Extracto
Fondo & amp; Objetivos
la síntesis de proteínas
Aunque los cánceres hepatocelulares (CHC) surgen con frecuencia en el contexto de la fibrosis y una respuesta regenerativa hepática que requiere crecimiento de nuevas células, las estrategias terapéuticas para estos tipos de cáncer no se han dirigido. Silvestrol, un rocaglate aislado de
Aglaia
foveolata
, puede inhibir la síntesis de proteínas mediante la modulación de la iniciación de la traducción a través del factor de iniciación eucariótico 4A. En este estudio, se evaluó la eficacia terapéutica de silvestrol para el CHC.
Métodos
La eficacia de silvestrol se examinó utilizando células de HCC humanos
en
in vitro
utilizando un modelo de xenoinjerto de células tumorales en un ortotópico de hígado fibrótico. El impacto de silvestrol en el hígado se evaluó
en
in vivo
en ratones de tipo salvaje.
Resultados
inhibe el crecimiento celular
Silvestrol con una IC50 de 12,5 a 86 nM en cuatro líneas celulares de HCC diferentes.
En
in vitro
, silvestrol aumento de la apoptosis y la caspasa 3/7 actividad acompañados de pérdida de potencial de membrana mitocondrial y la disminución de la expresión de MCL-1 y Bcl-XL. Se observó un efecto sinérgico cuando se silvestrol se combinó con otros agentes terapéuticos, con un índice de reducción de la dosis de 3,42 veces con sorafenib y 1,75 veces con rapamicina en un efecto fraccional de 0,5.
En
in vivo
, se observó un efecto antitumoral con 0,4 mg /kg silvestrol comparación con los controles después de una semana, y la supervivencia de ratones portadores de tumores se ha mejorado con una mediana de supervivencia de 42 y 28 días en los grupos de silvestrol y de control, respectivamente. El efecto sobre la supervivencia no se observó en xenoinjertos ortotópico en hígados no fibróticas. tratamiento Silvestrol
en
in vivo
no alteró la estructura del hígado.
Conclusiones
Estos datos identifican silvestrol como una novela, estructuralmente único fármaco con actividad anticancerosa potente para el CHC y apoyar el valor potencial de la orientación iniciación de la traducción en el tratamiento del CHC
Visto:. Kogure T, Kinghorn AD, Yan I, Bolon B, Lucas DM, Grever MR, et al. (2013) Potencial terapéutico de la Traducción del inhibidor Silvestrol en cáncer hepatocelular. PLoS ONE 8 (9): e76136. doi: 10.1371 /journal.pone.0076136
Editor: Manlio Vinciguerra, University College de Londres, Reino Unido
Recibido: 1 de junio de 2013; Aceptado: 23 Agosto 2013; Publicado: 26 Septiembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Kogure et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones de los Institutos nacionales de Salud, DK069370 (TP) y el Instituto Nacional del cáncer, CA125066 P01 (ADK). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la alta incidencia global y la mortalidad del cáncer hepatocelular (HCC) hace hincapié en la necesidad de terapias que son eficaces para mejorar la supervivencia [1]. HCC es muy refractaria a enfoques terapéuticos convencionales, y hay una necesidad de agentes terapéuticos más eficaces para el control de estos tipos de cáncer. Cure es posible sólo con resección quirúrgica o trasplante, pero estos no son posibles para la mayoría de los pacientes con este tipo de cáncer, muchos de los cuales se presentan con enfermedad más avanzada. Estudios recientes han implicado a varios mecanismos de señalización diversa en la patogénesis molecular de este cáncer [2]. Estos representan la heterogeneidad de las respuestas y limitan la utilidad de las intervenciones terapéuticas usando estrategias convencionales que tratan de modular dianas moleculares específicas [3,4]. En la actualidad sólo un agente, sorafenib, está disponible para la terapia sistémica con modestos resultados en la mejora de la supervivencia [5].
El crecimiento del tumor requiere nueva síntesis de proteínas y por lo tanto está asociado con un aumento en la traducción de proteínas. Directamente orientadas a la traducción podría ser una estrategia útil terapéutica, y merece consideración para el CHC [6,7]. Varios estudios han reportado efectos oncogénicos que surgen de la expresión ectópica del factor de iniciación eucariota eIF-4E, que es un factor limitante de la velocidad para la inhibición de la traducción [6]. Por otra parte, un efecto anti-tumor de objetivo baja regulación de eIF-4E se ha demostrado en varios estudios que usan modelos de xenoinjertos tumorales diversa. Orientación de otros componentes de la maquinaria de traducción de proteínas también han sido eficaces en la modulación de crecimiento de células tumorales. eficacia antitumoral modesto para el CHC se ha demostrado usando inhibidores de mamíferos objetivo de rapamicina (mTOR) y la vía que están implicados en la síntesis de proteínas [8-10].
El silvestrol rocaglate es una ciclopenta [b] benzofurano flavagline de la
Aglaia
género de la familia Meliacae [11-13]. Como miembro de una nueva clase de medicamentos con una estructura única, silvestrol es un compuesto atractivo para apuntar HCC [14]. Silvestrol tiene la propiedad de modular la traducción mediante la prevención de ribosoma de la carga en las plantillas de ARNm por la orientación del factor de iniciación eucariótico, eIF-4A [15,16].
In vivo
actividad antitumoral se ha demostrado para silvestrol en neoplasias hematológicas como la leucemia linfocítica crónica, leucemia linfocítica aguda y linfoma de células del manto [16-18], probablemente a través de la disminución de la pro de vida media corta proteínas o de crecimiento pro-supervivencia, incluyendo la ciclina D y MCL-1. En estudios con animales que utilizan el modelo Eμ-myc, silvestrol puede mejorar la sensibilidad a los agentes estándar tales como la doxorrubicina [15]. Por lo tanto, hemos realizado estudios pre-clínicos para evaluar el papel de este compuesto único para el tratamiento de HCC. Nuestros datos muestran que silvestrol es un agente citotóxico y citostático eficaz para células de HCC tanto
in vitro Opiniones y en el tumor ortotópico xenoinjertos de células
in vivo
, y apoyar un mayor desarrollo de este agente como un agente terapéutico para el HCC.
Materiales y Métodos
Ética declaración
se realizaron todos los estudios en animales siguiendo procedimientos y directrices Institucional de Cuidado de animales y el empleo en la Universidad Estatal de Ohio, bajo un protocolo aprobado.
líneas celulares
líneas celulares de HCC humano, PLC /PRF /5 (PLC), HepG2, Hep3B y Huh7 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA) y se cultivaron en el mínimo medio esencial con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de mezcla de antimicótico /antibiótico. Luciferasa que expresan PLC (PLC-luc), que fueron generados por transfección estable con luciferasa que expresan plásmido phCMV que contiene el ADNc que codifica el fuego gen de la luciferasa y FL, fueron amablemente proporcionados por el Dr. Ching-Shih Chen (Facultad de Farmacia, Universidad del Estado de Ohio, Columbus, OH). autentificación línea celular fue realizado por laboratorios de ADN Genetica (Cincinnati, OH).
Ensayo de citotoxicidad
La viabilidad celular se evaluó utilizando el kit de ensayo acuosa CellTiter 96 (Promega, Madison, WI). Las células (5.000 /pocillo) se sembraron en placas de 96 pocillos (BD Biosciences, Rockville, MD) y se incubaron a 37 ° C durante la noche antes de la adición de agentes experimentales. La viabilidad celular se evaluó después de 72 horas. IC
50 valores se calcularon utilizando software XLfit (IDBS, Burlington, MA). interacciones fármaco-fármaco se evaluaron usando una relación fija de concentraciones. Los resultados se analizaron mediante el análisis de los efectos mediana y el índice de combinación (IC) se obtiene a partir del programa de software Calcusyn (Biosoft, Cambridge, Reino Unido).
Ensayos de apoptosis
Las células se cultivaron en 4 -Bueno cámara de diapositivas (5 x 10
4 células por pocillo) en 500 l de medio y se incubaron a 37 ° C con 5% de CO
2. Se añadieron 100 nM de silvestrol y el grado de apoptosis de las células se evaluó después de 24 horas. Las células con cambios morfológicos de muerte celular apoptótica se cuantificaron mediante microscopía de fluorescencia después de la tinción con 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Para la caspasa-3/7 ensayos, las células se cultivaron en placas de 96 pocillos (5 x 10
3 células por pocillo) y fueron 100 nM de silvestrol para un máximo de 24 horas). la actividad de caspasa-3/7 se evaluó mediante un ensayo luminométrico (caspasa-Glo 3/7 ensayo, Promega Corp., Madison, WI).
Medición de la membrana mitocondrial potencial
La interrupción de la mitocondria el potencial de membrana se detectó mediante el uso de JC-1 (APO LOGIX ™ JC-1, Peninsula Laboratories Inc., San Carlos, CA). Para la microscopía de fluorescencia, las células se cultivaron en un portaobjetos de cámara de 4 pocillos (5 x 10
4 células por pocillo) para microscopía de fluorescencia, o en placas de 96 pocillos (5 x 10
3 células por pocillo) durante fluorométrico detección. Las células fueron incubadas con 100 nM de silvestrol durante 24 horas, a continuación, con 5 mg /ml de JC-1 a 37 ° C durante 15 min. mitocondrias intactas son detectados como agregados de color rojo con emisión a 590 nm y despolarización de la membrana mitocondrial se detectó como fluorescencia verde con emisión a 530 nm.
Western Blot
Las células cultivadas en placas de 6 pocillos se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se lisaron mediante incubación durante 30 minutos en 600 l de tampón de lisis celular con inhibidores de proteasa (Complete lisis-M-EDTA libre, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania). las concentraciones de proteína de lisado se midieron usando un kit de ensayo de ácido bicinconínico (Kit de ensayo de proteínas, Pierce Biotechnology, Rockford, IL). ~ 25 mg de proteínas se mezclaron con NuPAGE LDS tampón de muestra (Invitrogen, Carlsbad, CA) y las proteínas separadas por electroforesis en dodecilsulfato de sodio en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) utilizando NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris geles (Invitrogen). Después de la electroforesis, las proteínas en los geles se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Las membranas se bloquearon con albúmina de suero bovino 5% (BSA) en solución salina tamponada con Tris, y se incubaron con anticuerpos primarios y IRDye700- y marcadas con IRDye800 anticuerpos secundarios (Rockland, Gilbertsville, PA) según las instrucciones del fabricante. La proteína de interés se visualizó y se cuantificó usando el Sistema de LI-COR Odyssey Infrared Imaging (LI-COR Bioscience, Lincoln, NE).
La inducción de la fibrosis hepática en ratones desnudos
Seis semanas imunodeficient ratones machos, viejas (NCR desnudo) se obtuvieron de Taconic (Hudson, Nueva York) y la comida y el agua alimentada
ad libitum
. Los ratones fueron mantenidos de acuerdo con los procedimientos y directrices Institucional de Cuidado de Animales y el empleo en virtud de un protocolo aprobado. La fibrosis hepática se indujo en ratones desnudos por inyección subcutánea de 0,4 g /kg de tetracloruro de peso corporal de carbono (CCl
4) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) dos veces por semana. CCl
4 se diluyó en aceite de oliva (CCl
4: aceite de oliva = 1: 7) y se esterilizó usando 0,22 mm-filtro antes de su uso. Para los estudios de validación para verificar y cuantificar la fibrosis hepática, CCl
4 Se administró a los ratones desnudos dos veces por semana. Después de 6, 9, o 12 semanas, los hígados se extrajeron y se fijaron con formalina para el examen patológico. Después de teñir el tejido hepático con tricrómico de Masson, al menos cinco imágenes microscópicas seleccionadas al azar de secciones de tejido de cada ratón fueron fotografiados utilizando software de imagen digital (NIS-Elements, Nikon, Tokio, Japón) y el porcentaje de área de la fibrosis hepática cuantificaron utilizando el software NIH ImageJ (Instituto Nacional de Salud, Bethesda, MD).
ortotópico HCC modelo de xenoinjerto de células
CCl se administraron
4 o diluyente por vía subcutánea dos veces por semana durante 10 semanas como anteriormente, seguido por intrahepática directa inyección de PLC-
luc
células para establecer xenoinjertos de células tumorales ortotópico en ratones inmunodeficientes como sigue. Se realizó laparotomía bajo anestesia con isoflurano y el lóbulo hepático izquierdo se expuso. células PLC-luc (10
6), se suspendieron en 20 ml de medio libre de suero que contiene 50% de Matrigel (BD Bioscience, San José, CA), y lentamente se inyecta en el lóbulo hepático izquierdo usando una aguja de calibre 28 . Después de la retirada de la aguja, la compresión se aplica en el sitio de la inyección con un hisopo de algodón para evitar el sangrado. músculo de la pared abdominal y la piel se cerraron con sutura continua con material de sutura absorbible. Diez días después de la inyección de células tumorales, imágenes de bioluminiscencia utilizando el sistema de imágenes IVIS (Xenogen Corp., Alameda, CA) se inició para supervisar el establecimiento y crecimiento de tumores. Los ratones fueron anestesiados con isoflurano y D-luciferina (Gold Biotechnology, St. Louis, MO) disuelto en PBS se administró por vía intraperitoneal (150 mg /kg de peso corporal del ratón). Después de 10 minutos, los ratones fueron imágenes con una alta sensibilidad, enfriado cámara CCD en una cámara de muestras hermética a la luz (IVIS200, Xenogen). La adquisición y la cuantificación de las señales de bioluminiscencia se realizaron utilizando el software de imagen viva (Xenogen). Para un estudio preliminar, cinco ratones fueron sacrificados después de al menos cuatro semanas de monitoreo. Imágenes de bioluminiscencia se correlacionó con volúmenes tumorales del hígado estimados usando mediciones de la pinza y una fórmula estándar: 1/6 * ancho * largo * profundidad. Para
in vitro
imágenes de bioluminiscencia, se contaron las células y chapado (40-10240 células) en placas de 96 pocillos negro. Se añadió D-luciferina (150 mg /ml) a cada pocillo y se llevó a cabo de imagen después de 10 minutos usando IVIS.
Estudio de Tratamiento en el modelo de xenoinjerto
Un estudio de tratamiento se llevó a cabo en xenoinjertos ortotópico en ratones desnudos con o sin inducción de la fibrosis hepática. Después de la implantación de células intrahepática PLC-luc, bioluminiscencia se controló para monitorear el desarrollo de tumores. Una vez que la intensidad de la bioluminiscencia superó los 10 millones de fotones /seg, los ratones con xenoinjertos ortotópico fueron aleatorizados para recibir silvestrol (0,4 o 1 mg /kg de peso corporal ip) o control (0,5 ml /kg de peso corporal 0,1% DMSO en solución salina) durante 5 días consecutivos a la semana durante cuatro semanas. Una respuesta terapéutica se define como un & gt; 30% de reducción en la intensidad de la bioluminiscencia de la línea de base. Los ratones fueron imágenes por semana durante 10 semanas desde el inicio del tratamiento.
investigación hepatotoxicidad en los ratones de tipo salvaje
de seis semanas de edad, sexo femenino, C57BL /6 ratones fueron tratados con 0 (vehículo control) o 1,5 mg /kg de silvestrol (n = 7 por grupo) cada 48 horas durante 28 días por vía intraperitoneal. En la necropsia, se recogió sangre para medir alanina en suero (ALT) y aminotransferasas (AST) aspartato, mientras que el hígado se fijó por inmersión en neutral tamponada al 10% de formalina. Las lesiones histopatológicas en fijo, embebido en parafina, hematoxilina y eosina (H & amp; E) secciones de tejido teñidas se calificaron por un patólogo veterinario certificado por el consejo mediante una escala de 5 niveles, semi-cuantitativa: dentro de los límites normales, o mínima, leve, cambios moderados, o marcados.
Productos químicos y Reactivos
Silvestrol, {6-o-desmetil-6- [6- (1,2-dihidroxietil) -3-metoxi-1,4 -dioxan-2-il] -aglafolin}, fue aislado de la corteza y las ramitas de Aglaia foveolata Pannell (Meliaceae), como se describe anteriormente por AD Kinghorn. Silvestrol se resuspendió en dimetilsulfóxido (DMSO) y se almacenó a -80 ° C. Sorafenib se obtuvo de LC Laboratories (Woburn, MA) y se diluyó en DMSO. La rapamicina se obtuvo de Calbiochem (San Diego, CA) y se diluyó en DMSO. La concentración de DMSO eran & lt; 0,1% para todos los estudios. Z-VAD-FMK se obtuvo de Promega (Madison, WI)
El análisis estadístico
Los datos se analizaron mediante análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) seguido de un procedimiento post hoc. Para el análisis de supervivencia, las curvas de supervivencia fueron creados por el método de Kaplan-Meier y se compararon mediante una prueba de log-lacio. El análisis multivariado se realizó con regresión de Cox de riesgos proporcionales. La significación estadística fue aceptada en un valor de
p Hotel & lt; 0.05.
Ética declaración
Se realizaron todos los estudios en animales siguiendo procedimientos y directrices Institucional de Cuidado de Animales y el empleo en la Universidad Estatal de Ohio, bajo un protocolo aprobado.
Resultados
silvestrol inhibe el crecimiento celular HCC humano
in vitro
Para examinar el potencial efecto antitumoral de silvestrol, se comenzó por analizar el efecto de silvestrol sobre el crecimiento celular
in vitro
utilizando un panel de diversas líneas celulares de hepatocitos humanos malignos. La incubación con silvestrol resultó en un efecto dependiente de la concentración en la inhibición de crecimiento de las células en todas las líneas de células tumorales examinadas, con una CI50 de 23,9 nM en PLC /PRF /5, 12,5 nM en Hep3B, 14,6 nM en Eh 7 y 86 nM en células HepG2 (Figura 1). Estos datos indicaron que silvestrol tuvo un efecto anti-cáncer muy potente en las células de HCC humanos.
células de HCC humano se sembraron en placas de 96 pocillos (5.000 células /pocillo) y se incubaron con diversas concentraciones de silvestrol o control ( diluente). La viabilidad celular se evaluó después de 72 horas usando un ensayo de células vivas metabólico (CellTiter 96 AQ, Promega Corp., Madison, WI). Los datos representan la media y la desviación estándar de cinco determinaciones separadas.
La inducción de muerte celular por apoptosis en células de HCC por silvestrol
La hipótesis de que la citotoxicidad de silvestrol se produjo como resultado de la inducción de la apoptosis mediada por síntesis alterada de moléculas reguladoras de la apoptosis de corta duración, como MCL-1 [16,17]. Por lo tanto, se analizó la inducción de apoptosis en células de HCC PLC /PRF /5 humanos después de la incubación con 100 nM silvestrol. Caspasa 3/7 activación se detectó mediante un ensayo luminométrico, con un aumento de la actividad que se indica en 30 minutos y una duración de hasta 6 horas (Figura 2A). Del mismo modo, un aumento de la escisión de la polimerasa polyADP-ribosa (PARP), un sustrato para la actividad de caspasa, también se observó junto con la escisión de otras caspasas, como la caspasa 8 y 9 (Figura 2B). Pre-incubación de las células durante 30 minutos con la caspasa inhibidor 50 M zVAD-FMK reduce la citotoxicidad de la posterior incubación con silvestrol 50 nM de 36,4 ± 3,5% a 17,6 ± 2,9% después de 24 horas. En consonancia con estos cambios, 19,3% de PLC /PRF /5 células mostraron características morfológicas de las células que sufren apoptosis después de 24 horas (Figura 2C). Estos estudios indican que las características morfológicas y bioquímicas de la apoptosis se producen temprano durante la incubación de células de HCC con silvetrol
.
PLC /PRF /5 células de HCC se sembraron en 4 pocillos de diapositivas cámara (25.000 células /pocillo) y se incubaron con 100 nM silvestrol durante 24 horas. Las células apoptóticas se detectaron mediante microscopía de fluorescencia después de la tinción DAPI. La proporción de células que muestran características morfológicas de apoptosis se contaron. *,
p Hotel & lt; 0,05, prueba t.
Silvestrol altera la expresión de MCL-1