Extracto
Los tratamientos tradicionales del cáncer de pulmón implican terapias químicas o radiación después de la cirugía del tumor eliminación; Sin embargo, estos procedimientos a menudo matan a las células normales. Estudios recientes indican que las quimioterapias, cuando se combina con la medicina tradicional china, pueden ofrecer una nueva forma de tratar el cáncer.
in vitro
pruebas de medición de la inducción de la autofagia y /o apoptosis se utilizaron para examinar la citotoxicidad de SBPE, comúnmente utilizado para la inflamación pulmonar en la línea celular A549. Los resultados indicaron que se aumentaron los niveles intracelulares de p62 y Atg12, LC3-I se escinde en LC3-II, y la autofagia se indujo con solamente SBPE. Después de 24 horas, se indujo el mecanismo apoptótico. Si se añade el cisplatino después de las células alcanzaron el estado de la autofagia, hemos observado efectos sinérgicos de los dos podría lograr la muerte suficiente de células de cáncer de pulmón. Por lo tanto, la dosis de cisplatino usada para inducir la apoptosis se podría reducir a la mitad, y la cantidad de tiempo necesario para alcanzar la concentración inhibidora de 50% también fue un medio que de la original. Además de inducir la autofagia en un plazo de tiempo más corto, la terapia de combinación de fármacos y SBPE quimioterapia fue capaz de lograr el objetivo de la eliminación de las células cancerosas de baja dosificación rápida. Además, SBPE se aplicó con gemcitabina o paclitaxel, y se encontró que el tratamiento de combinación de hecho lograr mejores efectos de destrucción de células de cáncer de pulmón. Sin embargo, SBPE también puede ser menos tóxico para las células normales
Visto:. Tseng C-Y, Lin C-H, Wu L-Y, Wang J-S, Chung M-C, Chang J-F, et al. (2016) Potencial Combinacional Lucha contra el Cáncer Terapia de células no pequeñas de cáncer de pulmón con extracto tradicional medicina china Sun-Bai-Pi y cisplatino. PLoS ONE 11 (5): e0155469. doi: 10.1371 /journal.pone.0155469
Editor: Ying-Jan Wang, de la Universidad Nacional Cheng Kung, Taiwán
Recibido: 29 de febrero de 2016; Aceptado: 30 de abril de 2016; Publicado: 12 de mayo de 2016
Derechos de Autor © 2016 Tseng et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
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Financiación:.. Este trabajo fue apoyado por el subsidio del Ministerio de Ciencia y Tecnología (NSC-102-2320-B-033-001-MY3) en Taiwán
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
En Taiwán, aproximadamente 10.000 nuevos casos de cáncer de pulmón se producen cada año, y 7000 personas mueren por cáncer de pulmón cáncer anualmente [1], que es mayor que aquellos con colorrectal, cervical, de mama, de próstata, y cánceres de estómago combinado. Estos números siguen creciendo rápidamente cada año. Existen numerosas causas de cáncer de pulmón, y los primeros síntomas no siempre son evidentes. pacientes con cáncer de pulmón a menudo no son conscientes de los primeros síntomas y se pierden oportunidades para el diagnóstico y tratamiento precoz [2]. De acuerdo con el Departamento de Salud estadísticas, humo de segunda mano, los vapores de alquitrán caliente, radiaciones, el asbesto, el humo de la fábrica, hollín, partículas finas suspendidas, y las tormentas de polvo son las principales causas de cáncer de pulmón [3-14]. Los cánceres de pulmón se clasifican como células pequeñas o no pequeñas carcinomas de células en función de si son o no epiteliales derivado del epitelio, respectivamente [15]. carcinomas de células pequeñas son altamente maligno y pueden hacer metástasis fácilmente, especialmente si el tamaño de la celda es muy pequeña [16]. Por lo tanto, el tratamiento químico es el curso preferido de tratamiento para el carcinoma de células pequeñas [17-19]. casos laterales pueden dividirse en carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma (incluyendo carcinoma bronquioloalveolar, también conocida como carcinoma alveolar), carcinoma de células grandes, carcinoma de células escamosas glandular, tumores carcinoides, adenocarcinoma bronquial (incluyendo carcinoma adenoide quístico o carcinoma epitelial mucinoso), etc [15, 20, 21]. Los tratamientos para estos tipos de cánceres implican principalmente la escisión quirúrgica complementado por la radiación y la quimioterapia [22, 23].
Para el tratamiento del cáncer no microcítico de pulmón de células convencional después de la escisión quirúrgica, quimioterapia destruye las células normales junto con las cancerosas . Cuanto más larga sea la administración de la quimioterapia continúa, la resistencia más fuerte que se desarrolla por las células cancerosas [24, 25]. Aunque este método de tratamiento puede proporcionar el resultado deseado, también aumenta el riesgo de enfermedades concurrentes [25]. Se necesitan dosis más altas de los medicamentos de quimioterapia durante las fases terminales de cáncer con el fin de conseguir los mismos efectos de dosis más bajas administradas durante las etapas de la enfermedad anteriores [20]. Los efectos secundarios de los métodos de tratamiento tradicionales hacen más difícil y menos adecuado para los pacientes con estadios más avanzados de cáncer o peor salud [26-29]. Sobre la base de los efectos secundarios y el daño causado por estas terapias, estudios recientes se centraron en las células tumorales y pagan más atención a la inmunoterapia celular, terapia génica, la terapia de fármaco diana, etc [30-34]. Algunos estudios intentaron aplicar las hierbas medicinales chinas para el tratamiento del cáncer [35-38]. Estos estudios indicaron que numerosas hierbas medicinales chinas, tales como el tejo chino, fortuna thalictroides, plumbagin, o Ganoderma lucidum [39-42], se han encontrado para reducir la inflamación anormal [43-45] y rápidamente inducir la apoptosis de las células tumorales [46-48] .
Sun-Bai-Pi (SBP) es la corteza de la raíz de Morus alba L. de acuerdo con la Enciclopedia de la Medicina tradicional china "Compendio de Materia Médica", la PAS es un medicamento clave utilizada para eliminar el vapor de agua de los pulmones y para tratar escupiendo sangre, sed climatizada, edema, sensación de plenitud del abdomen, hinchazón, problemas del tracto urinario, dolor de cabeza asténico, la deficiencia interior de la energía, tos, inflamación, diabetes, cáncer, hepatitis y enfermedades del corazón [49]. Estudios previos indicaron que los ingredientes clave de Sol-Bai Pi Extracto (SBPE) incluyen Morusin, prenilflavonoide, y benzofurano [50-53]. Estos son antioxidantes que pueden reducir la actividad de NF-kB en las células del cáncer, causa citotoxicidad, e inhibir la metástasis del cáncer, pero su mecanismo de acción sigue siendo poco clara [54-57]. Por lo tanto, además de investigar los mecanismos de muerte celular inducida por el cáncer SBPE, también es necesario establecer una adecuada terapia del cáncer sinérgico que combina las hierbas medicinales chinas y medicamentos de quimioterapia. En este estudio, hemos descubierto que, además de la inducción de apoptosis a largo plazo, SBPE también indujo la autofagia en células de cáncer de pulmón A549. Cuando el medicamento de quimioterapia, cisplatino, se añadió a las células A549 autofágicas, los resultados indicaron que SBPE mejoró la célula cancerosa matando eficacia de los medicamentos de quimioterapia, incluso en dosis reducidas.
Materiales y Métodos
Química
PAS recogido de Di Lian Sheng Farmacéutica (DLSP, Taiwán), que se extrajo con agua caliente durante 30 minutos seguido de centrifugtion, la diálisis y el agotamiento de reservas de proteínas. El sedimento se descartó, se recogió y se almacenó a 4 ° C, el sobrenadante. Cisplatino, gemcitabina, paclitaxel fueron adquiridos de Sigma-Aldrich.
Cultivo de células
Las células alveolares A549 de cáncer de pulmón humano y fibroblastos de pulmón normal células WI 38VA13 Sublinea 2RA se obtuvieron a partir de bio-Collection and Research Centre (BCRC, Taiwán). Las células se cultivaron en medio de Ham F-12K (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.) con 10% de suero fetal bovino (FBS, Gibco) a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO
2. Para los experimentos, las células fueron tratadas con SBPE por varios puntos de tiempo o tratados con SBPE durante 6 h seguido de la exposición adicional medicamentos de quimioterapia para los puntos de tiempo adicionales.
ensayos de citotoxicidad de MTS
La viabilidad se detectado usando un ensayo de MTS comercial adquirido de Promega (Madison, WI), medir la actividad de la succinato deshidrogenasa mitocondrial a través de la conversión de MTS y phenazinemethosulfate a formazán. Después del tratamiento, se añadió una mezcla de reactivo de kit soluble en agua 10 l más de 190 l de medio fresco a cada pocillo durante una 1 h de incubación a 37 ° C en la oscuridad. Los sobrenadantes (100 l /pocillo) se recogieron y se midió la absorbancia del formazano generado a 490 nm con un microreader.
La autofagia inmunofluorescencia
Después de la fijación y permeabilización, la reactividad no específica fue bloqueada por adición de suero de cabra normal al 2% con 0,02% NaN
3. Las células A549 fueron incubadas con primaria anti-LC3 (Abcam) y anticuerpos monoclonales anti-LAMP-1 (Abcam) a una dilución 1: 200 durante 24 h, 4 ° C. anticuerpo secundario marcado con Alexa Fluor 488 (Invitrogen) o Alexa Fluor 594 (Invitrogen) y se utilizó diapositivas fueron cubiertos con Prolong Gold (Invitrogen) medios de montaje anti-fade antes de su uso. Se observaron todas las imágenes en un microscopio Olympus IX51.
Medición de la actividad de caspasa 3
Actividad de la caspasa se evaluó con el uso del kit de ensayo de 3/7 de la caspasa-Glo (Promega). Después del tratamiento SBPE, las placas de cultivo se retiraron de la incubadora y se dejaron equilibrar a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 min, se aplicó entonces el reactivo de ensayo de 3/7 de la caspasa-Glo (200 l /pocillo) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Unidad de luminancia relativa (RLU) emitida por el producto se midió usando un microreader.
Western blot
Las proteínas (40 mg /pocillo /muestra) separado electrophorectically en geles de SDS, se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. reactividad no específica de las membranas estaba bloqueado, y primario anti-p62 (Abcam), anti-Atg-12 (de señalización de la célula), anti-p53 (Abcam), anti-LC3 (Abcam), anti-Bcl-2 (la señalización de la célula) , anti-Bax (señalización de la célula), anti-Bad (señalización de la célula), anti- α-tubulina (Abcam) se probaron con diluciones apropiadas. Se utilizaron secundario de cabra anti-IgG de ratón o anti-IgG de conejo conjugado con HRP, y las manchas se visualizaron mediante quimioluminiscencia mejorada (Promega ™ ECL Western Blot sustrato) y se analizaron en el sistema Odyssey infrarrojo de formación de imágenes (LI-COR Biosciences) (Lincoln, NE).
análisis del ciclo celular
Después de los tratamientos, se recogieron y se fijaron en etanol helado al 75% durante la noche a -20 ° C las células. Las células se centrifugaron a continuación a 300 x g durante 5 min y se incubaron con un yoduro de propidio (PI) solución de trabajo (100 mg /ml PI y 100 g /ml ARNasa) durante 30 min a 37 ° C. la distribución del ciclo celular se analizó utilizando un citómetro de flujo FACScan y se analizaron con el uso de software ModFit (Becton Dickinson, CA).
Estadísticas
Para el análisis estadístico, cada experimento se realizó por triplicado y se repitieron tres veces . Los resultados se expresaron como media ± desviación estándar de tres experimentos independientes, y se analizaron las diferencias entre los grupos usando pruebas t de Student con el software GraphPad estadísticas. *, **, Y *** indica p & lt; 0,05, p & lt; 0,01, y p & lt; 0,001 diferencia significativa, respectivamente, en comparación con el control negativo.#Y ## muestran p & lt; 0,05 y p & lt;. 0,01, respectivamente, en comparación con las muestras con o sin SBPE tratos
Resultados
Viabilidad de las células
Se utilizó el sistema multilateral de comercio prueba para detectar la SBPE efectos tuvo sobre la viabilidad de células WI 38VA13 Subline 2RA, células de fibroblastos de pulmón normales y células de cáncer de pulmón A549. Como se muestra en la figura 1a, se encontró que 24 horas después de la administración SBPE, se redujo la vitalidad de las células A549 como la dosis SBPE aumentó. La viabilidad celular después de la administración de 5 mg /ml fue del 85%, la IC50 se logró después de la administración de 9 mg /ml, y la viabilidad de las células después de la administración de 10 mg /ml fue del 23%. Por el contrario, SBPE no mostró toxicidad significativa hacia las células WI38 normales a la dosis más baja ensayada, pero la muerte celular significativa ocurrió dentro de 24 horas después del tratamiento con SBPE en 5 y 10 mg /mL. Si dosis SBPE de 5 mg /ml y 10 mg /ml se utilizaron a diferentes puntos de tiempo, se encontró que SBPE causó una muerte celular significativa dentro de las 24 horas.
(a) ensayos de viabilidad celular a cabo administrando diferentes concentraciones de SBPE a WI38 y células A549. (B) administrado 5 mg /ml y 10 mg /ml de SBPE a A549 y se incubaron las células durante varios puntos de tiempo. A continuación, se utilizó el reactivo MTS a prueba sus viabilidades.
SBPE inducida Cancer Cell autofagia Efecto
Para evaluar el mecanismo, se supone que antes de la muerte celular, induce SBPE las células cancerosas para convertirse en la autofagia. Como se muestra en la figura 2a y 2b, las observaciones de microscopía de fluorescencia indican que, independientemente de la dosis SBPE. Cuando los dos colores fluorescentes se superponen y cuantificados, el contenido autolysosome aumentaron gradualmente con el tiempo. Por lo tanto, la relación de autolysosome formación de células administradas con SBPE 10 mg /ml aumentó significativamente como una función de la dosis SBPE (Fig 2b). Después de la amplificación relación, el lisosoma y autofagosoma overlaped, lo que indica que SBPE de hecho puede simular las células A549 para convertirse en la autofagia (figura 2c). El diagrama de estadística se muestra en la figura 2D indicó que dentro de las 8 horas de SBPE de tratamiento (10 mg /ml), 70% de las células A549 generado autofagia lisosomal, y que la tasa aumentó a 90% en 12 horas. transferencias de Western (Fig 2E) indicaron que la proteína p62 aumentó significativamente cuatro veces la del grupo de control (Fig 2f) de más de 8 horas, y LC3-I se escindió en LC3-II durante este período. Estos resultados significan que el tratamiento SBPE induce a las células cancerosas para convertirse en la autofagia, que alcanzó su punto máximo dentro de las ocho horas. Además, con el uso de inhibidores de la autofagia, la cloroquina (CQ) más SBPE (10 mg /ml), encontramos la viabilidad celular fue restaurada de manera significativa a las 6 y 24 h después del tratamiento (Fig S1).
5 SBPE mg /ml (a) y 10 mg /ml (b) se añadieron respectivamente las células y se incubaron durante 2, 4, 6, 12, y 24 horas. La inmunotinción se utiliza para etiquetar la proteína LC3 autofagia (verde), LAMP-1 (rojo), y las células de cáncer de DAPI (azul). Magnificación era 400X. (C) magnificados las células se incubaron durante seis horas a 630x para observar la distribución de la autofagia. (D) de superposición de la fluorescencia verde (LC3) y la fluorescencia roja (LAMP-1), y calcula el número de células con lisosomas autofágicas. El eje vertical representa el número total de células por unidad de superficie dividido por el número de células con lisosomas autofágicas. (E) Las transferencias de Western se utilizaron para observar los efectos SBPE tenía en la regulación de las proteínas relacionadas con la autofagia de células A549, y encontraron que la autofagia celular inducida SBPE, que aumentó con el tiempo y alcanzó un máximo de ocho horas. Todos los geles se han ejecutado en las mismas condiciones experimentales. análisis (f) Estadística para actuaciones proteínas.
SBPE apoptosis inducida por
SBPE era citotóxica y la tasa de inducción de la autofagia fortaleció como el tiempo de dosificación y administración aumentado. Sin embargo, aún se desconoce si la administración de SBPE más de 12 horas pueden inducir a las células tumorales para convertirse en apoptótica. Por lo tanto, no se detectó la proteína marcadora apoptótica Caspase3 /7 para determinar si se genera con el tiempo. Fig 3a indica que la capacidad de rendimiento de Caspase3 /7 dentro de las células A549 se amplifican como aumentó el tiempo de administración SBPE. Sin embargo, la amplificación se inició a las 12 horas y llegó a la capacidad de rendimiento pico a las 24 horas. Basándose en los resultados previamente descritas, SBPE de hecho puede iniciar el mecanismo de apoptosis después de 12 horas y puede promover la autofagia de células tumorales dentro de las ocho horas. transferencias de Western (Fig 3b) indican que las manifestaciones de la p53 proteínas pro-apoptóticas, Bax, y Bad aumentado con el tiempo, mientras que la proteína anti-apoptótica de Bcl-2 disminuyeron significativamente. De acuerdo con la figura 3d, después de que las células de cáncer de pulmón A549 se trataron con SBPE (10 mg /ml) durante diferentes períodos de tiempo, un citómetro de flujo se utiliza para observar el estado de la distribución de células durante el ciclo celular. Los resultados indicaron que a medida que aumenta el tiempo de exposición, el número de células que quedan en la fase G1 tendió a aumentar, y la relación de las células en fase S aumentó a medida que pasaba el tiempo, pero la disminución después de alcanzar el pico a 12 horas.
(a) Después de la administración de SBPE 10 mg /ml; el reactivo Caspase3 /7 se utilizó para detectar sus actuaciones. (B) Los efectos que SBPE tiene sobre los factores de control de proteínas relacionadas con la apoptosis de las células A549 y anti-apoptosis. Todos los geles se han ejecutado en las mismas condiciones experimentales. (C) diagrama de Estadística para el rendimiento de proteína. análisis (d) FACS para la distribución del ciclo celular, y el uso del software ModFit LT para analizar la distribución del ciclo celular.
La terapia de combinación con cisplatino y SBPE puede reducir la viabilidad celular del cáncer
Según Fig 4, entre 24 y 48 horas después del cisplatino se administró a A549 células de cáncer de pulmón, de sus efectos citotóxicos reforzada como la concentración de cisplatino aumentado. Sin embargo, los efectos sólo podían llegar a IC50 de 48 horas después del 25 M de cisplatino se administró, y el tratamiento sólo podían causar la muerte celular del 33% en la marca de 24 horas. Por lo tanto, se adoptó el método de terapia de combinación mediante el cual SBPE se administró durante seis horas y el cisplatino se administró durante 24 horas. El objetivo era usar el tratamiento cisplatino para matar las células cancerosas después de la autofagia celular se ha estimulado la esperanza de que este método de combinación puede reforzar significativamente el efecto citotóxico mientras que la reducción de la dosis de cisplatino. Como se muestra en la figura 4a, mediante la administración de 10 M y 25 M de cisplatino durante 48 horas después de que las células fueron pretratadas con SBPE (5 mg /ml) durante seis horas, la viabilidad de células de cáncer se puede reducir en 52% y 37%, respectivamente . En comparación con los resultados, se encontró que las células pre-tratadas con SBPE sólo necesitaba cisplatino 10 micras, con 48 horas para lograr la IC50, que es el mismo rendimiento que se puede lograr por el cisplatino solo 25 mM en el mismo punto de tiempo. Si la concentración de cisplatino se aumentó a 25 mM, la célula tumoral efectos de matar se mejoran. Como se muestra en la figura 4b, si /ml se añadió SBPE 10 mg antes del tratamiento cisplatino durante 24 horas, se encontró que las viabilidades celulares de cáncer después de 5 mM, 10 mM y 25 tratamientos M cisplatino puede reducirse a 58%, 50%, y 36%, respectivamente. Cisplatino 25 mM solo sólo pueden alcanzar la concentración IC50 a las 48 horas en ausencia de SBPE. Los efectos citotóxicos del cisplatino 10 M pueden lograr IC50 después del tratamiento durante 48 horas. La evidencia indica que el SBPE pre-tratada de hecho puede reforzar significativamente los efectos citotóxicos de células de cáncer de cisplatino al tiempo que reduce la dosis o tiempo de tratamiento con cisplatino.
A549 tasa de supervivencia de las células tumorales analiza después de 1 mM, 5 mM, 10 mM , y 25 M de cisplatino se administró y se incubaron durante 24 y 48 horas. El reactivo MTS se utilizó para detectar las tasas de supervivencia. Pre-tratamiento con el uso de SBPE 5 mg /ml (a) y SBPE 10 mg /ml (b) se añadió dosis de cisplatino y se incubaron durante 24 y 48 horas. El reactivo MTS se utilizó para detectar las tasas de supervivencia.
La apoptosis inducida por la combinación de cisplatino y SBPE Terapia
Las transferencias Western se utilizaron para observar cómo la terapia de combinación cambia la regulación de la apoptosis proteínas (figura 5A); y los resultados indicaron que las proteínas pro-apoptóticas p53 (figura 5b), Bax (Figura 5d), y Bad (figura 5e) aumentó a medida que pasaba el tiempo dentro de las 24 horas. Esto fue especialmente cierto para p53, lo que aumentó significativamente después de sólo 12 horas. La proteína anti-apoptótica, Bcl-2, disminuyó significativamente con el tiempo progresó (figura 5c) y se redujo en un 32% después de 24 horas, que alcanzó los efectos un día antes de la tasa de reducción 37% logrado después de 48 horas cuando solo cisplatino se administran.
Apopthsis inducidos por la terapia de combinación SBPE y cisplatino (a) se añadieron y se incubaron durante 24 y 48 horas 6 horas después del tratamiento utilizando 10 mg /ml de SBPE y 25 M de cisplatino. Las transferencias Western se utilizaron para observar los efectos en las proteínas relacionadas con el fenómeno de la apoptosis celular (p53, Bcl-2, Bax, y malo). Todos los geles se han ejecutado en las mismas condiciones experimentales. tabla de cuantificación para p53 (b); BCL-2 (c); Bax (d); Bad (e).
Establecimiento de una concentración SBPE óptima para inducir citotoxicidad de las células del cáncer y de un momento óptimo para administrar fármacos de quimioterapia adicional
Nuestra citotoxicidad análisis mostró que a medida que las concentraciones SBPE y tiempos de tratamiento aumento también lo hizo su efecto citotóxico. Por lo tanto, se estableció una relación entre las células cancerosas A549, concentraciones SBPE, y tiempos de exposición a fin de inducir de manera óptima la autofagia celular A549 (Fig 6). El uso de Matlab 2015A, se realizó una cuantificación tridimensional de los (a) los valores de viabilidad celular existentes; (b) las concentraciones SBPE; y los tiempos (c) SBPE de exposición con el fin de revelar cualquier relación. De acuerdo con la figura 2, se encontró que cuando la tasa de viabilidad de las células estaba en 70%, aproximadamente el 70% de las células fueron inducidas a convertirse en la autofagia. En este punto, el cisplatino a continuación, se podría añadir para acelerar los efectos citotóxicos del tratamiento. En una viabilidad celular de 70%, entonces recogieron diez puntos de tiempo a esta dosis y se obtiene a una expresión relacional utilizado para estimar la correlación entre el tiempo y la dosis SBPE. La expresión relacional para el tiempo y la dosis de SBPE en células de cáncer de pulmón A549 co-incubación fue como sigue: Donde
y
representa la concentración de agente dado a las células,
x
representa el tiempo de implementación , y 5,7665 es la constante de cálculo.
se ha introducido el valor de detección ensayo de citotoxicidad MTS en el software de análisis matemático MATLAB a través de un software estadístico para crear un diagrama de coordenadas de tres dimensiones sobre la relación entre la concentración, el tiempo y la viabilidad . XYZ fueron las variables. Eje X representa la concentración SBPE X = [x, x1]; matrices X y X1 representan concentraciones SBPE de 0 mg /ml, 1 mg /ml, 5 mg /ml, 10 mg /ml, 25 mg /ml, y 50 mg /mL; Eje y representa el tiempo de acción SBPE Y = [Y, y1]; matrices Y y Y1 representan las 24 y 48 horas; Z-AXIS representa la viabilidad celular Z = [Z, Z1]; y matrices Z y Z1 representan viabilidades después de la administración SBPE durante 24 y 48 horas. Las matrices de datos se introducen mediante comandos de surf y un diagrama de superficie tridimensional se representan gráficamente. Los colores representan las relaciones de acción entre los tres.
Verificación de la óptima dosis y concentración para SBPE para inducir el cáncer célula autofagia
De acuerdo con la figura 2, se encontró que cuando la viabilidad celular tasa estaba en 70%, aproximadamente el 70% de las células fueron inducidas a convertirse en la autofagia. El cisplatino se podría añadir en este momento para acelerar los efectos citotóxicos. De acuerdo con la figura 6 y la fórmula que se muestra, para que las células alcancen un estado de autofagia, las células deben recibir SBPE durante un cierto período de tiempo a fin de que para lograr una tasa de supervivencia 70%. Hemos llevado a cabo pruebas de MTS en SBPE 5 mg /ml (32 h), 6,25 mg /ml (30 h), 7,5 mg /ml (16 h), y 10 mg /ml (6 horas) para verificar que este periodo de tiempo siempre que la óptima la dosis y la concentración de SBPE para inducir la autofagia de células cancerosas. Los resultados indicaron que la viabilidad celular podría ser mantenida a 70% como se muestra en la figura 7a. Se realizó microscopía de fluorescencia y se encontró que LC3 se superponía con LAMP-1 cuando SBPE se administró a estos 4 concentraciones. Esta observación representa una superposición de la autophagosome y el lisosoma. Por lo tanto, la administración de SBPE por un período de tiempo específico de hecho puede estimular la autofagia celular A549 (Figura 7b)
.
(a) La concentración y la verificación de vez en contra de la viabilidad se llevó a cabo de acuerdo con los valores de análisis matemáticos generados por el software estadístico como MATLAB se muestra en la Fig 6. concentraciones SBPE de 5 mg /ml, 6,25 mg /ml, 7,5 mg /ml, y 10 mg /mL; plazos fueron 32, 30, 16, y 6 horas; y el reactivo MTS se utilizó para detectar sus actividades. (B) La inmunotinción se utiliza para etiquetar la proteína de la autofagia, LC3; lisosomales marcador, LAMP-1; y el marcador nuclear, DAPI. Las células se incubaron durante ocho horas y se magnifican en 630x para observar la distribución de la autofagia. Las flechas indican autofagosomas (solapado con verde y rojo).
Los efectos que la combinación de SBPE con la Quimioterapia Las drogas gemcitabina y paclitaxel tienen en Cancer Cell Rate Viabilidad
De acuerdo con la figura 8, el citotóxico efectos de gemcitabina y paclitaxel dentro de las 72 horas se pueden mejorar a medida que aumenta la concentración SBPE. Sin embargo, la administración de gemcitabina de 100 M requerido para un máximo de 72 horas y paclitaxel requiere la administración de 100 m para un máximo de 48 horas con el fin de lograr la IC50. Similar al cisplatino, se pre-trataron las células con SBPE durante seis horas y después se añadió la gemcitabina o la combinación de paclitaxel con el fin de observar si SBPE puede aumentar significativamente los efectos citotóxicos de gemcitabina o paclitaxel al mismo tiempo reducir su dosis. Los resultados indicaron que después del tratamiento con 50 mM de gemcitabina y paclitaxel durante 48 horas, las tasas de supervivencia se redujeron con eficacia de 78% a 44% y 65% a 45%, respectivamente. Cuando se compara con los resultados no tratados (figura 8a y 8e), las células SBPE tratados previamente sólo se requiere la mitad de la cantidad de gemcitabina o paclitaxel en 48 horas para lograr IC50.
(a) análisis de viabilidad de las células tumorales A549 después de la administración de gemcitabina. Después de 1 M, 5 M, 10 mM, 50 mM y 100 mM de gemcitabina se administró durante 24 y 48 horas, se utilizó el reactivo MTS para detectar sus actividades. En segundo lugar, después de 6 horas de tratamiento con 10 mg /ml de SBPE; La gemcitabina se añadió durante 24 horas (b), 48 horas (c) y 72 horas (D). análisis (e) las células tumorales A549 viabilidad después del tratamiento con 1 mM, 5 mM, 10 mM, 50 mM y 100 mM de paclitaxel y se incubaron durante 24 y 48 horas. El reactivo MTS se utilizó para detectar sus actividades. En segundo lugar, después de 6 horas de tratamiento con 10 mg /ml de SBPE; Se añadió tratamiento con paclitaxel durante 24 horas (f), 48 horas (g) y 72 horas (h).
Discusión
Hay numerosos efectos secundarios asociados con los medicamentos de quimioterapia tradicionales existentes [26-29]. Por ejemplo, cisplatino, un fármaco de quimioterapia utilizada para tratar el cáncer de pulmón tiene un largo tiempo de respuesta, es propenso a la resistencia a los medicamentos, y la aplicación a largo plazo puede inhibir la apoptosis o producir efectos secundarios incómodos para los pacientes [58]. Otro medicamento de quimioterapia, gemcitabina, puede causar síntomas molestos, como mareos, vómitos, leucopenia, trombocitopenia y toxicidad renal [59]. Las hierbas medicinales chinas tradicionales están comenzando a emerger como fármacos contra el cáncer [35-38]. En la actualidad, aproximadamente dos tercios de los pacientes de cáncer están en el mediados o finales de las etapas de su diagnóstico debido a las restricciones de la técnica de diagnóstico y reducen las oportunidades quirúrgicas [2, 15-23]. Los pacientes durante estas etapas avanzadas son demasiado físicamente débil para soportar el trauma de la cirugía y los efectos secundarios tóxicos de la quimioterapia. La cirugía convencional del cáncer, radiación, y tratamiento de quimioterapia métodos tienen limitaciones, tales como la extensión de la patología de los pacientes, el tiempo de tratamiento, la edad, la condición física, la existencia de complicaciones, y alergias a medicamentos. Algunos pacientes pueden ser reacios a aceptar estos métodos de tratamiento o que suspenda el tratamiento debido a los efectos secundarios [2, 15-23]. Las hierbas medicinales chinas carecen de estas restricciones y puede ser utilizado en consecuencia [60, 61]. Las ventajas de las hierbas medicinales chinas son más que meramente los efectos citotóxicos contra las células cancerosas, sino que también aumentan los beneficios de la aptitud física, inducen citoquinas inmunes, y fortalecen la inmunidad celular; de este modo, proporcionar una protección contra el cáncer. Sin embargo, no hay ensayos clínicos a gran escala que utilizan la medicina tradicional china que demuestran su eficacia en varias ocasiones ", basada en la evidencia médica". Por lo tanto, las hierbas medicinales chinas aún están siendo clasificados como medicamentos secundarios y alternativos para el tratamiento del cáncer.
En este estudio, se investigó si la medicina herbal tradicional, SBPE, puede inducir la autofagia de las células tumorales. Administramos más cisplatino para observar si SBPE puede matar las células de cáncer de pulmón a la vez que se reduce la dosis de cisplatino. Por último, se compararon los efectos producidos por otros medicamentos de quimioterapia con la esperanza de establecer un tratamiento de terapia de combinación chino-occidental. Nuestros resultados indican que SBPE no produciría una citotoxicidad significativa a las células epiteliales de pulmón normales, pero podría causar la muerte de células de cáncer de pulmón en las mismas concentraciones. También se encontró que las células de cáncer de pulmón llegarían a su IC50 después del tratamiento con 10 mg /mL SBPE durante 24 horas. Aunque el mecanismo de citotoxicidad menor de SBPE hacia las células normales sigue siendo desconocida, estos resultados significan que SBPE puede matar de manera eficiente las células del cáncer de pulmón sin dañar las células normales.
Cuando se produce la autofagia, autofagosomas LC3 marcado forman los lisosomas autofágicos con LAMP-1 lisosomas -etiquetados. Se encontró que SBPE podría inducir la autofagia de las células A549 y esto se hizo más evidente como pasaba el tiempo. Los lisosomas autofágicas en las células tratadas alcanzaron un volumen máximo ocho horas después de la administración del fármaco. Expresión de la etiqueta, la proteína lisosomal, p62, y el marcado, la proteína autophagosomal, Atg12, verifica los datos fluorescentes. Ocho horas después de la administración del fármaco, LC3-I escinde la cantidad máxima de LC3-II. Después de 12 horas, las células de cáncer de pulmón comenzaron a apoptosis, evidenciado por el aumento de expresión de la proteína de la apoptosis y marcadores pro-apoptóticas y la reducción de la expresión del marcador anti-apoptótica. Basado en los resultados discutidos anteriormente, SBPE puede inducir la apoptosis de células de cáncer de pulmón después de la autofagia. Sin embargo, aunque el número de células en fase G1 tendió a aumentar después de 24 horas durante el análisis del ciclo celular, el número de células en fase G2 /M no cambió y no había ninguna señal que muestra que SBPE puede causar la detención del ciclo celular para las células cancerosas . Curiosamente, el número de células en fase S aumentó de 31% a 38% a medida que avanzaba el tiempo de tratamiento SPBE, pero se retiró de nuevo a 30% después de 24 horas. La causa de este efecto es desconocido, pero se estima que la mayoría de las células se ha movido hacia la apoptosis y una pequeña porción de las células se ha movido hacia la detención en la fase G1 después de 24 horas.
De acuerdo con la figura 4, se tomó 48 horas para llegar a IC50 siguiendo el tratamiento de células A549 con el medicamento de quimioterapia, cisplatino. La investigación adicional reveló que el pretratamiento de las células de cáncer de pulmón con 10 mg /mL SBPE durante seis horas causaron 30% de las células tratadas a morir y se indujeron la autofagia en 50% de esas células. tasa de supervivencia de las células del cáncer tendió a disminuir en las células pre-tratadas con SBPE en comparación con los grupos que no recibieron tratamiento previo. Además, la concentración y tiempo de tratamiento de cisplatino requerido para alcanzar IC50 se redujo significativamente. El gráfico de tendencia en la figura 6 indica que cuanto mayor es la concentración y tiempo de tratamiento SBPE, más fuerte los efectos citotóxicos en 24 horas. De acuerdo con nuestro análisis gráfico de Matlab, se encontró que cuando los niveles de concentración llegaron a la región azul en el gráfico, la citotoxicidad fue casi un 80%. El tratamiento con 5 mg /ml durante 24 horas SBPE reducción de la viabilidad celular en un 80%.