28]. Las células de control se trataron con un volumen igual de dimetilsulfóxido (DMSO). El ARN total se extrajo de las células. La actividad de transcripción de la RFC se determinó por qPCR.
preparación de ADN, el tratamiento con bisulfito y PCR (MSP) Análisis
El ADN genómico específica de metilación de las muestras clínicas congeladas se extrajo usando fenol /cloroformo. tratamiento con bisulfito se realizó tal como se describe [28]. Cebadores específicos para la metilado (sentido, 5'-TTCGTCGTAGTTTGCGAATG 3 'y antisentido, 5'-CAACACGTACCTAAACGCGA -3') y no metilado (de sentido, 5'-TTTGTTGTAGTTTGTGAATGG 3 'y antisentido, 5'-3' ACAACACATACCTAAACACAA ) fueron reportados promotor RFC Una anteriormente [29]. La temperatura de hibridación fue 52 ° C y 56 ° C para el promotor metilado y no metilado A respectivamente. productos MSP se detectaron por electroforesis en gel de agarosa al 2% con tinción con bromuro de etidio. ADN de linfocitos normal metilado con metiltransferasa SSSL se utilizó como control positivo. espacios en blanco de ADN y agua genómicas no tratados sin DNA se utilizaron como controles negativos.
caída estable de FRα, la sobreexpresión ectópica de RFC y el tratamiento de folato en SKOV-3
SKOV-3, una célula de cáncer de ovario consonancia con relativamente alta y baja expresión FRα RFC, se utilizó. Para desmontables estable FRα, las células fueron transfectadas con un conjunto de shRNA construye contra FRα humana, PRS-sh FRα (Origene, Rockville, MD), seleccionada con puromicina (1,5 mg /ml) [22], [23], [24] . El vector pRS se utilizó como controles. Para RFC sobreexpresan transitoria, pcDNA3-RFC plásmido (proporcionado amablemente por el Prof. L Matherly, Michigan Cancer Foundation) y el vector pcDNA3 vacío (control) se transfectó en control de SKOV 3-células utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) [22], [23] , [24]. Las células se cultivaron en medio 199 (Invitrogen) /MCDB 105 (Sigma) que contenía ácido fólico 22,7 nM y suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) (JRH Biosciences, Lenexa, KS) [22], [23]. células shFRα y células que sobreexpresan RFC (2 días después de la transfección) fueron pretratadas con libre de folato medio RPMI 1640 (Invitrogen) suplementado con 10% de SFB dializados que contienen 0,6 ácido fólico nM (Invitrogen) durante 2 días, trysinized, contados, chapados de ensayos funcionales y luego tratados con diferentes dosis de ácido fólico, un folato sintético, incluyendo 0, 6, 12 y 60 nM. Las concentraciones de ácido fólico utilizados se basan en el intervalo fisiológico en el plasma, que va desde & lt; 7 nM en individuos con un nivel de folato negativa a & gt; 50 nM en individuos con & gt; 400 mg /d de consumo de folato [30], que es la ingesta de folato estimado por los no usuarios de suplementos en América del Norte [13]. La concentración de la deficiencia de ácido fólico seleccionado (12 nM) se basó en la observación de que dicha concentración es el requisito más bajo para el crecimiento celular [31]. La proteína se extrajo 2 días después del tratamiento.
MTT (3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-difenil tetrazolio bromuro) de ensayo
La proliferación celular se determinó por ensayo de MTT (Sigma) como se describe [22], [24]. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos con 2000 células /pocillo. En los puntos de tiempo específicos, se añadieron 10 l de MTT a cada pocillo. Las placas se incubaron a 37 ° C durante 4 h, seguido de la adición de 100 l de DMSO a cada pocillo para la extracción del colorante. La proliferación celular se determinó midiendo la absorbancia de las muestras a 570 nm con 630 nm como longitud de onda de referencia.
In vitro
migración y la invasión ensayos
In vitro ensayos de migración e invasión
se realizaron como se describe [22], [23], [24]. 1,25 × 10
5 células se sembraron en el lado superior de un Transwell insertar y se dejó migrar a través de una membrana de tamaño de poro 8 mm (ensayos de migración) o invadir a través de una membrana recubierta con Matrigel (ensayos de invasión). Las células en el lado superior de la membrana se retiraron y las células migradas o invadido se fijaron con metanol, se tiñeron con 0,5% de cristal violeta, y se contaron bajo un microscopio de luz en 5 campos aleatorios después de 24 h o 48 h, respectivamente.
análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó con el programa SPSS 15.0 para Windows (SPSS Inc., Chicago, IL). Se utilizó la prueba de Mann-Whitney para la comparación entre los dos grupos, mientras que se utilizó la prueba de rangos de Kruskal-Wallis para la comparación entre varios grupos. El análisis de supervivencia se realizó mediante el análisis de Kaplan-Meier y log-rank test. Se utilizó un análisis de regresión de Cox para el análisis multivariante de supervivencia.
P
valores. & lt; 0,05 se consideró como estadísticamente significativo
Resultados
La sobreexpresión de FRα se asoció con la progresión del tumor de ovario
Por qPCR, FRα significativamente más altos ARNm se encontró en las muestras de cáncer en comparación con los correspondientes homólogos no tumorales después de la normalización con GAPDH (
P
= 0,015) (Figura 1A). Por inmunohistoquímica, se observó una fuerte inmunorreactividad FRα en los cánceres de ovario en contraste con la tinción moderada de FRα en los tumores borderline y la debilidad o ausencia de tinción en cistoadenomas benignas /quistes de inclusión (Figura 1C). En efecto, se detectó significativamente más alta inmunorreactividad FRα en los cánceres de ovario y tumores borderline que en cistoadenomas benignos /quistes de inclusión (todos los
P
& lt; 0,05, Tabla 1). En líneas celulares de nivel, seis de los nueve líneas celulares de cáncer de ovario también mostraron sobre regulación de FRα ARNm y la expresión de la proteína con Skov-3, OVCAR-3 y SW626 que muestra una fuerte expresión mientras OVCA 420, Dov13 y TOV21G mostró débil expresión en comparación con dos líneas celulares de epitelio de ovario normales en las que no se detectó mRNA FRα y expresión de la proteína (Figura 1B).
(a) análisis de qPCR de FRα mRNA en tumores de ovario y los correspondientes homólogos no tumorales. (B) ARNm (panel superior) y proteínas (panel inferior) expresión de FRα en dos líneas celulares inmortalizadas epiteliales de ovario, la manguera y la manguera de 6-3-17-1, y nueve líneas celulares de cáncer de ovario, OVCAR-3, Skov-3 , OVCA 420, OVCA433, OC316, Dov13, ES-2, TOV21G, SW626, según la evaluación de qPCR e inmunotransferencia, respectivamente. (C) La inmunorreactividad de FRα en serosa (a) y mucinoso (e) cistoadenomas ováricos benignos, serosa (b) y mucinoso (f) los tumores de ovario borderline y serosa (c), mucinoso (g), de células claras (d) y endometrioide (h) los carcinomas de ovario. Barra de escala = 100 micras. (D) de Kaplan-Meier general (panel izquierdo) y curvas de supervivencia para los pacientes con cáncer de ovario con niveles altos y bajos de FRα (cortado en media) libre de enfermedad (panel derecho).
En clínica muestras, se encontró que una alta expresión de ARNm y la inmunorreactividad FRα que se asociaron significativamente con estadios avanzados de la enfermedad y la mala grado histológico, los factores asociados con la agresividad del tumor (Tablas 1 y 2). Sin embargo, no se encontró diferencia significativa de inmunorreactividad FRα entre los casos sensibles a la quimioterapia y chemoresistant (Tabla 1). De Kaplan-Meier-análisis de supervivencia también no reveló asociación entre la expresión de alto FRα y en general o la supervivencia libre de enfermedad (Figura 1D).
RFC se había reducido regulado en los cánceres de ovario y se correlaciona con buen pronóstico de pacientes
a diferencia de FRα, las muestras de cáncer de ovario muestran significativamente menor RFC mRNA, en comparación con las contrapartes no tumorales correspondientes según la evaluación de qPCR (
P
= 0,001) (Figura 2A). El análisis inmunohistoquímico reveló también una fuerte inmunorreactividad RFC en los quistes de inclusión /cistoadenomas benignos y la debilidad de expresión en los cánceres de ovario (Figura 2C). Seis de nueve líneas celulares de cáncer de ovario también muestran baja regulación de la RFC ARNm y la expresión de proteínas en comparación con dos líneas de células de epitelio ovárico normal (Figura 2B) guía.
Análisis (A) qPCR de RFC mRNA en tumores de ovario y los correspondientes homólogos no tumorales. (B) ARNm (panel superior) y proteínas (panel inferior) expresión de RFC en dos líneas celulares inmortalizadas epiteliales de ovario, la manguera y la manguera de 6-3-17-1, y nueve líneas celulares de cáncer de ovario, Skov-3, OVCAR-3 , OVCA 420, OVCA433, OC316, Dov13, ES-2, TOV21G, SW626, según la evaluación de qPCR e inmunotransferencia, respectivamente. (C) La inmunorreactividad de RFCin quiste de inclusión (a) y carcinomas de ovario seroso (b). Barra de escala = 100 micras. (D) de Kaplan-Meier general (panel izquierdo) y curvas de supervivencia para los pacientes con cáncer de ovario con niveles altos y bajos de la RFC (cortado en media) libre de enfermedad (panel derecho). (E) de Kaplan-Meier general (panel izquierdo) y curvas de supervivencia para alta FRα libre de enfermedad (panel derecho) expresó pacientes con cáncer de ovario con niveles altos y bajos de la RFC (cortado en media).
RFC ARNm y la inmunorreactividad no se correlacionaron con etapas de la enfermedad, el grado histológico y subtipos histológicos (Tablas 1 y 2). Curiosamente, no hubo una asociación significativa entre la baja expresión de RFC, y más corto en general (
P = 0,034
) y (
P = 0,011
) supervivencia (Figura 2D) libre de enfermedad. Por otra parte, entre los cánceres de ovario con alta expresión FRα, el general (
P
= 0,007) y libre de enfermedad (
P
= 0,008) la supervivencia fue significativamente mayor en aquellos con una expresión de alto RFC (Figura 2E).
FRα amplificación de genes y RFC metilación del promotor contribuyeron a la expresión génica desregulada en los cánceres de ovario
Por qPCR, 11 de las 33 muestras de cáncer (33,3%) muestran gen FRα (FOLR1, el cromosoma 11q13.3) de amplificación, en comparación con las contrapartes no tumorales correspondientes. Todos los casos amplificados mostraron la expresión de ARNm elevada. amplificación FRα se correlacionó con su expresión mRNA (
P
& lt; 0,001, prueba exacta de Fisher) (Tabla 3)
Por otro lado, la expresión de RFC reducido en los cánceres de ovario. estaba relacionado con la hipermetilación. Después del tratamiento de OVCA420 células de cáncer de ovario SKOV-3 y por 5-aza-DC, un inhibidor de la metilación del ADN, de dos veces y aumento de 2,5 veces de la expresión génica RFC se detectó respectivamente (Figura 3A). Por otra parte, se encontró que la hipermetilación del promotor del gen de la RFC (cromosoma 21q22.2) en 14 de 33 (42,4%) muestras de cáncer de ovario por MSP. Los ejemplos representativos de MSP se muestran en la Figura 3B. En contraste, sólo 3 de cada 33 (9%) de las muestras no tumorales mostraron hipermetilación. se detectaron alelos no metilados en todas las muestras tumorales y no tumorales. La hipermetilación del promotor RFC significativamente inversamente correlacionada con la expresión de ARNm (
P = 0,005
, la prueba exacta de Fisher) (Tabla 3). Por MSP, también se detectó RFC hipermetilación del promotor en cinco líneas celulares de cáncer de ovario Skov-3, Ovča 420, OVCA433, TOV21G y SW626 (Figura 3B), todos ellos mostraron las reguladas RFC ARNm y la expresión de la proteína (Figura 2B). En contraste, no se detectaron alelos metilados (Figura 3B) en el línea de manguera de ovario de células epitelio normal 6-3 y dos líneas celulares de cáncer de OVCAR-3 y OC316, que muestra RFC mRNA y expresión de la proteína (Figura 2B), Francia
(a) La expresión de mRNA relativa de RFC en Skov-3 y OVCA 420 después del tratamiento con 5-aza-dC con las concentraciones indicadas durante 72 horas. Cada experimento se realizó por triplicado. Bares, medios de cambio veces ± SD. *,
P Hotel & lt; 0,05. (B) los cánceres de ovario representativos (CA) (panel superior) y líneas celulares de ovario (panel inferior) del MSP sobre el estado de metilación del RFC. M, marcador de ADN; P, control positivo; N, control negativo; M, los alelos metilados; T, los alelos metilados.
Desmontables de la proliferación celular alterado folato mediada FRα en Skov-3 células
Después de confirmar la caída específica de FRα ARNm y la expresión de proteínas en células Skov-3 (Figura 4A), se determinó primero los efectos de FRα sobre la proliferación celular mediada por ácido fólico mediante el ensayo de MTT. En los días 2 y 4, no se encontró un cambio significativo de la proliferación celular en el control y shFRα SKOV-3 células después del tratamiento ácido fólico. En el día 6, las células de control mostraron proliferación en 12 y 60 nM tratamiento con folatos. En el Día 8, 6, 12 y las células de control tratadas con folato 60 nM mostraron proliferación hace dependiente. Por el contrario, desmontables de FRα bloqueado proliferación folato-mediada por células (Figura 4B).
(A) caída estable de FRα mRNA y proteína en SKOV-3 detectado por qPCR (panel izquierdo) e inmunotransferencia (panel derecho ) respectivamente. **,
P Hotel & lt; 0,005. tasa de proliferación (B) de la célula de control y shFRα SKOV-3 células tratadas con 6, 12 y 60 nM de ácido fólico a los 2, 4, 6 y 8 días mostrados como factor de cambio con respecto al control sin tratamiento ácido fólico (0 nM). n = 3; *,
P Hotel & lt; 0,05. (C)
in vitro
la migración (panel izquierdo) y ensayos de invasión (panel derecho) en células control y shFRα Skov-3 tratadas con 0, 12 y 60 de folato nm utilizando la membrana Transwell con o sin recubrimiento de Matrigel respectivamente. Paneles superiores: imágenes representativas de la migración o invadir Skov-3 células. paneles inferiores: La migración celular o la invasión de Skov-3 presentan como porcentaje de control tratado con 0 nM ácido fólico; n = 3; *,
P Hotel & lt; 0,05; **,
P Hotel & lt; 0,005. (D) La inmunotransferencia en FRα y E-cadherina utilizando lisados de proteína preparados a partir de control y shFRα SKOV-3 (panel izquierdo). Relativa nivel de proteína E-cadherina como analizados usando el software ImageJ (Institutos Nacionales de Salud de Estados Unidos); n = 3; *,
P Hotel & lt; 0,05; **,
P
. & Lt; 0,005 (panel derecho) guía empresas
El folato a través FRα indujo Skov-3 migración celular y la invasión y hacia abajo-regulado E-cadherina
a continuación, se probó el efecto de ácido fólico y FRα sobre la migración celular Skov-3 y la invasión. Sobre la base de los efectos de folato sobre la proliferación celular, 12 y 60 dosis nM fueron elegidos para el tratamiento de control y shFRα SKOV-3 células. la migración transwell y ensayos de invasión mostraron que el 12 y 60 nM folato inducida significativamente la migración celular y la invasión de las células de control, mientras que desmontables de FRα bloquearon la migración folato mediada por células y la invasión (Figura 4C). Esto nos permitió determinar la posible blanco de abajo para el efecto mediado folato sobre la migración celular y la invasión. La expresión de E-cadherina, una importante molécula de adhesión célula-célula esencial para la regulación de la motilidad celular, se encontró que reducirse lo hace de forma dependiente de folato después del tratamiento (Figura 4D). Tal regulación por disminución de la E-cadherina después del tratamiento ácido fólico también fue abrogada después desmontables de FRα.
sobreexpresión ectópica de RFC en alta FRα que expresan Skov-3 contrarrestado la proliferación celular mediada por ácido fólico, la migración y la invasión y restaurado E expresión -cadherin
Hemos demostrado la sobreexpresión de FRα y reducción de la expresión de RFC en los cánceres de ovario, lo que sugiere que pueden ejercer funciones opuestas en la progresión del cáncer de ovario. Más importante aún, en los pacientes con altos FRα, la supervivencia global y libre de enfermedad fue significativamente mayor en aquellos con una expresión de alto RFC, que implican a la función protectora de la RFC en los cánceres de alto FRα. Para dilucidar dicha función protectora,
in vitro
se realizaron estudios funcionales sobre Skov-3 células FRα-positivos con ectópica expresado RFC después del tratamiento ácido fólico. Se encontró RFC para contrarrestar la proliferación celular mediada por ácido fólico (Figura 5A), la migración y la invasión (Figura 5B). Por otra parte, la regulación por disminución de la E-cadherina en las células después del tratamiento con ácido fólico también se anuló después de que sobreexpresan RFC (Figura 5C).
(A) de la célula tasa de proliferación de las células SKOV 3 con RFC expresó ectópica o vector de control ( de control) tratados con ácido fólico 60 nM después de 5 días que se muestran como factor de cambio en comparación con el control sin tratamiento ácido fólico (0 nM); n = 3; *,
P Hotel & lt; 0,05. (B)
In vitro
migración (panel izquierdo) y ensayos de invasión (panel derecho) en SKOV 3-células con RFC expresó ectópica o vector de control tratado con 0 y 60 nM de ácido fólico que se muestran como porcentaje de control tratados con 0 folato nM; n = 3; *,
P Hotel & lt; 0,05; **,
P Hotel & lt; 0,005. (C) La inmunotransferencia de RFC y E-cadherina utilizando la proteína lisados preparados a partir de Skov-3 células con RFC expresó ectópica o vector de control (panel izquierdo). Relativa nivel de proteína E-cadherina como analizados usando el software ImageJ (Institutos Nacionales de Salud de Estados Unidos); n = 3; **,
P
. & Lt; 0,005 (panel derecho) guía empresas
Discusión
En este estudio, hemos demostrado el aumento progresivo de FRα ARNm y la expresión de la proteína de los tejidos no tumorales, tumores benignos y borderline a carcinomas. Además, la amplificación del gen FRα como un posible mecanismo de su sobreexpresión también se demostró por primera vez en cánceres de ovario. La sobreexpresión de FRα en los cánceres de ovario [19], [20], así como en los cánceres de riñón, de pulmón y de mama se ha informado anteriormente [32]. Nuestros resultados también indican que una expresión de alto FRα se correlaciona con un mal grado histológico y las etapas avanzadas de la enfermedad, lo que sugiere su papel en la progresión del tumor de ovario
.
A diferencia de FRα, un mRNA RFC inferior y la expresión de proteínas en los cánceres de ovario fue encontrado cuando se compara con los tejidos normales o tumores benignos. RFC se expresa de forma ubicua en el tejido normal y es el sistema principal de transporte de folato para el transporte de los folatos naturales, tales como 5-metil o 5-formil tetrahidrofolato (THF), y antifolatos, tales como metotrexato (MTX) y pemetrexed [16]. 5-metil THF es un cofactor esencial para la metilación del ADN que normalmente conduce a la represión de oncogenes [33]. Por lo tanto, la pérdida de RFC se ha descrito para contribuir a la carcinogénesis de colon [21]. En este estudio, se encontró que la expresión reducida de la RFC se asoció significativamente con la supervivencia global y libre de enfermedad más cortos, lo que sugiere que el RFC puede ser considerado como un marcador de buen pronóstico en pacientes con cáncer de ovario. Por otra parte, entre los pacientes con altos FRα expresar los cánceres de ovario, la supervivencia global y libre de enfermedad fue significativamente mejor en los pacientes con alta expresión de RFC que los que no, lo que implica la función protectora de RFC para los pacientes con estos tumores.
también demostraron que la amplificación FRα y RFC metilación del promotor correlacionan con la expresión de ARNm en los cánceres de ovario. En informes anteriores, RFC metilación del promotor se ha encontrado en las células del cáncer de mama [34] y los linfomas primarios [35]. Nuestros hallazgos sugieren que la regulación de FRα (oncogénico un putativo transportador de folato) y la baja regulación de la RFC (un putativo supresor de tumores de tipo transportador de folato) fueron controlados genéticamente y epigenético, respectivamente, durante el desarrollo del cáncer de ovario.
Como se ha señalado en la introducción anterior, ácido fólico es esencial para la síntesis de ADN [12], [13], [14], por lo tanto ejerce indirectamente a su efecto sobre la proliferación celular. La sobreexpresión de la FRα en las células NIH /3T3 se ha informado de inducir un aumento del crecimiento celular in vitro e in vivo [36]. El uso de folato en varias dosis que varían de 12 nM (considerado como la dieta deficiente en América del Norte) a 60 nm (se considera normal para suplementos no usuarios), hemos sido capaces de demostrar la proliferación celular en FRα-positivas Skov-3 células [13]. A la inversa, cuando el FRα se desmontables por enfoque shRNA, esta proliferación de las células mediada por folato en células SKOV-3 se perdió, lo que confirma el hecho de que el folato de hecho transporta a través de FRα durante el proceso de proliferación de células de cáncer de ovario. Del mismo modo, la expresión intracelular de anticuerpos anti-FR en las células de cáncer de ovario se ha informado de ejercer efectos inhibidores del crecimiento como se muestra por la formación de colonias en agar blando reducida [37].
Además de sus efectos sobre la proliferación celular, sino que también demostraron