Extracto
Este estudio examina el papel de s-nitrosilación en el crecimiento del cáncer de ovario mediante el cultivo de células y basados
in vivo
enfoques. Usando el agente de nitrosilación, S-nitrosoglutatión (GSNO), una molécula de óxido nítrico fisiológica, mostramos que el tratamiento GSNO inhibió la proliferación de líneas celulares de cáncer de ovario responder a la quimioterapia y quimiorresistentes (A2780, C200, SKVO3, ID8, OVCAR3, OVCAR4, OVCAR5, OVCAR7, OVCAR8, OVCAR10, PE01 y PE04) de una manera dependiente de la dosis. tratamiento GSNO factor de crecimiento abrogada (HB-EGF) inducida por la transducción de señal que incluye la fosforilación de Akt, p42 /44 y STAT3, que se sabe que juegan papeles críticos en el crecimiento del cáncer de ovario y la progresión. Para examinar el potencial terapéutico de GSNO
in vivo
, los ratones desnudos portadores de xenoinjertos de intra-peritoneales de línea celular de carcinoma de ovario A2780 humano (2 × 10
6) se administraron por vía oral GSNO a la dosis de 1 mg /kg de peso corporal. administración oral diaria de GSNO atenúa significativamente la masa tumoral (p & lt; 0,001) en la cavidad peritoneal en comparación con el vehículo (solución salina tamponada con fosfato) grupo tratado a las 4 semanas. GSNO también potenció cisplatino mediada por toxicidad tumor en un carcinoma de ovario A2780 modelo de ratón desnudo. capacidad de nitrosilación de GSNO se reflejó en la nitrosilación inducida de varias proteínas conocidas que incluyen p65 NFkB, Akt y EGFR. Como un hallazgo novedoso, se observó que GSNO también indujo nitrosilación con relación inversa en la tirosina 705 de la fosforilación de STAT3, un jugador establecido en la quimiorresistencia y la proliferación celular en el cáncer de ovario y en el cáncer en general. En general, nuestro estudio pone de relieve la importancia de la S-nitrosilación de cáncer de clave promoción de proteínas en la modulación de cáncer de ovario y propone el potencial terapéutico de los agentes de nitrosilación (como GSNO) para el tratamiento de cáncer de ovario solo o en combinación con fármacos quimioterapéuticos.
Visto: Giri S, R Rattan, Deshpande M, Maguire JL, Johnson Z, Graham RP, et al. (2014) Potencial Terapéutico preclínica de un agente de nitrosilación en el tratamiento del cáncer ovárico. PLoS ONE 9 (6): e97897. doi: 10.1371 /journal.pone.0097897
Editor: Chih-Pin Chuu, Institutos Nacionales de Investigación en Salud, Taiwán
Recibido: 7 Enero, 2014; Aceptado: April 24, 2014; Publicado: June 2, 2014
Derechos de Autor © 2014 Giri et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo con el apoyo de subvención Marsha Rivkin Académico y el Departamento de Defensa OCRP premio W81XWH-12-1-0270 al peso específico. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de ovario (OvCa) es la quinta causa más común de muerte por todos los cánceres entre mujeres en los Estados Unidos y la principal causa de muerte por tumores malignos ginecológicos [1]. Las altas tasas de mortalidad asociadas con OvCa es debido a la mayoría de los pacientes (75%) se presentan con enfermedad generalizada (mayor estadio III o) en el momento del diagnóstico [2]. La pobre supervivencia a los 5 años (30%) se debe al hecho de que la mayoría de Ovča son inoperable en el momento del diagnóstico. Si se detecta a tiempo, más de 90% de los pacientes tienen un mejor pronóstico y respuesta al tratamiento en comparación con los pacientes con una fase avanzada de la enfermedad. En consecuencia, una mejor comprensión de los eventos moleculares clave que juegan papeles importantes en OvCa puede conducir a un mejor diagnóstico y tratamiento.
S-nitrosoglutatión (GSNO) es un agente de nitrosilación que media en el proceso posterior a la traducción de S-nitrosilación en proteínas resultantes en la modulación de su actividad. S-nitrosilación es una reacción biológica importante de óxido nítrico (NO) y se refiere a la conversión de grupos tiol, incluyendo los residuos de cisteína en las proteínas, para formar S-nitrosotioles. Es un mecanismo para la regulación postraduccional dinámica de la mayoría o todas las clases principales de proteína y es independiente de la catálisis enzimática, modificación lábil, on /off fotofosforilación interruptor-como [3]; sin embargo, denitrosylation puede ser enzimática o no enzimática. Un número cada vez mayor de proteínas se han encontrado para someterse a S-nitrosilación
in vivo, España denominado S-nitrosotioles, y juegan un papel importante en varios procesos que van desde la transducción de señales, la reparación del ADN, la defensa del huésped, y la presión arterial de control para la regulación de los canales iónicos y la neurotransmisión [3]. Sin embargo, el papel de la S-nitrosilación en el crecimiento y la progresión OvCa no se ha estudiado.
Este estudio fue planeado para examinar el efecto terapéutico de un agente de nitrosilación (GSNO) en OvCa utilizando
in vitro
y
in vivo y modelos y para examinar el papel de nitrosilación en OvCa.
Métodos
Reactivos y anticuerpos
GSNO fue adquirido de World Precision Instruments (Sarasota, FL) y su pureza es & lt; 98%. Los siguientes anticuerpos fosfo-STAT3 (Y705) (Cat#9145, que se utiliza en 1:1000), pAkt (Ser473) (Cat#4060, que se utiliza en 1:1000), p-p42 /44 (Thr202 /Tyr204) (Cat#4370, que se utiliza en 1:1000), STAT3 (Cat#9139, que se utiliza en 1:1000), Akt (Cat#4685, que se utiliza en 1:1000), p42 /44 (Cat#9107, que se utiliza en 1:1000) eran de Señalización celular (Danvers, MA). Beta-actina (b-actina) se adquirió de Sigma (St. Louis, MO). El suero fetal bovino se adquirió de BioAbChem (Ladson, Carolina del Sur). STAT3 recombinante se compró a SignalChem (Richmond, Canadá).
Cell Cultura y
línea celular humana OvCa SKOV3 y OVCARs eran de la American Type Culture Collection (Manassas, VA). líneas celulares A2780, C200 y OVCAR4 fueron una especie de regalo del Dr. Tom Hamilton (Fox Chase Cancer Center de) [4]. PE01 y PE04 fueron una especie de regalo del Dr. Taniguchi (Universidad de Washington, Seattle) [4]. Todas las líneas celulares se mantuvieron Ovča y se cultivaron en Memorial Institute completa Roswell Park (RPMI)
medio que contiene 10% de suero bovino fetal y antibióticos.
Animales
Declaración de Ética.
Seis - a ocho semanas de edad ratones hembra desnudos fueron adquiridos de cáncer Institute-Frederick de Investigación y Desarrollo del Centro Nacional del cáncer (Frederick, MD). Todos los ratones fueron alojados y mantenidos bajo condiciones específicas en las instalaciones de la Clínica Mayo de Rochester, Minnesota. Las instalaciones están aprobados e inspeccionados por la Asociación Americana para la Acreditación de Laboratorio Animal Care (AAALAC Acreditación#000717) y de acuerdo con las regulaciones y normas del Departamento de Agricultura, Departamento de Salud y Servicios Humanos de Estados Unidos Estados Unidos actuales, y los Institutos Nacionales de Salud. Todos los estudios fueron aprobados y supervisados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Clínica Mayo (IACUC) bajo el número de protocolo A13909.
Los ratones fueron mantenidos de acuerdo con la IACUC institucional aprobó el protocolo. células A2780 se lavaron dos veces y se resuspendieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 2 × 10
6/100 l y se inyectaron en la cavidad intraperitoneal de los ratones nude (día 0). El tratamiento con GSNO (1 mg /kg de peso corporal) se inició 3 días después de la inoculación de las células. GSNO se administró por sonda oral en 0,1 ml de volumen usando una aguja de alimentación de calibre 20 con un diámetro de bola de 2,25 mm (Braintree Scientific, MA). El grupo de control recibió PBS como vehículo. Los ratones se controlaron diariamente para cualquier molestia y se pesaron todos los días tercero para comprobar el crecimiento del tumor. Para los estudios de combinación, el tratamiento con cisplatino (/kg de peso corporal 4 mg) por medio de inyecciones intraperitoneales fue dado en los días 7, 14 y 21 junto con el tratamiento GSNO como se describe anteriormente (día 0 se tomó como el día de la inoculación de las células). Después de la inducción del tumor, los ratones fueron monitoreados diariamente para detectar signos de cualquier peligro. Los ratones fueron asesinados humanamente con sobredosis de CO2 a las 4 semanas, cuando la carga del tumor alcanzó el peso mandato en los ratones no tratados [4], [5] y los tumores se extirparon y se fijaron en formalina para el corte.
El análisis por inmunotransferencia
Después del tiempo estipulado de incubación en presencia o ausencia de cantidades indicadas de GSNO, se realizó un análisis de inmunotransferencia con anticuerpos específicos tal como se describe anteriormente [6] - [9]. En resumen, células tratadas y sin tratar A2780 o SKOV3 se trataron con HB-EGF (50 ng /ml) y /o GSNO (2 h de tratamiento previo antes de la adición de HB-EGF en las células) en diferentes períodos de tiempo (5-20 min ) se lisaron en tampón de lisis [50 mM Tris-HCl (pH 7,5), NaCl 250 mM, EDTA 5 mM, NaF 50 mM, DTT 1 mM, Na3VO4 50 mM y 0,5% Nonidet P-40] que contiene un cóctel inhibidor de la proteasa ( Sigma, St. Louis, MO). Cuarenta g de proteínas se resolvieron por SDS-PAGE y se transfirieron a membrana de nitrocelulosa. A continuación, la membrana se bloqueó durante 1 hora en 5% TTBS leche descremada en polvo (Tris 20 mM, NaCl 500 mM, y 0,1% de Tween 20, pH 7,5) y se incubó durante la noche en antisueros primaria contra fósforo-STAT3 (Y705), STAT3, p -p42 /44 (Thr202 /Y204), p42 /44, pAkt (Ser473), Akt o β-actina que contiene leche en polvo desnatada al 5% o 5% de BSA en caso de fosfo-anticuerpos. Después de la incubación con conjugado con HRP Ab secundario, blots fueron desarrollados con un sistema de detección ECL (GE Healthcare, Piscataway, NJ).
Ensayos de proliferación
Las células (2,5-5,0 × 10
4) se sembraron en placa de 24 pocillos por triplicado y se trata con concentraciones indicadas de GSNO durante 48 horas. GSNO oxidado Inactivo se utilizó como control. GSNO oxidado inactivo se preparó mediante la exposición de GSNO solución (0,2 mM en DMSO) a la luz durante 7 días. GSNO oxidado es incoloro y no produce NO cuando se añade a los medios de células solas o con las células no expuestas a diferencia de GSNO (Figura S1 A & amp; C). MTT ensayo se realizó como se describió anteriormente [8] para determinar el número de células vivas.
Formación de Colonias Ensayo
Las células (2 × 10
3) se sembraron por triplicado en 6- así plato y después de 24 horas, las células fueron tratadas con las concentraciones indicadas de GSNO una vez. Se dejó que las células para formar colonias de hasta 2 semanas y medio completo fue sustituido cada cuatro días. Las colonias fueron teñidas con MTT y se contaron como se describe anteriormente [8].
dosis-efecto
análisis
Se determinó la concentración de inhibición del 50% (IC 50) sobre la base de las curvas de dosis-respuesta de ensayo de MTT y se calculó utilizando el software Calcusyn (Biosoft, Cambridge, Reino Unido).
migración y la invasión de ensayo
SKOV3 se cultivaron en medio libre de suero durante la noche. ensayos de migración e invasión de cero se midieron como se describe antes [5]. Para el ensayo de cierre de la herida, se cultivaron células SKOV3 hasta la confluencia en placas de 24 pocillos y se mantienen en condiciones de suero bajas (0,2%) durante la noche. A cero fue creado en el medio de la bien con una punta de 200 l estéril, y medios de comunicación sustituido con los tratamientos respectivos. Las micrografías se recogieron a 0 y las 24 horas. La distancia de píxeles entre los huecos se midió en un punto en cada punto de tiempo pre-determinado. La distancia recorrida fue sustraída del punto de inicio para estimar la distancia recorrida por las células que migran [10]. Para el ensayo de invasión, las células SKOV3 en suspensiones (500 l, 2,5 × 10
4) se sembraron en la parte superior de las placas Transwell recubiertas con Matrigel (8- m de diámetro de poro; BD Biosciences). Las cámaras inferiores contenían medio libre de suero que contienen diversos factores de crecimiento incluyendo HB-EGF y SDF1 a la concentración de 25 ng /ml. Las células que invaden la superficie inferior del filtro revestido con una capa fina de Matrigel se tiñeron con violeta de cristal 0,5% (60% de PBS, 40% EtOH) y se contaron con un microscopio invertido. Se presentan los resultados de al menos dos experimentos independientes por triplicado.
La inmunohistoquímica (IHC)
Los tumores extirpados de los ratones fueron fijadas en paraformaldehído al 10% durante 48 horas y embebidos en parafina. De cuatro micras de espesor secciones consecutivas fueron cortadas y procesadas para inmunohistoquímica para CD31 (Cat#sc31045, utilizado en 1:100) y Ki-67 (Cat#M7240, que se utiliza en 1:100). Soluciones obtenidas a partir de Dako Cytomation (Glostrup, Dinamarca) fueron utilizados para realizar la inmunotinción. En resumen, las secciones de tejido se desparafinaron, desenmascarado, se bloquearon con avidina-biotina y se incubaron con el anticuerpo primario durante la noche. Al día siguiente la reacción se detectó mediante el uso de cromógeno de acuerdo con las instrucciones del fabricante (DAKO, Glostrup, Dinamarca). Las células positivas teñidas de color marrón. Las diapositivas fueron examinadas bajo microscopio de luz y pictogramas representativos fueron tomadas desde un mínimo de 5 o 6 diapositivas diferentes de cada grupo. Para la tinción de CD31, se utilizó el anticuerpo secundario marcado con FITC y visualizado utilizando un microscopio de fluorescencia en 6 secciones por grupo.
recuento mitótico y medidas de los tumores en directo
El recuento mitótico y se registraron en hematoxilina y eosina secciones usando el microscopio óptico Olympus BX-41 en el campo de alta potencia (HPF; × 400). Las células en mitosis se contaron en los tumores, en la zona más activa ( "hot spots") en un mínimo de 5 HPF consecutivos. se enumeró el número medio de células en mitosis por HPF. diámetro máximo del tumor viable se calcula sumando el mayor diámetro unidimensional de cada fragmento del tumor usando la Olympus BX-41 microscopio y un micrómetro. Del mismo modo, se midieron las áreas necróticas y el tamaño del tumor en vivo compuesta se calculó a partir de cada diapositiva como publicó antes [4], [5].
Análisis estadístico
Los datos se expresan como las medias ± SD y se analizaron estadísticamente mediante la prueba t de Student (Prisma). P & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
GSNO inhibe la proliferación de líneas celulares Ovča
Para evaluar el efecto del tratamiento con GSNO en el crecimiento OvCa, diversas células OvCa. líneas (A2780, C200, PE01, PE04, OV202 y SKOV3) se trataron con diversas concentraciones de GSNO (0,1-1 mM). La proliferación se determinó por el ensayo MTT después de 24 horas. El tratamiento con GSNO inhibe la proliferación de estas líneas celulares Ovča significativamente de una manera dependiente de la dosis (Fig. 1), incluyendo cisplatino resistente C200 (Fig. 1B), PE04 resistente taxol (Fig. 1D) y las líneas celulares SKOV3 agresivos (Fig. 1E ). Además de GSNO en los medios libera NO en forma dependiente de la dosis; Sin embargo, GSNO oxidada no produjo NO (Fig. S1B-C). También medimos la IC50 de GSNO sobre la proliferación celular de varias líneas celulares utilizando Ovča programa Calcusyn. IC50 para GSNO eran 0,162, 0,385, 0,337, 0,427, 0,196 y 0,235 mmol /L en A2780, C200, PE01, PE04, OV2O2 y SKOV3, respectivamente (Tabla S1). tratamiento GSNO también atenúa la proliferación de células de otras líneas celulares Ovča incluyendo OVCAR-3, -4, 5, -7, -8 y -10 de una manera dependiente de la dosis (Fig. S2). La IC50 para GSNO en estas líneas celulares fueron encontrados diferencialmente y se enumeran en la Tabla S1. La forma oxidada inactiva de GSNO no tuvo efecto sobre la proliferación de líneas celulares Ovča
Porcentaje viabilidad de A2780, C200, PE01, PE04, SKOV3 y OV202 tratados con dosis indicadas de S-nitrosoglutatión (GSNO;. 0.1- 1 mM) se determinó mediante el ensayo de MTT. Inactivo GSNO (oxidado, última barra) se utilizó como control. Los datos representan 3 experimentos individuales realizados por triplicado. *** P & lt; 0,001; ** P & lt; 0,01; * P & lt; 0,05 y NS; no es significativo en comparación con las células no tratadas utilizando la prueba t de Student (Prisma).
Para determinar si esta inhibición se reflejó en la supervivencia clonogénico, la colonia capacidad de formar A2780, se realizaron las células C200, PE01 y PE04 . Como se muestra en la Figura 2, un solo tratamiento de GSNO atenuó significativamente la supervivencia clonogénico de estas líneas celulares Ovča de una manera dependiente de la dosis en comparación con las células no tratadas (Fig. 2). IC50 para GSNO se encontró que era 0,122, 0,161, 0,356 y 0,352 mmol /L en en A2780, C200, PE01 y PE04, respectivamente (Tabla S2). forma oxidada Inactivo de GSNO no tuvo efecto sobre la formación de colonias de líneas de células Ovča. Estos resultados sugieren que el tratamiento GSNO puede dar lugar a una inhibición sostenida de la proliferación de diversas líneas de células Ovča, incluyendo líneas celulares quimiorresistentes (C200 y PE04) (figura 2B, C & amp;. F).
Las células (2 x 10
3) /pocillo (A2780, C200, PEO1 y PEO4) se sembraron en placas de 6 pocillos y se trataron con las concentraciones indicadas de S-nitrosoglutatión (GSNO) una vez. GSNO oxidado se utiliza como un control negativo (última bar). Después de 2 semanas, las colonias fueron teñidas con MTT y se contaron. Los resultados se muestran como media ± desviación estándar de los triplicados. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001 y NS; no es significativo en comparación con las células no tratadas utilizando la prueba t de Student (Prisma).
GSNO atenúa factores de crecimiento que producen la migración celular y la invasión
in vitro
A continuación examinó en el efecto de GSNO en el factor de la migración celular mediada por el crecimiento y la invasión. SKOV3 crecido durante la noche en suero bajo (0,2%) que contiene medio estaban rayados usando una punta de pipeta de 200 l estéril, una vez que habían alcanzado el 90% de confluencia. Se añadieron varios factores de crecimiento incluyendo HB-EGF y SDF1 (50 ng y 25 ng /ml, respectivamente) individualmente para el medio en presencia o ausencia de GSNO (200 M). Veinticuatro horas más tarde, se calculó la tasa de cierre de la herida. Como se muestra en la Figura 3A, GSNO inhibe toda la migración celular mediada por HB-EGF y SDF1 en la línea celular SKOV3. Se obtuvieron resultados similares para las líneas de células A2780 y C200 (datos no mostrados). A continuación se evaluó el efecto de GSNO en la modulación del factor de crecimiento mediada por la invasión de las células SKOV3 utilizando el ensayo Boyden cámara de la migración (BD Bioscience, San José, CA) como se describe anteriormente [11]. La Figura 3B demuestra claramente que el tratamiento GSNO inhibió significativamente la invasión inducida por factor de crecimiento de las células SKOV3 en comparación con las células no tratadas. Estos resultados indican que GSNO tiene la capacidad de inhibir la migración y la invasión de las células Ovča.
A. Las células cultivadas con HB-EGF y SDF1 en ausencia o presencia de S-nitrosoglutatión (GSNO) y la migración celular se midieron mediante el ensayo de cierre de la herida como se describe en material y métodos. Los resultados se muestran como media ± desviación estándar de n = 7. B. Para examinar el efecto de GSNO en la invasión, 1 × 10
5 SKOV3 células se sembraron en los pocillos superiores con GSNO 0,2 mM en la cámara superior del transwell en 500 medio de cultivo l. Varios factores de crecimiento (HB-EGF y sdf1) (25 ng /ml) se añadió a los medios de comunicación subyacentes. Veinticuatro horas más tarde, la invasión se determinó siguiendo las instrucciones del fabricante. Los resultados se muestran como media ± desviación estándar de los triplicados. $$$ P & lt; 0,001 factor de crecimiento tratados en comparación con control. * P & lt; 0,05; *** P & lt;. 0.001 GSNO tratados en comparación con el factor de crecimiento mediante la prueba t de Student (Prisma) guía empresas
GSNO abroga la señalización inducida por el factor de crecimiento de células OvCa
Para examinar el efecto de GSNO en la señalización inducida por factor de crecimiento, A2780 suero de hambre y las células SKOV3 se trataron con GSNO seguido de tratamiento HB-EGF para varios períodos de tiempo. Se recogieron las células y a inmunotransferencia para diversas moléculas de señalización. Como se muestra en la Figura 4, el tratamiento con GSNO inhibe la activación inducida HB-EGF de STAT3, Akt y p42 /44 como se desprende de las muestras disminuye o DETECTADAS falta de fosforilación de HB-EGF tratada. GSNO tratamiento también redujo los niveles basales de la forma fosforilada de Akt, STAT3 y p42 /44 en líneas de células A2780 y SKOV3 (Fig. 4). control inactivo (oxidado GSNO) no tuvo efecto en la señalización inducida por el factor de crecimiento, lo que sugiere la especificidad de GSNO en la atenuación de la señalización inducida por HB-EGF y un posible mecanismo por el cual GSNO media la atenuación del crecimiento celular, la migración y la invasión de las células Ovča
in vitro
A2780 (a) y las células SKOV3 (B) se sembraron, suero de hambre durante toda la noche y se trató con S-nitrosoglutatión (GSNO; 0,5 mM). o control inactivo (GSNO oxidado; 0,5 mM) en presencia o ausencia de HB-EGF (50 ng /ml) durante varios períodos de tiempo (5-20 min). Las células se recogieron en los puntos de tiempo indicados y se procesaron para la detección de varias moléculas de señalización que incluyen pSTAT3 (Tyr705), pAkt (Ser473) y p-p42 /44 (Thr202 /Tyr204), utilizando sus anticuerpos específicos de Señalización Celular (Danvers, MA). Se utilizó total de STAT3, Akt, p42 /44 y β-actina para la igualdad de la carga. Las transferencias son representativos de dos experimentos llevados a cabo de forma independiente.
La administración oral de GSNO atenúa el crecimiento del tumor y mejora la citotoxicidad inducida por cisplatino
in vivo
Con el fin de determinar si GSNO podría atenuar el crecimiento del tumor
in vivo
, las células A2780 (2 × 10
6) en PBS se inocularon por vía intraperitoneal en 6 semanas de edad ratones desnudos hembra para el establecimiento de los tumores. Los ratones fueron asignados a dos grupos de tratamiento. El primer grupo (sin tratar) se le dio 100 l de PBS como vehículo por sonda. El segundo grupo se le dio GSNO por vía oral en PBS (100 l) a la dosis de 1 mg /kg de peso corporal cada día como se describe en material y métodos (Fig. 5A). Al final de 4 semanas, los ratones fueron sacrificados, y la carga tumoral se examinó groseramente, extirparon y se pesaron. La administración diaria de GSNO redujo significativamente la circunferencia abdominal (p & lt; 0,01) (Fig 5B.), una indicación de la carga tumoral se lleva en el peritoneo. GSNO también redujo el crecimiento del tumor (p & lt; 0,001) en la cavidad peritoneal de ratones desnudos portadores de A2780 en comparación con el vehículo (PBS) grupo tratado. Los pesos medios de los tumores extirpados fueron de aproximadamente 68% menos en GSNO (3,35 ± 0,52 gm) ratones tratados en comparación con los ratones no tratados (7,91 ± 0,412 gm) (Fig. 5C). Como se informó anteriormente por Shaw et al [12] y nos [4], intraperitoneal inyectado células A2780 formaron tumores principalmente sólidos y presentan con metástasis-ovario específico (Fig 5D, panel inferior). Las masas tumorales de ovario asociada en los ratones tratados GSNO eran mucho más pequeñas que en los ratones no tratados (Fig. 5D). A fin de evaluar la viabilidad del tumor, tamaño del tumor necrótico y viable se determinó a partir hematoxilina y eosina secciones teñidas. La relación del tamaño del tumor en vivo con el tamaño total del tumor se calculó basándose en el diámetro más grande unidimensional tal como se describe en los métodos. Como se muestra en la Figura 5E, xenoinjertos derivados de los ratones tratados con GSNO tenían tamaños significativamente menos viables tumorales (p & lt; 0,001) y el aumento de las regiones necróticas en comparación con xenoinjertos derivados de ratones no tratados. Aunque hubo una tendencia a la baja observada en la mitosis y de los vasos cargos de los tumores de los ratones tratados GSNO, no hemos podido detectar un cambio significativo (Fig. 5F-G). En general, nuestro estudio sugiere fuertemente el potencial de agente de nitrosilación para mitigar el crecimiento de OvCa
in vivo gratis (Fig. 5).
A. Diagrama esquemático del diseño experimental. En resumen, la línea celular de cáncer de ovario A2780 se inyectó intraperitonealmente en ratones desnudos y se le dio S-nitrosoglutatión (GSNO) por vía oral todos los días de días 3 a la dosis de 1 mg /kg de peso corporal hasta el final del estudio. Salina tamponada con fosfato (PBS) fue dado como vehículo. B. Disminución de la circunferencia abdominal de los ratones tratados GSNO en comparación con los grupos tratados con vehículo medidos en la semana 4 (** p & lt; 0.01 tratados en comparación con vehículo). C. Disminución de pesos de los tumores extirpados de los ratones tratados en comparación con GSNO vehículo tratado en la semana 4 (*** p & lt; 0,001 tratado en comparación con vehículo). Los resultados se muestran como media ± SD de 10-14 animales individuales. D. Representante imagen morfológico general de la masa tumoral y el tumor de ovario asociado con el vehículo y de los ratones tratados GSNO. E. Las mediciones de tamaño de tumor viable de GSNO vs ratones tratados con PBS, como se describe en los métodos (*** p & lt; 0,001 tratados en comparación con vehículo). F. Conde de células mitóticas y G. recuento de los vasos CD31 positivas por HPF (x400) en GSNO vs ratones tratados con PBS, como se describe en métodos), los recuentos se realizaron a partir de 5 campos de 3 tumores diferentes de cada grupo. NS; no significativo tratado en comparación con el vehículo.
Además, examinó si una combinación de GSNO con cisplatino podría aumentar el efecto citotóxico de tumores. Por lo tanto, después de la inyección de las células A2780, 2 juegos de ratones fueron tratados diariamente con la administración oral de GSNO (1 mg /kg de peso corporal) y cisplatino (inyección intraperitoneal semanal de cisplatino en días 7, 14 y 21) como monoterapia. Para la terapia de combinación, un conjunto de ratones se trató con GSNO y cisplatino como se representa en la Figura 6A. Tanto GSNO y cisplatino fueron significativamente eficaces en la reducción del crecimiento tumoral y la masa como monoterapia en ratones portadores de A2780 (Fig. 6B). Sin embargo, la terapia de combinación fue más eficaz en la inhibición del crecimiento del tumor en comparación con la monoterapia de cualquiera de los fármacos. Combinación de cisplatino (4 mg /kg de peso corporal) con GSNO (1 mg /kg de peso corporal) (2,08 ± 0,18 gm) (Fig. 6B) el crecimiento del tumor reducido significativamente en comparación con cualquiera de GSNO (3,54 ± 0,35 gm) o cisplatino tratamiento solo (3.15 ± 0.34 g) o los ratones no tratados (6,9 ± 0,66 g). El volumen del tumor se redujo en un ~ 90% en la mayoría de los ratones tratados con la combinación. En conjunto, estos resultados sugieren que la combinación de GSNO con el tratamiento con cisplatino es significativamente eficaz para reducir el crecimiento tumoral en un modelo de ratón OvCa.
A. Diagrama esquemático del diseño experimental. B. acumulativa peso del tumor extirpado de los ratones individuales a las 4 semanas con S-nitrosoglutatión (GSNO; 1 mg /kg de peso corporal) (panel 2), cisplatino (4 mg /kg de peso corporal) (panel 3) y GSNO (1 mg /kg de peso corporal) y cisplatino (4 mg /kg de peso corporal) combinación (panel 4). El cisplatino se administra 3 veces por vía intraperitoneal en los días 7, 14 y 21 post-inyecciones tumorales. Los resultados se muestran como media ± desviación estándar de 7 animales individuales. *** P & lt; 0,001 combinación de GSNO + grupo tratado en comparación con el cisplatino solo grupo tratado sin tratar o cisplatino; ** P & lt; 0,01 grupo tratado GSNO comparación con el grupo no tratado; * P & lt; 0,05 grupo tratado en comparación con cisplatino grupo no tratado;#P & lt;. 0,05 combinación del grupo GSNO + cisplatino en comparación con GSNO grupo solo
nitrosilación tratamiento GSNO inducida de STAT3
Dado que, GSNO es un agente de nitrosilación y conocido para mediar en la postraduccional proceso de S-nitrosilación en proteínas, lo que resulta en la modulación de su actividad [13]. Se examinó el efecto de GSNO en nitrosilación en diversas proteínas endógenas que se sabe que están nitrosylated y actores clave en OvCa incluyendo Akt, p65 y EGFR [14] - [17].
Para examinar la nitrosilación de varias proteínas , se empleó un ensayo de biotina-interruptor sofisticado. nivel basal de proteínas nitrosilados se pudo detectar que van desde 250 hasta 35 kd de peso molecular en las células Ovča (Fig. 7A, carril 1). tratamiento GSNO potenció la nitrosilación de proteínas endógenas en células tratadas con GSNO (0,5 mM) durante 2 horas (Fig. 7A, carril 2). La especificidad de nitrosilación podría lograrse omitiendo la adición de HPDP-biotina durante el ensayo biotina-switch. Como se muestra en la Figura 7A, carril 3, la omisión de la etapa de HPDP-biotina bloqueó completamente la detección de nitrosilación de proteínas endógenas, lo que subraya la especificidad del método de nitrosilación en nuestro laboratorio. Hemos validado aún más la inducción de nitrosilación por GSNO mediante la observación de la nitrosilación de proteínas ya se ha informado de señalización asociados con la progresión del cáncer de ovario, entre ellos. tratamiento GSNO indujo la nitrosilación de p65, Akt y EGFR como se esperaba (Fig. 7B). Hemos detectado aún más la observación única de STAT3 someterse nitrosilación por tratamiento GSNO (Fig. 7B, C). Para confirmar que STAT3 se nitrosylated, STAT3 se inmunoprecipitó después del ensayo de biotina-switch mediante su anticuerpo específico y inmunotransferencia con anti-biotina-HRP. Se observó una observación similar de STAT3 someterse a nitrosilación GSNO tratamiento. Estos conjuntos de experimentos indican claramente una novela regulación de STAT3 por s-nitrosilación. Para examinar adicionalmente si este fenómeno no se limita sólo a un tipo de células, se trataron diversas líneas celulares incluyendo Ovča A2780, C200 y SKOV3 con GSNO y se oxida GSNO como control. Después de 2 horas de incubación, lisado total de células se procesó para la detección de estado de fosforilación de STAT3. Como se muestra en la Figura 7D, el tratamiento GSNO abolida o se reduce la fosforilación de la tirosina en todas las líneas celulares Ovča sin afectar a los niveles de STAT3. Oxidó el GSNO no afectó los niveles de pSTAT3 en todas las líneas celulares. En condiciones experimentales similares, hemos examinado la nitrosilación de STAT3 utilizando el método interruptor de biotina. GSNO tratamiento aumentó la nitrosilación total de múltiples proteínas con bajo a alto peso molecular en comparación con las muestras no tratadas y tratadas GSNO oxidadas como se desprende de la figura 7E. Un patrón similar se observó en la nitrosilación de STAT3 lo que sugiere que el aumento mediado GSNO en nitrosilación de STAT3 es un fenómeno general en todas las líneas celulares Ovča.
A. La detección de las proteínas biotiniladas después método de biotina-interruptor en la presencia o ausencia de S-nitrosoglutatión (GSNO; 0,5 mM). La omisión de biotina-HPRT indica la especificidad de S-nitrosilación por el método de biotina-switch. B. Detección de nitrosilación de diversas proteínas incluyendo EGFR, p65, Akt y STAT3 en células de cáncer de ovario por tratamiento GSNO. C. STAT3 se inmunoprecipitó a partir de lisado de proteínas nitrosilado después de ensayo de interruptor de biotina y su biotinilación fue detectado por el anti-biotina-HRP usando análisis de Western blot. D. A2780, C200 y SKOV3 líneas celulares se trataron con GSNO (0,5 mM) o GSNO oxidado (0,5 mM) como control durante 2 horas seguido de análisis de inmunotransferencia para la detección de la fosforilación de tirosina de STAT3 en 705 residuos y STAT3 total. E. En condiciones experimentales similares como "D", A2780, se procesaron las células C200 y SKOV3 para el método de interruptor de biotina para la detección de STAT3. Muestra en el carril 4 se trató con GSNO como carril 2, excepto durante el procesamiento para el ensayo de interruptor de biotina; se omitió la adición de HPDP. El panel superior muestra las proteínas con biotina después de ensayo de biotina-interruptor. Nitrosylated STAT3 se detectó tirando hacia abajo de las proteínas con biotina por la estreptavidina agarosa seguido por el análisis de inmunoblot utilizando anticuerpos anti-STAT3. bandas inferiores muestran los niveles totales de STAT3 de entrada procesados para el ensayo interruptor de biotina.
GSNO nitrosila STAT3 y afecta a su capacidad para unirse al ADN
Una vez que se estableció que STAT3 se somete a nitrosilación en células cultivadas , hemos examinado aún más si STAT3 podría nitrosylated
in vitro
y si puede afectar a su capacidad de unión al ADN. Para ello, tomamos dos enfoques, primero hemos aislado extracto nuclear de SKOV3, que presenta mayores niveles basales de la forma fosforilada de STAT3 y tiene la capacidad de unirse motivo de unión a ADN sin estimulación STAT3. Se incubaron 20 g de extracto nuclear (NE) con GSNO o GSNO oxidado en presencia o ausencia de la TDT para 4 horas. Después de la incubación, la capacidad de unión al ADN de STAT3 se examinó incubando NE nitrosilado con los oligonucleótidos de cambio de gel de STAT3 conjugados con agarosa. Como se muestra en la figura 8A, la muestra GSNO tratado mostró nitrosilación de STAT3 como es evidente por el ensayo de interruptor de biotina y no podía ser empujado hacia abajo por los oligonucleótidos de cambio de gel de STAT3 conjugados con agarosa. La inclusión de la TDT en muestras abolió GSNO nitrosilación mediada de STAT3, lo que resulta en la unión de STAT3 en su motivo de unión a ADN. STAT3 también se ha demostrado para reclutar coactivador incluyendo p300. 0.001; 0,01;