Extracto
Antecedentes
Mientras que la vía /p65 clásica NF-kB se sabe están involucrados en la progresión del cáncer de próstata y se asocia con un mal resultado para el paciente, el papel de la proteína alternativa NF-kB /RelB no está bien definido. A continuación se analizó la activación de ambas vías de NF-kB en los tejidos de cáncer de próstata y correlacionar esta activación a signos clínicos de la enfermedad.
Métodos
Se empleó una técnica de inmunofluorescencia para visualizar múltiples simultáneamente y cuantitativamente la localización nuclear de p65 y RelB en 200 muestras incluidas en parafina. Epitelios se define utilizando marcadores fluorocromos apropiados y las señales de inmunofluorescencia resultantes se cuantificaron con un sistema de puntuación automatizado.
Resultados
Se encontró que la frecuencia nuclear de p65 resultó ser significativamente mayor en los tejidos tumorales en comparación con tejido adyacente normal, mientras que se redujo la frecuencia para RelB (p & lt; 0,001, prueba de Wilcoxon). Como se informó anteriormente, la frecuencia p65 nuclear se asoció con un riesgo de recurrencia bioquímica. Aunque, RelB frecuencia nuclear por sí sola no predijo la recurrencia, la presencia de RelB activado reduce el riesgo de recurrencia asociada con la activación de p65.
Conclusión
Por primera vez co-p65 /RelB se evaluó la distribución en tejidos de cáncer de próstata y sugirió una interferencia negativa entre las dos vías de NF-kB en la progresión del cáncer de próstata
Visto:. Labouba I, Le Page C, L Comunitaria, Kristessen T, X Usted, Péant B , et al. (2015) Potencial de la diafonía entre Alternativa y Clásica Rutas NF-kB en tejidos de cáncer de próstata, medido por un co-localización de inmunofluorescencia ensayo multi-tinción. PLoS ONE 10 (7): e0131024. doi: 10.1371 /journal.pone.0131024
Editor: Natasha Kyprianou, Universidad de Kentucky College of Medicine, Estados Unidos |
Recibido: 9 Febrero 2015; Aceptado: 26-may de 2015; Publicado: 17 Julio 2015
Derechos de Autor © 2015 Labouba et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel y sus archivos auxiliares
Financiación:. Presidente es el cáncer de la próstata (Universidad de Montreal, http://www.recherche.umontreal.ca/en/research-at-udem/our- investigación-unidades /perfil /unir /449 /pid /15 /) premio CUOG (http://www.cuog.ca) Réseau de recheche en cáncer (http://www.rrcancer.ca/fr/scientifique/biobanques/Lister /2). Visiopharm 'prestado apoyo en forma de un salario para el autor los conocimientos tradicionales, pero no tuvo ningún papel adicional en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. La función específica de este autor se articula en la sección 'autor' contribuciones
Conflicto de intereses:. La afiliación del autor los conocimientos tradicionales a la empresa Visiopharm no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas sobre los datos y compartir materiales .
Introducción
el cáncer de próstata es el cáncer más frecuentemente diagnosticado en los hombres de América del Norte y es la segunda causa de muerte por cáncer en los hombres después del cáncer de pulmón y colon [1]. Típicamente, el cáncer de próstata permanece localizada dentro de la glándula de la próstata. Sin embargo, puede también crece agresivamente más allá de la cápsula de la próstata y el plomo a la formación de metástasis [2]. Mientras que algunos pacientes con cáncer de próstata sólo requieren una vigilancia activa de la enfermedad, otros necesitan tratamientos más radicales [3, 4]. En la actualidad, la mayoría de los pacientes con cáncer de próstata localizado se someten a la cirugía, la radioterapia o la terapia de privación de andrógenos como tratamiento de primera línea [5]. Sin embargo, a pesar de las altas tasas de éxito obtenidos con estos tratamientos, el 25% de los pacientes desarrollan recurrencia bioquímica (BCR) después del tratamiento, la terapia hormonal y el progreso de una enfermedad más agresiva [6, 7]. Por lo tanto, un reto importante en el cáncer de próstata es la discriminación adecuado de los pacientes con una enfermedad latente o lenta progresión de los que tienen una forma más agresiva de cáncer. Tal discriminación ayudará tratamiento a medida adecuada para cada paciente. Para estratificar a los pacientes un mejor pronóstico del cáncer de próstata, la identificación de biomarcadores moleculares específicos capaces de predecir el resultado representaría un avance importante con respecto a las herramientas clínicas existentes. En este contexto, nuestro grupo ha sido el primero en abordar el potencial pronóstico de la subunidad p65 del factor nuclear (NF) -κB en cáncer de próstata [8] y poner de relieve un posible papel del factor nuclear (NF) -κB en la progresión del cáncer de próstata [9, 10].
La familia NF-B incluye cinco proteínas del factor de transcripción se caracterizan por su dominio de homología Rel-. No se subdividen en dos grupos principales: Clase I (NFκB1 y NFκB2) y clase II (RelA /p65, RelB, y c-Rel). El NFκB1 y NF-κB2 se traducen en las proteínas p100 y p105 que se procesan en sus respectivos p50 y p52 subunidades [11]. Dos vías principales de control de señalización NF-kappa B: la vía clásica, en la que el heterodímero p65 /p50 es la principal dímero activo, y de la vía alternativa en la que RelB /p52 es el dímero activo. En condiciones normales, NF-kB se mantiene inactiva en el citosol por la I? B o p100 proteínas. Durante la activación, en la vía clásica (IKKβ-dependiente), el complejo IKK fosforila I? B, la inducción de su ubiquitinación y la degradación por el proteasoma. Esto conduce a la translocación nuclear de la p65 /p50 o dímeros p50 /c-rel. En la vía alternativa (IKK-dependiente), el complejo IKK regula el procesamiento del precursor de p100, a diferencia de I? B [12-15], que genera p52 y la translocación nuclear de la p52 /RelB dímero.
Numerosas funciones moleculares y biológicas, tales como la inflamación [16, 17], angiogénesis [18], la supervivencia, la migración y la invasión [19] han demostrado que se asocia con la actividad de los factores nucleares NF-kB clásicos en la progresión del cáncer ( revisado en [20]). Mientras que el trabajo significativo se ha centrado en el estudio de la vía clásica NF-kappa B, recientemente, la atención se ha dirigido hacia la vía alternativa NF-kappa B, y en particular en lo que respecta a su influencia en la inflamación. Las funciones biológicas de NF-kappa B también implican la diafonía entre las vías clásica y alternativa a diferentes niveles, de señalización aguas arriba a las interacciones nucleares a través de la formación de diversos dímeros NF-kB. En función del contexto y de los estímulos, las dos vías pueden cooperar, o interferir negativamente, en la regulación de la expresión génica. Por otra parte, las funciones biológicas dirigidas por la interferencia de las dos vías siguen siendo poco conocidos y nunca se ha investigado en células de cáncer de próstata.
En el cáncer de próstata, varios estudios han informado de que tanto RelB y p65 pueden ser biomarcadores pronósticos putativos asociados con progresión de la enfermedad. Nosotros, y otros, hemos observado previamente por inmunohistoquímica (IHC) en el tejido de cáncer de próstata, que cantidades elevadas de p65 nuclear se asociaron con una enfermedad más agresiva [8, 21]. Posteriormente, se demostró que la localización nuclear de p65 es altamente predictivo de la invasión de los ganglios linfáticos [9] y se asoció con recurrencia bioquímica (BCR), ya sea solo o en combinación con ErbB activado /Akt señalización [21-25]. Más recientemente, se observó un aumento de la presencia de RelB nuclear en los tejidos de cáncer de próstata en comparación con tejidos no neoplásicos, lo que sugiere que la vía alternativa NF-kappa B se activa también durante el curso de la progresión de la enfermedad [10]. Además, se demostró en un
in vitro
modelo que la inhibición de la expresión RelB aumenta la proliferación de células de cáncer de próstata 22Rv1 resistente a la castración y estimula la autofagia celular [26]. Otros estudios encontraron que RelB aumenta la radiosensibilidad de las células resistentes a la castración [27-30], aparentemente por hasta la regulación de IL-8 [31]. En línea con estas primeras observaciones, también se demostró que RelB se sobreexpresa en las glándulas de la próstata en respuesta a la privación de andrógenos [32] y el tratamiento de radiación [33], y también induce la expresión de β-galactosidasa de α2,3-sialiltransferasa, un gen involucrado en la expresión de gangliósidos y la progresión del cáncer [34]. Más recientemente, se demostró una interferencia negativa entre RelB y AR, y la asociación con la supervivencia y el cáncer metastásico [35].
Con el fin de estimar el papel de RelB y la diafonía entre la clásica y la alternativa NF-kB vías, se implementó una técnica de fluorescencia de múltiples tinción con el fin de analizar cuantitativamente la presencia simultánea de p65 nuclear y RelB en los mismos núcleos de tejido de cáncer de próstata. La cuantificación de la señal fluorescente fue apoyada por un sistema automatizado. Para evaluar el papel biológico de ambas actividades ruta de NF-kB, correlacionamos la localización nuclear de p65 o RelB con parámetros clínicos y el riesgo de recurrencia bioquímica para undrstand mejor el papel potencial de la diafonía ruta de NF-kB en la progresión del cáncer de próstata.
Materiales y Métodos
cohorte de pacientes
El presente estudio se basó en una cohorte retrospectivo de 200 pacientes con cáncer de próstata cuya formalina fijo parafina embebido (FFPE) muestras de cáncer de próstata primario, eran utilizado para construir los microarrays de tejidos (TMA). Todos los pacientes fueron sometidos a cirugía entre 1992 y 2006 y el consentimiento informado por escrito proporcionada. Todos los consentimientos fueron presentadas de forma segura en un lugar cerrado con llave y se escanean consiente en una carpeta protegida por contraseña electrónica. El criterio de inclusión para este estudio retrospectivo fue la ausencia de cualquier tratamiento antes de la prostatectomía radical (PR). Tras un análisis de detección de los datos clínicos, 11 pacientes fueron excluidos del estudio, ya que no cumplían con los criterios de inclusión. El promedio de seguimiento de los pacientes fue de 96 meses. BCR (Bioquímica de recurrencia) se definió sobre la base de un PSA (antígeno prostático específico) recaída por encima de 0,3 ng.ml
-1 después de la fecha de la cirugía (RP). intervalo libre de recurrencia se define como el tiempo entre el RP y la fecha del primer aumento de PSA por encima de 0,3 ng.ml
-1. La puesta en escena final, la clasificación y el diagnóstico histológico se basó en el informe de patología clínica del Hospital Notre-Dame, (CHUM, Montreal, QC, Canadá). Ética aprobación se obtuvo de la junta de revisión correspondiente (Comité d'éthique de la Recherche du CHUM). consentimientos por escrito se presentaron de forma segura en un lugar cerrado con llave, y consiente de barrido electrónico se guardan en una carpeta electrónica protegido por contraseña. Ética aprobación se obtuvo de la junta de revisión correspondiente (Comité d'éthique de la Recherche du CHUM). Los principales parámetros clínicos de los 189 casos de la cohorte son: El seguimiento medio, 95 meses; 49% puntuación de Gleason & gt; 7; puntuación de Gleason 44% = 7; 7% puntuación de Gleason & lt; 7; 18 casos con afectación de vesículas seminales contra 170; sin 26% con extensión extra-prostática, el 32% con un margen quirúrgico positivo; 3% con la invasión de los ganglios linfáticos; 142 con el estadio patológico 2 y 47 con estadio patológico 3; el tipo específico de cáncer es del 3% y la recurrencia bioquímica es del 28%
microarrays de tejidos
A partir de muestras de tejido humano FFPE, se seleccionaron áreas tumorales basados en los comentarios de hematoxilina /eosina (H & amp;. E ) teñidas se desliza por un patólogo. tumor bloques FFPE A continuación, se realizó una biopsia utilizando una aguja arrayer tejido diámetro de 0,6 mm y los núcleos resultantes fueron dispuestos en una rejilla en un bloque de parafina receptor. Cada conjunto TMA contenida, un núcleo de una muestra de tumor y un núcleo de un tejido glandular prostática adyacente normal para un total de 100 pacientes. Estos TMA se construyeron por duplicado para el análisis de dos núcleos independientes de cada tipo de tejido por casos. TMA muestras se seccionaron, se tiñeron por ambos H & amp;. E-e inmunohistoquímica (IHC) de alto peso molecular citoqueratina (hmck), y posteriormente se sometió a una revisión de la patología independiente para confirmar y anotar la histología de cada núcleo
la inmunohistoquímica (IHC)
IHC se realizó mediante una tinción XT Benchmark automático (Ventana Medical System Inc. VMSI), Tucson, EE.UU.). La recuperación del antígeno se llevó a cabo con la Ventana de la célula acondicionado 1 de reactivo (VMSI#950-124). Los anticuerpos primarios utilizados fueron: anti-p65 (sc-8008), anti-RelB (sc-226), anti-citoqueratina (CK) 18 (sc-6259) y anti-PSA (sc-7638), todos obtenidos de Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA) y anti-CK19 (MS-198-P0) de Thermo Scientific Lab Vision (Ottawa, ON, Canadá). La especificidad de los anticuerpos anteriores contra p65 y RelB se verificó previamente por Western-blot [26, 36]. Los anticuerpos se diluyeron de 1:25 a 1: 1000 en un tampón diluyente de anticuerpos (# VMSI ADB250), a excepción de anti-PSA que se diluyó en solución salina tamponada con fosfato (PBS). anticuerpos diluidas se dispensan de forma manual en las diapositivas y se incubaron a 37 ° C durante 60 min. Las reacciones se llevaron a cabo usando el kit de detección de UltraView DAB (VMSI#760-500) y portaobjetos se contratiñeron con hematoxilina y reactivo de azulado (VMSI#760-2021 y#760-2037). Todas las secciones fueron escaneados con un objetivo de 20x 0.75NA con una resolución de 0,3225 mm, utilizando el escáner de diapositivas VS-110 (Olympus, Richmond Hill, ON, Canadá) y se analizaron fuera de juego a lado con HW tinción de citoqueratina para dar cuenta de las glándulas benignas.
inmunofluorescencia (IF)
Hemos producido una máscara epitelial utilizando varios antígenos epiteliales específicos para distinguir estromales y epiteliales componentes dentro del tejido. Para asegurar la cobertura de todas las células de cáncer de próstata, incluso en su estado más indiferenciado, se utilizó un cóctel de CK18, CK19 y PSA que todos fueron etiquetados para emitir en el canal de color naranja. Las diapositivas también se tiñeron con DAPI (azul) para identificar los núcleos. Los anticuerpos secundarios contra p65 y RelB se marcaron a emitir en los canales rojo y verde, respectivamente. Esto nos permitió distinguir la tinción específica de p65 y RelB en el núcleo y el citoplasma de las células epiteliales
En concreto, la recuperación de antígenos se realizó por primera vez con la célula acondicionado 1 (VMSI;#950-124). Utilización del banco Marcos tinción automatizada XT (Ventana Medical System Inc.). Los anticuerpos primarios contra p65 y RelB se diluyeron 1: 125 en PBS, aplicada manualmente a las diapositivas, y se incubaron a 37 ° C durante 60 min. Los siguientes pasos se realizan manualmente en el banco en condiciones de proteger a las diapositivas de la luz. Ambos anticuerpos fluorescentes secundarios se incubaron simultáneamente durante 45 min a temperatura ambiente (RT): anti-ratón Cy5 (# A10524, Life Technologies Inc., ON, Canadá) por p65 y anti-conejo Alexa Fluor 488 (A488) (# A11008, Life Technologies Inc.) para RelB, fueron tanto diluyó 1: 250 en 1X PBS. Después de dos lavados sucesivos con PBS 1X, TMA diapositivas se bloquearon durante 60 min con el ratón-On-Mouse reactivo de bloqueo (1 gota en 250 l de PBS, MKB-2213, Vector Laboratories, CA, EE.UU.) y después se incubaron durante 90 min a TA con anti-PSA (1: 100 en PBS). Las diapositivas TMA se lavaron dos veces y se incubaron durante 45 min a TA con un fluorescente Cy3 secundario anti-cabra (# 705-165-003, Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., PA, EE.UU.) diluido a 1: 250 en 1X PBS. Las láminas fueron entonces bloqueado una vez más con el ratón-On-Ratón reactivo de bloqueo durante la noche a 4 ° C. Posteriormente, se incubaron durante 90 min a TA con una mezcla de anti-CK18 y anti-CK19 (ambos a 1: 100 en 1X PBS) y luego 45 min a TA con secundario fluorescente anti-ratón de Alexa Fluor 546 (anticuerpo A546) (# A10036, Life Technologies Inc.). Por último, los portaobjetos se incubaron durante 15 min a TA con un 0,1% de solución de Negro Sudán en 70% de etanol para apagar la auto-fluorescencia tejido (v /w). Las diapositivas fueron montadas con Prolong Oro Antifade MOUNTANT con DAPI (P-36931, Life Technologies Inc.) para los núcleos de tinción. Entre cada paso, TMA diapositivas se lavaron dos veces con 1X PBS. Los portaobjetos se almacenó a 4 ° C y examinó al día siguiente. Un portaobjetos de control negativo TMA también se realizó en paralelo y se incubó con PBS 1X en lugar de todos los anticuerpos primarios.
La tinción cuantificación
La tinción y la puntuación se realizaron cegado al estudio de punto final. Las secciones de tejido fueron escaneados con un microscopio Olympus y escáner de diapositivas VS110 relacionado con un software de visualización olyvia (xvViewer.exe). a continuación, la tinción fluorescente se cuantificó con el software VisiomorphDP (Visiopharm, Dinamarca) lo que permite un análisis de imagen automatizado. Se utilizó la tinción por medio de marcadores /PSA CK18 /CK19 para limitar el análisis a las zonas epiteliales como la región de interés#1 (ROI#1), mientras que DAPI sirvió para evaluar la fluorescencia solamente en los núcleos (ROI#2) (S1 Fig) . Núcleos con ROI definido#1 y#2 se revisaron manualmente para garantizar una adecuada selección de las células epiteliales y para retirar el tejido circundante, con necrosis o inflamatorias zonas de la ROI. valores continuos de la intensidad de fluorescencia para ambos ROI#1 y#2 se recogieron entonces por el software VisiomorphDP y se transfirieron a Excel para definir puntuaciones de NF-kB epiteliales y nucleares. Las señales positivas y negativas se basan en los valores umbral designado (media intensidades + desviación estándar) y se utilizan para calcular la frecuencia de núcleos positivos por núcleo. El promedio de núcleos de tumor del mismo paciente se utilizó para el análisis. La correlación intraclase (CCI) entre los núcleos duplicados fue de 0,68 y 0,70 (
p Hotel & lt; 0,001, Spearman). Para p65 nuclear y RelB nuclear respectivamente
Los análisis estadísticos
Los análisis estadísticos se realizaron con el software SPSS 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EE.UU.). Una comparación entre los núcleos adyacentes tumorales y normales emparejados se evaluó mediante una prueba no paramétrica de Wilcoxon. La correlación con las variables clinicopatológicas se estimó con un test de correlación de Spearman no paramétrico. Debido a la naturaleza inherente de inmunofluorescencia, los núcleos se consideraron positivos para nuclear NF-kappa B cuando los valores de por lo menos 5% durante la tinción de fondo. Utilizamos receptor Operativo característico (ROC) curvas de cálculo a partir de la frecuencia de todos los núcleos para determinar el valor umbral para cada subunidad de NF-kB en el análisis de Kaplan-Meier. las curvas de supervivencia de BCR-libres se representaron usando el estimador de Kaplan-Meier y se utilizó la prueba de log-rank para evaluar las diferencias significativas. La relación de p65 /RelB se calculó a partir de la frecuencia de p65 nuclear en comparación con RelB nuclear. Los modelos de riesgo proporcional univariado y multivariado (regresión de Cox) fueron utilizados para estimar los coeficientes de riesgo para cada NF-kB variable como categórica, mientras que los valores que faltan no fueron considerados. El análisis multivariante se realizó utilizando un modelo de riesgo Introduzca por etapas en el análisis univariado que se requiere para la entrada en el modelo. Un tamaño de muestra de n = 10 k se consideró antes de aplicar el modelo multivariado (n = número de eventos, k = número de variables). Las covariables no se depende del tiempo. clinicopathological variables adicionales incluyen PSA pre-operatorio, la puntuación de Gleason, estado de los márgenes quirúrgicos, la extensión extra-prostática y compromiso de la vesícula seminal.
Ética Declaración
La aprobación ética para el estudio se obtuvo de la adecuada junta de revisión (Comité d'éthique de la Recherche du CHUM). Un escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los participantes.
Resultados
análisis de inmunofluorescencia multi-tinción de p65 y RelB
El objetivo del estudio es analizar y p65 en RelB cáncer de los tejidos normales adyacentes epiteliales de la próstata o malignas en la misma diapositiva TMA utilizando un proceso cuantitativo y semi-automatizado. Un análisis cuantitativo proporciona datos continuos, lo que permite una gama más amplia de detección y determinación más precisa de la tinción de baja y alta intensidad. Con el fin de facilitar este proceso y lograr la máxima especificidad, se optó por aplicar una técnica de tinción de múltiples inmunofluorescencia (IF).
En primer lugar, se seleccionaron áreas epiteliales para ser analizadas. Debido a su conocida expresión constitutiva en las células epiteliales prostáticas, se eligió la citoqueratina 18 (CK18) para identificar las células epiteliales en nuestros ejemplares [37]. Sin embargo, se observó que las muestras de tejidos manchados por IHC producidas CK18 niveles de expresión variables y que la tinción fue más débil en los tumores pobremente diferenciados (datos no presentados), lo que reduce la precisión de la identificación de células tumorales en los tejidos de cáncer de próstata avanzado. Para superar esto, se seleccionaron CK19 y PSA como antígenos epiteliales, ya que son conocidos por ser altamente expresado en las células epiteliales prostáticas [37, 38]. Visual verificación de la tinción simultánea de CK18, CK19 y PSA con tintes fluorescentes naranja (A546 para CK18 y CK19, y Cy3 para PSA) confirmó la cobertura epitelial completo por este cóctel tinción tri-antígeno, proporcionando la sensibilidad y la especificidad requerida para identificar epitelial prostática células, independientemente del nivel de diferenciación de los tejidos (S1 Fig).
la máscara epitelial naranja se utilizan con la tinción nuclear DAPI para restringir cuantificación de p65 y RelB epitelial núcleos. La p65 subunidades y RelB se tiñeron con Cy5 (rojo) y colorantes A488 (verde), respectivamente (fig 1). Después de este cuádruple SI tinción, se realizó un análisis cuantitativo de p65 y RelB a partir de imágenes escaneadas utilizando el programa de análisis de imágenes de inmunofluorescencia VisiomorphDP. Se definió un valor umbral de intensidad de fluorescencia para discriminar señales fluorescentes positivos y negativos, que se utilizó para determinar la frecuencia específica (%) de los núcleos p65- o RelB- positivas de cada núcleo de tejido (incluyendo núcleos dobles positivos) (Fig 1).
A. tinción epitelial con CK18, CK19 y PSA define la máscara epitelial usando fluorocromos naranja (A546, Cy3). B. Identificación de área epitelial (presentado en el gris para un contraste óptimo en los análisis posteriores) como retorno de la inversión#1 (región de interés#1). Identificación de los núcleos (gris rodeado de rastreo rojo) como ROI#2 de ROI predefinida#1. P65 y fluorescencia RelB fueron evaluados posteriormente por separado en el ROI#1 y#2. tinción C. RelB con colorante verde fluorescente (A488) y la tinción p65 con colorante fluorescente rojo (Cy5). Los pasos 1, 2 y 3 corresponden al proceso de análisis de fluorescencia siguió, utilizando el software de Visiomorph DP.
Comparación de la expresión de p65 mediante inmunohistoquímica y análisis de inmunofluorescencia cuantitativa automatizada
TMA, que contiene el paciente igualada núcleos de los tejidos tumorales prostáticas 200 y en el epitelio normal adyacente estaban manchadas, escanean y se evaluó la p65 y la señal RelB positivo. Después de la revisión de los datos clínicos se excluyeron 11 casos, ya que no cumplían con los criterios de inclusión más. La presencia de p65 y RelB se observó principalmente en el epitelio, con los dos compartimentos citoplásmicos y nucleares que presentan tinción positiva (Fig 2A). Utilizando el programa de puntuación automatizado, hemos sido capaces de identificar negativo, p65 sola (Cy5) o RelB (A488) y dobles (Cy5 /A488) núcleos teñidos (Figura 2A).
A. Aumento (40X) poner de relieve las estructuras glandulares en tejidos de cáncer de próstata. Combinar: las imágenes superpuestas de RelB (A488) en verde, p65 (Cy5) en rojo y núcleos (DAPI) en azul, en normal adyacente (arriba) o cáncer de los tejidos (abajo). Las flechas muestran núcleos teñidos. B. cuantificación comparativa de IHC (izquierda) y SI (derecha) tinción de p65. Los gráficos muestran la distribución de frecuencias de p65 nuclear como evaluó visualmente (IHC) o automáticamente (IF). C. Frecuencia de p65 nuclear (izquierda), RelB (medio) y los núcleos teñidos dobles (derecha) en los tejidos adyacentes y tumorales normales. La comparación entre los núcleos normales y tumorales adyacentes se realizó mediante el test de Wilcoxon.
resultados de la cuantificación Para evaluar el desempeño de esta técnica si, implementado para la cuantificación de marcadores nucleares en el tejido de cáncer de próstata, se compararon del análisis automatizado con los resultados obtenidos mediante la tinción IHC tradicional. En ambos casos, se evaluó la frecuencia de núcleos teñidos p65. Se obtuvo una correlación significativa entre los dos conjuntos de datos (r = 0,410,
p
& lt; 0,001 Spearman), que está en el mismo rango que la correlación entre los núcleos duplicados dentro de la técnica dada. El método tradicional de IHC, basado en puntuación visual, era incapaz de distinguir entre la baja tinción (o no), lo que conduce a una sobreestimación de los núcleos de expresión de p65 negativos (Figura 2B). Usando las curvas de estimación de Kaplan-Meier, también comparó la asociación entre la frecuencia de supervivencia nuclear p65 y el riesgo de BCR, como se ha analizado anteriormente en numerosas otras cohortes de cáncer de próstata [21, 22, 25, 39]. Se encontró p65 nuclear para asociarse de manera similar y significativamente con el riesgo de BCR tanto en el tradicional IHC y el software a analizar muestras IF (log rank = 4,38,
p = 0,036
y log rank = 4,83,
p
= 0,0028, respectivamente). En conjunto, estos resultados validan el uso de análisis automatizado de IF para la evaluación de NF-kB localización subunidad y cuantificación en tejidos de cáncer de próstata.
Análisis de la distribución nuclear de p65 y RelB en tejidos de cáncer de próstata
Mientras que la localización nuclear de p65 se incrementó en los tumores de próstata en comparación con los tejidos normales adyacentes (figura 2C,
p Hotel & lt; 0,000, prueba de Wilcoxon), RelB exhibió una mayor expresión en el tejido normal adyacente frente a tejido tumoral (p = 0,001, prueba de Wilcoxon, la figura 2C). El porcentaje de dobles p65 manchado núcleos /RelB no mostró ninguna variación significativa entre los tejidos normales y tumorales (Fig 2C)
.
En núcleos tumorales, la activación de la vía clásica, como se ve por p65 nuclear, fue significativamente correlacionada con la activación de la vía alternativa, como se representa por la localización nuclear RelB (r = 0,522, p & lt; 0,001 Spearman). Para estimar la cantidad de interacción entre las dos vías de NF-KB, se comparó la frecuencia nuclear de cada subunidad en presencia o ausencia de la otra subunidad. Cuando se expresó RelB nuclear, hubo un aumento concomitante en la frecuencia de localización nuclear p65 en comparación con los núcleos sin RelB nuclear (27% y 19%, respectivamente). Del mismo modo, la presencia de p65 nuclear se asoció con un aumento de la localización nuclear de RelB (18% y 10%, respectivamente).
Correlación de variables NF-kB con los parámetros clínico-patológicas
a continuación se evaluó la correlación entre p65 nuclear (que representa la activación de la vía clásica) o RelB (que representa la activación de la vía alternativa) y clinicopathological parámetros. Aunque la expresión nuclear de estas dos proteínas no se correlacionó significativamente con la mayoría de los parámetros de la agresividad del cáncer de próstata, no había una correlación significativa entre p65 nuclear y la participación de la vesícula seminal (r = 0,121, p = 0,048, Spearman, Tabla 1) .Además, había una tendencia entre RelB nuclear y la puntuación de Gleason paciente (r = -0,105, p = 0,081, Spearman, Tabla 1).
el análisis de la co-expresión de p65 y RelB
Para evaluar el papel de cada ruta de NF-kB en la progresión del cáncer de próstata y la diafonía de potencial entre las dos vías, se utilizó la recurrencia bioquímica (BCR) como un indicador funcional de estas actividades. La frecuencia nuclear de p65 se asoció con BCR general (
p = 0,028
, log rank = 4,843, Figura 3A). Un análisis de regresión de Cox confirmó la asociación entre p65 y BCR en univariable (HR = 1,93,
p = 0,017
) y los modelos multivariados (HR = 3,15,
p = 0,003
), incluyendo parámetros clínico como la puntuación de Gleason, extensión extra-prostática, invasión ganglionar, compromiso de la vesícula seminal, y los márgenes quirúrgicos (Tabla 2). En contraste con la p65, la estimación de Kaplan-Meier y análisis de regresión de Cox univariante mostraron que el estado RelB por sí sola no se asoció con BCR (
p = 0,301
, la figura 3B y Tabla 2). Sorprendentemente, la frecuencia de p65 /RelB doble núcleos positivos no fue significativamente predictivo de BCR pero no se observó una tendencia hacia un peor pronóstico (
p
= 0,078, figura 3C).
Kaplan-Meier libre de recidiva bioquímica curvas de supervivencia A. alta (& gt; 20%) y baja (& lt; 20%) frecuencia de p65 nuclear en el epitelio de los tejidos de cáncer. B. alta (& gt; 5%) y baja (& lt; 5%) de frecuencia de RelB nuclear en el epitelio de tejidos de cáncer. Significación (
p
) se indica mediante log rank. C. Doble tinción epitelial nuclear de p65 y RelB. D. epitelial y la tinción nuclear de p65 y RelB. La variable negativo kappa B representa los pacientes sin núcleos de tejido positivas para p65 y RelB. La variable de p65 solo o RelB representa por sí solo pacientes positivos para p65 nuclear o solamente RelB nuclear. La variable de p65 + RelB son pacientes con presencia de ambas subunidades nucleares en el mismo núcleo. E. Análisis de la proporción del epitelio de p65 nuclear para RelB en núcleos de tejido dentro de tanto p65 y tinción RelB. La relación p65 /RelB representa la frecuencia de p65 a la frecuencia de RelB. La variable de p65 & gt; RelB representa una relación de al menos 2 veces más p65 de RelB; p65-RelB representa una proporción entre 0,50 y 2 veces, y RelB & gt; p65 representa una proporción de al menos 2 veces más RelB de p65
La actividad y la interacción entre el p65 y RelB. vías pueden variar ampliamente dentro de un solo tejido, que puede contener un patrón mixto de expresión con células que muestran solamente p65 o solamente RelB mientras que otros son doble positivas. Para determinar las funciones individuales de p65 y RelB, se compararon los tejidos del paciente con la activación de una sola vía, representada por la frecuencia nuclear de cada p65 o RelB, y los pacientes sin actividad de NF-kB (figura 3D). Los pacientes con sólo una actividad de p65 mostraron un tiempo significativamente más corto de recurrencia en comparación con los pacientes sin actividad de NF-kB (138 meses y 98 meses, respectivamente, log rank = 8,8,
p = 0,002
,) o en comparación con los pacientes con sólo el RelB (
p = 0,021
, Log Rank = 5.4, la figura 3D). Esto confirma que la vía clásica NF-kB promueve fuertemente la progresión del cáncer de próstata. Por el contrario, en nuestra cohorte de pacientes, no se encontró actividad RelB solo para afectar a la recurrencia en comparación con los pacientes sin la activación de NF-kB
(p = 0,741
, figura 3D). Curiosamente, la presencia nuclear de ambos p65 y RelB en el mismo núcleo no se asoció significativamente con el BCR (
p = 0,252
), lo que sugiere que RelB puede contrarrestar el efecto biológico de p65.
Para definir el potencial de la función de RelB sobre la actividad de p65, se investigó el impacto de cada vía en el otro en proporciones variables. La relación de p65 nuclear y RelB se utilizó para separar los tejidos de pacientes con doble tinción de p65 y RelB (Fig 3E). Se hicieron tres categorías: los pacientes con una mayor proporción de p65 nuclear de RelB (mayor de 2 veces), los pacientes con una mayor proporción de RelB nuclear de p65, y los pacientes con números relativamente iguales de núcleos p65- y RelB-positivos (hasta 2 veces de diferencia). Como era de esperar, un alto nivel de p65 nuclear se asoció con un riesgo significativo de BCR (log rank = 6,8,
p = 0,026
figura 3E) en comparación con los casos nivel similar de p65 y RelB.