Extracto
Pramanicin (PMC) es un agente antifúngico que fue demostrado previamente para exhibir propiedades antiangiogénicas y anticancerígenas en unos pocos
in vitro
estudios. Nosotros inicialmente seleccionados una serie de análogos de PMC por sus efectos citotóxicos sobre las células de cáncer de colon humano HCT116. PMC-A, el análogo con el efecto antiproliferativo más potente fue elegido para interrogar aún más el mecanismo subyacente de acción. PMC-A condujo a la apoptosis a través de la activación de la caspasa-9 y -3. La naturaleza apoptótica de la muerte celular se confirmó mediante la abrogación de la muerte celular con el tratamiento previo con inhibidores de caspasa específicos. Relacionada con el Estrés MAPK JNK y p38 fueron activadas concomitantemente con la vía intrínseca de apoptosis. Por otra parte, la inhibición farmacológica de p38 demostró atenuar la inducción de muerte celular, mientras que el pretratamiento con el inhibidor de JNK no mostró un efecto protector. Resistencia de Bax - /- las células y la naturaleza protectora de la inhibición de la caspasa-9 indican que las mitocondrias desempeñan un papel central en la PMC-A apoptosis inducida. Early elevación posterior a la exposición de Bim celular y Bax fue seguido por un marginal Bcl-2 agotamiento y la escisión de la subasta. Análisis posteriores revelaron que Bcl-2 regulación a la baja se produce en el nivel de mRNA y es crítico para mediar en la apoptosis inducida PMC-A, como ectópico Bcl-2 expresión salvó sustancialmente las células de la muerte. Por el contrario, la expresión forzada de Bim demostró aumentar significativamente la muerte celular. Además, los análisis de p53 - /- células demostrado que Bcl-2 /Bim /Bax modulación y MAPK activaciones se llevan a cabo de forma independiente de la expresión de p53. Tomados en conjunto, independiente de p53 transcripcional Bcl-2 regulación a la baja y la señalización de p38 parecen ser los eventos moduladores clave en PMC-A apoptosis inducida
Visto:. Bodur C, Kutuk O, Karsli-Uzunbas G, Isimjan TT, Harrison P, Basaga H (2013) Pramanicin analógico induce la apoptosis en células de cáncer de colon humano: papel crítico para Bcl-2, Bim, y p38 MAPK señalización. PLoS ONE 8 (2): e56369. doi: 10.1371 /journal.pone.0056369
Editor: José Viña, Universidad de Valencia, España |
Recibido: 22 Octubre, 2012; Aceptó 8 de enero de 2013; Publicado: 18 Febrero 2013
Derechos de Autor © 2013 Bodur et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. La financiación para la obra corrió a cargo de los fondos de investigación de la facultad de la Universidad Sabanci. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Una multitud de moléculas de origen natural o sintetizadas ha sido analizada para su uso terapéutico en medicina humana o veterinaria. larga de haber sido explotada como desinfectantes y conservantes en la industria, agentes antifúngicos no han sido excepciones a esto. Pramanicin (PMC) es un producto de fermentación de hongos que pertenece a una clase de agentes antifúngicos definidos por una cabeza polar altamente functionilized y una cadena lateral alifática. El anterior
in vitro
análisis sobre endoteliales cultivadas y las células T leucémicas confirmó su potencial terapéutico, tanto como agente antiangiogénico y contra el cáncer [1], [2].
La exposición prolongada a
in vitro
dosis eficaces de PMC se había demostrado que disminuir la viabilidad celular y desencadenar la apoptosis dependiente de caspasa [2]. la muerte celular inducida por PMC se demostró estar mediada por la activación de ambas quinasas p38 activada por mitógenos proteína quinasa relacionada con el estrés (MAPK) y c-Jun N-terminal quinasa (JNK), mientras que se informó de la actividad extracelular quinasa regulada (ERK) a significativamente disminuir después de la exposición al agente. Aunque un aumento del calcio intracelular transitorio se informó a seguir la exposición PMC en las células endoteliales pulmonares cultivadas, este fenómeno no se sincroniza con ya sea la disfunción endotelial o muerte celular [1].
tensiones ambientales, incluyendo radiación físico o químico, estrés osmótico y el estrés oxidativo o la superficie celular ligandos del receptor tales como factores de crecimiento, citoquinas inflamatorias o ligandos de receptores de muerte pueden activar una cascada de quinasa que finalmente estimula activada por estrés p38 MAPK y JNK. serina Upstream /treonina quinasas quinasas MAP quinasa quinasa (MEKK) y quinasas MAP quinasa (MKKS) son responsables de la activación por fosforilación y la posterior translocación nuclear de JNK y p38 [3]. Una vez activado, JNK y p38 son conocidos por ser capaz de modulación de apoptosis a través de la activación /desactivación de una serie de factores de transcripción.
La apoptosis es un mecanismo de la muerte celular estrechamente regulado que se activa en respuesta a diversos estímulos intra /extracelular tales como el estrés oxidativo y la radiación electromagnética que dañan macromoléculas celulares o señales incluyendo citoquinas inflamatorias y factores de crecimiento. ejecución apoptótica es asumido por una familia de cisteína proteasas llamadas caspasas que se activan de una manera bien definida [4]. Mientras que la vía intrínseca se activa por la liberación molécula apoptogenic de las mitocondrias, la vía extrínseca se activa a través de la unión del ligando a los receptores de muerte en la superficie celular. Si la vía intrínseca o extrínseca de apoptosis estarán en acción generalmente se determina por la naturaleza del estímulo. Independiente de la vía que se activa inicialmente, tanto en las vías intrínseca y extrínseca, podrían estar involucrados para amplificar la señal apoptótica en diferentes circunstancias.
liberación del citocromo c de la mitocondria que marca el punto de no retorno para la actividad apoptótica intrínseca es intrincadamente regulada por interacciones entre Bcl-2 de proteínas. El delicado equilibrio entre los miembros pro-apoptóticos y anti de la familia determina la carga dentro de la célula apoptótica. Multidominio proapoptótico Bcl-2 de proteínas Bax y Bak tienen la capacidad de homo- /heterooligomerization en la membrana mitocondrial externa (OMM), que causa la permeabilización de la OMM y la liberación de moléculas apoptogenic incluyendo citocromo c en el citosol. Mientras que el antiapoptóticas Bcl-2 de proteínas tales como Bcl-2, Bcl-xL, A1 y MCL-1 a mantener proapoptótico Bax /Bak ellos secuestrado prevención de iniciar la permeabilización OMM, proapoptótico BH3 (Bcl-2 homología 3) las proteínas -sólo incluyendo Bim, oferta, Noxa, Bad y Puma podrían trabajar para neutralizar los miembros antiapoptóticos de la familia [5], [6]. Aunque los mecanismos exactos que modulan proteínas Bcl-2 todavía permanecen oscuras en gran medida, es conocido el equilibrio entre las cantidades relativas celulares y actividades de pro- y antiapoptóticas Bcl-2 de proteínas para ser controlado estrictamente en los niveles de genes y proteínas en células de mamíferos sanos . En este sentido, los niveles celulares de proapoptótico BH3-sólo proteínas Bcl-2 en relación con sus homólogos antiapoptóticas es crítica para establecer Bax /Bak libres para iniciar la vía apoptótica intrínseca
.
Además de sus funciones en la reparación del ADN y regulación del ciclo celular, la conocida p53 supresor de tumores se ha demostrado que es capaz de regular directamente la apoptosis. Hasta el momento, esta regulación se ha demostrado que se producen a través de la modulación de proteínas de la familia Bcl-2 o de los receptores de la muerte expresiones. Además de la regulación positiva de transcriptionally Bax, Bid, Puma, Noxa, Bak y receptores de muerte transmembrana como un factor de transcripción, también se informó de p53 para ser capaz de activar directamente Bax a nivel de proteínas [7] - [13]. La evidencia reciente indica también que p53 en sí también puede comportarse como un sólo BH3 proteína proapoptótico para antagonizar antiapoptóticas Bcl-2 de proteínas, además de provocar la transrepresión de antiapoptótico Bcl-2 la transcripción de genes [14] - [17].
en este estudio, se define un mecanismo para la activación de la vía apoptótica intrínseca provocada por PMC-a, un análogo de PMC potente en el que el grupo epoxi en la cadena lateral de PMC se sustituye por un alqueno (Fig. 1). PMC-A mediada apoptosis a través de la activación independiente de p53 de p38 y Bcl-2 en la regulación por disminución HCT-116 células de cáncer de colon humano. Al mismo tiempo, Bax y Bim se acumulan tanto en las células expuestas a PMC-A, con la consiguiente truncamiento de la subasta.
Materiales y Métodos
Cultivo celular y tratamientos
Wild- tipo (en peso), p53 - /- y Bax - /- las células de cáncer de colon humano HCT116 fueron amablemente proporcionados por Bert Vogelstein (Howard Hughes Medical Institute, de la Universidad Johns Hopkins, EE.UU.) [18], [19], se cultivaron en McCoy 5A suplementado con 10% FBS HI y 100 IU /ml de penicilina /estreptomicina. Los cultivos se mantuvieron a 37 ° C en un humidificado 5% de CO
2 atmósfera. Etanol (max 0,5%, v /v) se añadió a todos los pocillos de control /placas en cada experimento. Las células se recogieron, cuantificado en medio completo y se sembraron (100000 células /ml) en 12 pocillos, 6 pocillos o mm de cultivo de 60 placas dependiendo del experimento. Pramanicin y análogos se añadieron en las placas de cultivo de 36 horas más tarde. Pre-tratamientos con inhibidores se realizaron durante 30 minutos antes de la PMC-Un tratamiento.
Reactivos y analógica Síntesis
General.
Los espectros de RMN de protón se registraron en CDCl
3 o CD
3OD en un espectrómetro Bruker AC-200 o espectrómetro AC-600 y se presentan como sigue: desplazamiento químico δ (ppm); número de protones, la multiplicidad, constante de acoplamiento J (Hz) y asignación. disolventes próticos residuales CHCl
3 (δ = 7,26 ppm) y CH
3OH (δ = 3,30) fueron utilizados como referencia interna.
13C espectros de RMN se registraron en CDCl
3 o CD
3OD a 50 MHz en un Bruker AC-200 y 150 MHz en un espectrómetro Bruker AC-600, utilizando la resonancia central de CDCl
3 (δ = 77,16 ppm) como referencia interna. Los espectros de infrarrojos se registraron en una máquina Perkin-Elmer 983G. Los espectros de masas se obtuvieron en un Micromass Quattro Ultima (LC-ESI /APCI triple cuadrupolo espectrómetro de masas) en el Departamento de Química, Universidad de McMaster. Se utilizaron las siguientes técnicas de ionización: ionización de electrones (EI), y electrospray (ES). Los puntos de fusión se determinaron en un aparato de fase caliente Reichert. Las rotaciones ópticas se registraron en un Perkin-Elmer (241 MC polarímetro, λ = 589, Na lámpara).
Pramanicin (PMC) y pramanicin A (PMC-A) se prepararon como se describe anteriormente [20]. cromatografía en columna ultrarrápida se realizó sobre gel de sílice (gel de sílice 60). Cromatografía en capa fina (TLC) se realizó sobre placas de sílice pre-recubierta (ALUGRAM SIL G /UV
254) y se visualizaron por UV, la vainillina o solución de nitrato de amonio cérico. Las soluciones acuosas se saturaron a menos que se especifique lo contrario. La proporción de disolventes en las mezclas se refiere a los volúmenes utilizados. Todas las reacciones se llevaron a cabo bajo una atmósfera de nitrógeno o argón en material de vidrio secado al horno, que se enfrió bajo una corriente continua de nitrógeno inmediatamente antes de su uso a menos que se indique lo contrario. THF se destiló a partir de cetil benzofenona de sodio, CH
2Cl
2 y tolueno a partir de hidruro de calcio, y EtOAc a partir de carbonato de potasio. Otros disolventes y reactivos se utilizaron tal como se suministra.
3-tetradecanoil-1-vinilpirrolidina-2-ona (2).
recién destilada
N
-vinylpyrrolidin-2- uno (1) (0,96 ml, 9 mmol) se añadió a NaH (1,44 g, 36 mmol) en THF a reflujo (15 ml). La mezcla se agitó durante 30 min a 90 ° C, y después acetato de miristato (4,3 ml, 10,3 mmol) se añadió. Después de 3 h, la solución se calentó a temperatura ambiente, se inactivó con solución acuosa saturada de NH
4Cl, y se extrajo con éter. Los extractos se secaron (Na
2SO
4), se filtró y se concentró. El sólido resultante se disolvió en CH
2Cl
2, se filtró y se concentró y se purificó por cromatografía (CH
2Cl
2 /EtOAc, 01:01) para dar 2 como cristales blancos (3,54 g , 82%): pf 39-40 ° C; IR (película) 2920, 2851 (C-H, str.), 1685, 1637 (C = O, str.), 1459 (C = C, curva.), 1391, 861 cm
-1;
1 H RMN (CDCl
3, 200 MHz) δ 7,01 (1H, dd,
3J = 9,0,
3J = 16,0, NCH = CH
2), 4,46 (2H, m , NCH = CH
2), 3,68 (1H, dd,
3J = 9,0,
3J = 6.0, COCHCO), 3,54 (1H, ddd,
2J = 9,0,
3J = 8,5,
3J = 5,5, CH
2 N), 3,47 (1H, ddd,
2J = 9,0,
3J = 8,5,
3J = 5,7, CH
2 N) , 3,01 (1H, m, CH
2 CA
2CO), 2,68 (1H, m, CH
2 CA
2CO), 2,67 (1H, dddd,
2J = 13,8,
3J = 5,7,
3J = 8,5,
3J = 6.0, CH
2 CA
2 N), 2,12 (1H, dddd,
2J = 13,6,
3J = 8,5,
3J = 9,0,
3J = 5,5, CH
2 CA
2 N), 1,57 (2H, m, CH
2 CA
2CO), 1,24 (20H, m, C
10 H
20), 0,87 (3H, t,
2J = 6,7, CH
3CH
2);
13C RMN (CDCl
3, 50 MHz); δ 204,2 (CH
2CO), 169,9 (CON), 130,0 (NCH = CH
2), 94,5 (NCH = CH
2), 57,3 (COCHCO), 44,0 (CH
2 N) , 43,5 (CH
2 CA
2CO), 32.7, 30.4, 30.2, 29.8, 24.1, 23.5 (C
10 H
20), 20,1 (CH
2 CA
2 CA
2), 14,9 (CH
3); MS (EI
+) m /z = 321 (M
⋅ +), HRMS (EI) calculado para C
20H
35NO
2 (H
⋅ +) 321.2668 , encontrado 321,2679.
3-Tetradecanoylpyrrolidin-2-ona (3).
Compuesto 2 (520 mg, 1,6 mmol) se calentó a 90 ° C en una mezcla de 95% C
2H
5OH (35 ml) y HCl concentrado (0,5 ml). La reacción se controló por TLC. La solución se enfrió a temperatura ambiente, se secó (Na
2SO
4), se filtró, y se concentró. se purificó el sólido resultante mediante cromatografía (CH
2Cl
2 /EtOAc, 01:01) para dar 3 como cristales blancos (241 mg, 50,4%): pf 73-74 ° C; IR (película) 3226 (N-H str.), 2920, 2851 (C-H, str.), 1716, 1671 (C = O, str.), 1468, 1375, 1278 cm
-1;
1 H RMN (CDCl
3, 600 MHz) δ 5,73 (1H, s ancho, NH), 3,50 (1H, dd,
3J = 9,0,
3J = 6.0 COCHCO), 3,44 (1H , ddd,
2J = 9,0,
3J = 8,5,
3J = 5,5, CH
2 N), 3,34 (1H, ddd,
2J = 9,0,
3J = 9,0 ,
3J = 5,4, CH
2 N), 2,95 (1H, ddd,
2J = 17,4,
3J = 7,4,
3J = 7.5 CH
2 CA
2CO ), 2,57 (1H, ddd,
2J = 17,4,
3J = 7,2,
3J = 7.2 CH
2 CA
2CO), 2,65 (1H, dddd,
2J = 11.0,
3J = 5,4,
3J = 9,0,
3J = 9,0, CH
2 CA
2 N), 2,17 (1H, dddd,
2J = 11.0,
3J = 8,5,
3J = 9,0,
3J = 5,5, CH
2 CA
2 N), 1,59 (2H, m, CH
2 CA
2CO), 1,23 (22H, m, C
11H
22), 0,88 (3H, t,
3J = 6,8, CH
3CH
2);
13C RMN (CDCl
3, 150 MHz) δ 205,9 (CH
2CO), 171,6 (CONH), 53,9 (COCHCO), 42,9 (CH
2CO), 40,6 (CH
2N), 32,1 (CH
3CH
2 CA
2), 29.8~29.2, 23,5 (CH
2 CA
2 CA
2CO), 22,9 (CH
2 CA
2CH
2NH), 14,9 (CH
3); MS (EI
+) m /z = 295 (M
⋅ +), HRMS (EI) calculado para C
18H
33NO
2 (H
⋅ +) 295.2511 , encontrado 295,2554.
(2R, 5S) -2- (p-fluorofenil) -3-oxa-1-azabiciclo [3.3.0] octan-8-ona (4).
una solución de 5-hidroximetilpirrolidina-2-ona (580 mg, 5 mmol) y
p
-fluorobenzaldehyde (810 mg, 6,5 mmol) en tolueno (20 ml) que contienen PPTS (30 mg) se calentó a de reflujo durante 13 h utilizando un separador de agua Dean-Stark. Después de enfriar, la solución se diluyó con EtOAc, se lavó con NaHCO saturado
3 solución acuosa, después con salmuera, se secó (MgSO
4), y se evaporó bajo presión reducida para dar un aceite marrón. La separación cromatográfica en gel de sílice por elución con CHCl
3 dio 4 como un aceite amarillo pálido (586 mg, 53%): IR (película) 2920, 2851 (CH, str.), 1701 (C = O, str. ), 1559, 1507, 1437 (C = C aromático curva) 1301, 1099, 821, 668 cm
-1.;
1 H RMN (CDCl
3, 200 MHz) δ 7,34 (2H, dd,
3J = 8,0,
4J = 5,5, H-Ph), 6,95 (2H, dd,
3J = 8,6,
4J
HF = 8,6, H-Ph), 6,20 (1H, s, OCHPh), 4,15 (1H, dd,
2J = 7,4,
3J = 6,4, CH
2O), 4,04 (1H, m, NCHCH
2O), 3,40 (1H, t,
2J = 7,4,
3J = 7,6, CH
2O), 2,74 (1H,
2J = 17.4
3J = 9,6,
3J = 9,4, CH
2CO), 2,47 (1H, ddd,
2J = 17,4,
3J = 3,7,
3J = 9.8, CH
2CO), 2,31 (1H, dddd,
2J = 20.2,
3J = 3,7,
3J = 7,6,
3J = 7.0, CH
2 canales
2CHN), 1,87 (1H, dddd,
2J = 20.2,
3J = 4,7,
3J = 9,4,
3J = 9.8, CH
2 CA
2CHN) ;
13C RMN (CDCl
3, 50 MHz) δ 178,2 (CON), 163,5 (1C, d,
1J
CF = 244,4, CF), 129,5 (2C, D,
3J
CF = 8,2, CHCHCF), 115,4 (2C, D,
2J
CF = 21,5, CHCF), 86,7 (OCHPh), 71,8 (CH
2O), 58,9 (NCH), 33,6 (COCH
2), 23,1 (COCH
2 CA
2).
(2R, 5S) -2- (p-fluorofenil) -7-tetradecanoil-3-oxa- 1-azabiciclo [3.3.0] octan-8-ona (5).
a una solución de la lactama protegida 4 (222 mg, 1 mmol) y HMPA (5 ml) en THF (15 ml), LiN (TMS)
2 se añadió (1,0 M, 1,3 ml, 1,3 mmol) en THF a -78 ° C. La mezcla de reacción se agitó durante 30 min, y después acetato de miristato (0,4 ml, 1,2 mmol) se añadió. La solución se calentó lentamente a temperatura ambiente. Después de 3 h, la mezcla de reacción se inactivó con solución saturada de NH
solución acuosa 4Cl, se extrajo con éter, y el extracto se secó (Na
2SO
4) y se concentró. El producto resultante se purificó por cromatografía (hexanos /EtOAc, 02:01) para dar 5 en forma de cristales blancos (233 mg, 53%) que se forman como una mezcla de dos diastereómeros: pf 60-62 ° C; IR (película) 2918, 2851 (CH, str.), 1716, 1681 (C = O, str.), 1559, 1512 (aromático C = C curva.), 1401, 1240, 1035, 802 cm
- 1; MS (EI
+) m /z = 431 (M
⋅ +), HRMS (EI) calculado para C
26H
38NFO
3 (H
⋅ +) 43.2913 , encontrado 431,2914.
(5R) -5- (hidroximetil) -3-tetradecanoylpyrrolidin-2-ona (6).
una solución de la lactama protegida 5 (50 mg, 0,15 mmol) en 5 ml de AcOH /THF /h
2O (03:07: 1) se calentó a 90 ° C durante 3 h. Se añadió benceno (30 ml) a la mezcla y se evaporó bajo presión reducida. La cromatografía ultrarrápida se realizó (EtOAc /CH
3OH, 10:01) para proporcionar 6 en forma de cristales blancos (22 mg, 60%) de una mezcla de diastereómeros: pf 73-76 ° C; IR (película) 3385 (NH str.), 3307 (OH, str.), 2920 (C-H, str.), 1699, 1653 (C = O, str.), 1457, 1119 cm
-1; MS (EI
+) m /z = 325 (M
⋅ +), HRMS (EI) calculado para C
19H
35NO
3 (H
⋅ +) 325.2617 , encontrado 325,2599.
(2S, 5S, 7R) -7-hidroxi- (4-fluorofenil) -3-oxa-1-azabiciclo [3.3.0] octan-8-ona (7).
el compuesto 6 (200 mg, 0,46 mmol) se añadió a una suspensión de CeCl
3.7H
2O (5,6 mg, 0,015 mmol) en 2 ml
i
PrOH. La suspensión se mezcló mediante burbujeo de aire a través de él durante 2 h a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se concentró. Se llevó a cabo cromatografía de resolución rápida (CH
2Cl
2 /EtOAc, 01:01) para dar 7 como un aceite incoloro (120 mg, 57%): (. OH, str) IR (película) 3384, 1715, 1698 (C = O, str.), 1511, 1230, 1156 cm
-1; [Α]
D
23 = -0.05
0 (c = 0,8 g /100 ml, CH
3OH);
1 H RMN (DMSO-d
6, 600 MHz) δ 7,41 (2H, dd,
3J = 8,9,
4J = 5,5, H-Ph), 7,23 (2H, dd,
3J = 8,9,
4J
HF = 8,9, H-Ph), 6,62 (1H, s, OH), 6,11 (1H, s, H-Ph), 4,28 (1H, dd,
2J = 8,1,
3J = 8,4, CH
2O), 4,01 (1H, dddd,
3J = 6,8,
3J = 7,0,
3J = 8,4,
3J = 6,0, NCHCH
2), 3,51 (1H, t,
2J = 8,4,
3J = 8,1, CH
2O), 2,75 (1H, dd,
2J = 13.0,
3J = 6,8, CH
2CHN), 2,69 (2H, dd,
2J = 18.5,
3J = 7,2, CH
2 CA
2CO), 1,90 (1H, dd ,
2J = 13,0,
3J = 7.0, CH
2CHN);
13C RMN (DMSO-d
6, 150 MHz) δ 209,3 (CH
2CO), 172,3 (CON), 162,2 (
1J
CF = 244,4, C-Ph), 134.7 (C-Ph), 128,3 (2C,
3J
CF = 8,4, C-Ph), 115,2 (2C,
2J
CF = 21,7, C-Ph), 87,7 (C -OH), 85,6 (CH-Ph), 72,2 (CH
2O), 54,6 (CH
2CHN), 37,2 (CH
2CHN), 36,2 (CH
2 CA
2CO) , 22,6 (CH
2 CA
2CO), 22.05~31.25, 13,9 (CH
3CH
2); MS (EI
+) m /z = 447 (M
⋅ +), HRMS (EI) calculado para C
26H
42FN
2O
4 [(M
⋅ + NH
4)
+] 465,3129 465,3126 encontrado.
(3S, 5R) -3-hidroxi-5- (hidroximetil) -3-tetradecanoil pirrolidin-2-ona (8 )
Una solución del compuesto 7 (60 mg, 0,13 mmol) en 5 ml de AcOH /THF /h
2O (03:07:. 1) se calentó a 90 ° C durante 3 h. C
6H
6 (30 ml) se añadió a la mezcla y se evaporó bajo presión reducida. La cromatografía ultrarrápida se realizó (EtOAc /CH
3OH, 10:01) para dar 8 como cristales blancos (22 mg, 48%): pf 74-76 ° C; IR (película) 3300 (NH, str.), 3226 (OH, str.), 2995, 2849 (C-H, str.), 1688, 1650 cm
-1 (C = O, str.); [Α]
D
23 = -4.25 ° (c = 0,04 g /100 ml, CH
3OH); 1H NMR (CD
3OD, 600 MHz) delta 3,81 (1H, dddd,
3J = 4,9,
3J = 5,4,
3J = 6,3,
3J = 7,9, CH
2CHN), 3,62 (1H, dd,
2J = 11.1,
3J = 4,9, CH
2O), 3,53 (1H, dd,
2J = 11.1,
3J = 6.3 , CH
2O), 2,74 (2H, m, CH
2 CA
2CO), 2,38 (1H, dd,
2J = 14.1,
3J = 5,4, CH
2CHN ), 2,10 (1H, dd,
2J = 14.1,
3J = 7,9, CH
2CHN), 1,56 (2H, m, CH
2 CA
2CO), 1,31 (3H, t,
3J = 7.0, CH
3CH
2);
13C RMN (CD
3OD, 150 MHz) δ 212,2 (CO), 176,7 (CON), 84,5 (COH), 65,5 (CH
2OH), 54,3 (CHN), 38,7 (CH
2CO), 33.1~30.8, 24,3 (CH
2 CA
2CO), 14,4 (CH
3CH
2); MS (EI
+) m /z = 341 (M
⋅ +), HRMS (EI) calculado para C
19H
35NO
4 (M
⋅ +) 341.2617 encontrado 341,2599.
PMC y análogos se disolvieron en etanol. 5A de McCoy, FBS y antibióticos eran de Pan Biotech GmbH (Aidenbach, Alemania). cóctel inhibidor de fosfatasa (PhosStop) y cóctel inhibidor de la proteasa se obtuvieron de Roche (F. Hoffman-La Roche Ltd., Basilea, Suiza). Anexina V (FITC) era de Alexis Bioquímicos (Enzo Life Sciences, Inc. Farmingdale, EE.UU.). caspasa-3 troceados, exfoliados caspasa-9, JNK, P-JNK, p38, p38-P, Bcl-2, anticuerpos Bax, Bid, Bim y β-actina fueron adquiridos de Señalización Cell Technology Inc. (Beverly, MA, EE.UU. ). MAPK inhibidores SP600125 y SB203580 eran de Calbiochem (La Jolla, CA, EE.UU.). Los inhibidores de caspasa Z-VAD-FMK (inhibidor general de caspasa), Z-DEVD-FMK (caspasa-3 inhibidor), Z-LEHD-FMK (caspasa-9 inhibidor), y Z-IETD-FMK (caspasa-8 inhibidor) eran adquirido de BD Biosciences (San Jose, CA, EE.UU.). Tris, glicina y Tween-20 eran de Molekula Ltd (Shaftesbury, Reino Unido). Todos los otros productos químicos se obtuvieron de Sigma (Darmstadt, Alemania).
MTT viabilidad celular Asssay
La viabilidad celular tras la exposición a análogos de PMC se determinó utilizando un MTT (dimetil tiazolilo tetrazolio difenil) kit de ensayo ( Roche, Mannheim, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, las células WT HCT116 en placas de 96 pocillos se trataron como se indica, y se añadieron 10 l de reactivo de marcado MTT a cada pocillo, después de lo cual las placas se incubaron durante 4 horas. Las células se incubaron a continuación en 100 l de la solución de solubilización durante 12 horas, y se midió la absorbancia con un lector de placas de microtitulación (Bio-Rad, CA, EE.UU.) a una longitud de onda de ensayo de 550 nm y una longitud de onda de referencia de 650 nm. viabilidad porcentual se calcula como (DO de OD muestra /control tratado con fármaco) x 100.
Citometría de Flujo
La muerte celular se determinó mediante un ensayo de afinidad de Anexina-V. Wt, p53 - Se transfectaron células HCT116 sembradas en placas de 12 pocillos /tratamiento indicado, se transfirieron a tubos de citometría de flujo y las células se recogieron por centrifugación a 300 g durante 5 minutos - /-, y Bax - /. A continuación, las células se resuspendieron en 1 ml de PBS frío y se centrifugaron de nuevo a 300 g durante 5 minutos. Tras la eliminación del sobrenadante, las células se incubaron en tampón de Anexina V (HEPES 140 mM, NaCl 10 mM, CaCl 2,5 mM
2, pH: 7,4) que contiene 1% (v /v) de Anexina V (FITC) para 15 minutos en la oscuridad. Las células se analizaron por FACS (FACSCanto, Becton Dickinson).
Extracción de proteínas e inmunotransferencia
Las células se trataron como se indica y se recogieron por centrifugación a 300 g durante 30 segundos. Después de la resuspensión en 1 ml de PBS enfriado en hielo y la transferencia a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, las células se centrifugaron a 13.200 rpm durante 30 segundos. El sedimento se lisaron mediante incubación durante 30 minutos en 200 l de tampón de lisis celular frío que contiene 50 mM Tris-HCl (pH: 8,0), NaCl 150 mM, fluoruro de fenilmetanosulfonilo, proteasa e inhibidor de la fosfatasa cócteles 1 mM, y Nonidet P-40 1 % (v /v). Después de centrifugación a 13.200 rpm durante 10 minutos, se eliminó el sobrenadante que contiene el extracto de proteína total y se almacenó a -80 ° C. Las concentraciones de proteína se determinaron por ensayo de proteínas DC (Bio-Rad, Munich, Alemania). Las proteínas (30 mg) se mezclaron con tampón de carga (4% de SDS, 20% de glicerol, 10% de 2-mercaptoetanol, 0,004% de azul de bromofenol, 0,125 M Tris-HCl pH: 6,8) y se separaron en un 10-15% de SDS- PAGE y se transfirieron a membranas de PVDF. Las membranas se bloquearon con 5% de reactivo de bloqueo (ECL Advance, Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemania) en PBS-Tween 20 y se incubaron con apropiadas anticuerpos primarios y secundarios conjugados con HRP (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemania) en reactivo de bloqueo 5% . Después de lavados necesarios con PBS-Tween 20, las proteínas se analizaron finalmente utilizando un sistema de detección de quimioluminiscencia (ECL Advance, Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemania) y se expusieron a Hyperfilm-ECL (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemania).
Las transfecciones
HCT116 células wt fueron transfectadas con plásmidos de expresión Bim Bcl-2 y (Addgene Inc., Cambridge, MA, EE.UU.) utilizando Fugene 6 reactivo de transfección (Roche, F. Hoffman-La Roche Ltd., Basilea, Suiza) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La extracción total de la proteína se realizó después de 24 horas tras la finalización del procedimiento de transfección para la confirmación de la expresión ectópica. células plásmido transfectadas se trataron con PMC-A como se indica y se analizaron por citometría de flujo después de 24 horas.
Análisis estadístico
Todos los resultados ilustrados representan uno de al menos tres experimentos independientes con resultados similares . Todos los datos numéricos se presentan como media ± desviación estándar como. La significación estadística de las diferencias entre las poblaciones de células que responden diferencialmente tratada o diferencialmente transfectadas fueron evaluados con la prueba t de Student para datos independientes o por pares respectivamente. Los valores de p & lt; 0,05 y P & lt; 0,01 se marcan como * o **, respectivamente
Resultados
PMC-A resulta ser más citotóxica En comparación con su precursor PMC y varios análogos contra las células HCT116
PMC se había demostrado que dañar selectivamente a las células endoteliales vasculares en
in vitro
estudios funcionales en aorta de rata en arterias y perros [1], [21], [22]. PMC y análogos también se demostraron para causar la muerte celular en endoteliales vasculares bovino cultivadas y células de leucemia Jurkat T [1], [2]. En nuestro estudio, se investigó inicialmente los productos naturales se informó anteriormente PMC y PMC-A [20] y, a continuación, sintetizado varios análogos para explorar las relaciones estructura-función (Fig. 1). Por lo tanto, PMC-C se preparó a partir comercial
N
-vinylpyrrolidinone (1) por formación del enolato, a continuación, acilación con miristato de etilo para dar 2. El grupo protector de vinilo se retiró a continuación con un ácido acuoso, dando PMC- C (3) como una mezcla racémica en el estereocentro fácilmente epimerizadas (Fig. 2).
Para los análogos de PMC-D y -F, comerciales (
R
) -5- hidroximetilpirrolidina-2-ona se convierte en el derivado protegido 4, usando un procedimiento de la literatura [23], a continuación, desprotonado y acila con miristato de etilo, dando 5. la desprotección luego proporcionó PMC-D (6). Como alternativa, la hidroxilación de 5 con el oxígeno y cloruro de cerio como catalizador de acuerdo con el método de Christoffers [24] dio 7 que después se desprotege para producir PMC-F (8). El uso de la
p
-fluorofenil grupo convenientemente traducido en la hidroxilación esencialmente completamente estereoselectiva, protegiendo mientras que otros sustituyentes en el anillo de benceno dieron mezclas. La estereoquímica de 8 se estableció por cristalografía de rayos X, lo que reveló que el grupo hidroxi fue
trans
al sustituyente hidroximetilo, a diferencia de la
cis
relación en pramanicin. Es por tanto de interés fue establecer si este grupo hidroxi y su estereoquímica son importantes para la actividad, y por lo tanto que incluye este compuesto en el panel de ensayo.
A continuación, realizó un ensayo de citotoxicidad 24 horas para buscar la más potente analógico contra las células HCT116. MTT prueba de reducción que determina indirectamente la viabilidad celular /proliferación mediante el control de la actividad metabólica, reveló que 100 M PMC provocó disminución de aproximadamente 8% en la viabilidad celular (Fig. 3). Sin embargo, PMC-A que posee un doble enlace C = C en lugar de un grupo epoxi en su cadena lateral, disminución de la viabilidad celular en casi un 70% en comparación con el control no tratado. En particular, los análogos de PMC-C, -E y -F todo retenido una actividad significativa, lo que indica que una pirrolidinona acilado (como en PMC-C), a lo más, es el farmacóforo clave y que muchos de los sustituyentes (epóxido, dieno, C- 5 grupo hidroximetilo, y los grupos alcohol C-3 y C-4) no son esenciales, sino que aumentan la actividad.
las viabilidades de células HCT116 se analizaron mediante el ensayo MTT después de 24 h de tratamiento con 100 M de cada análogo PMC . Las células de tipo salvaje HCT116 se analizaron colorimétricamente después de 24 h de tratamiento con análogos de la PMC. Los valores promedio de absorción en relación con el control sin tratar se muestran después de la multiplicación con 100. Los resultados de al menos 3 experimentos independientes se muestran como medias ± SD. Diferencia de los valores medios entre las muestras tratadas y no tratadas se analizaron usando la prueba t de Student para datos independientes; ** P & lt; 0,01. Las células de control se trataron sólo con disolvente. Todos los análogos ensayados, excepto el precursor PMC llevaron a una pérdida significativa de la viabilidad /proliferación mientras PMC-A y -F probó ser más citotóxica para las células.
PMC-A induce la muerte celular a través de la inducción de la ruta apoptótica intrínseca
In vitro
dosis eficaces de la potente PMC analógica PMC-a (25-100 M) causó la muerte celular de una manera dependiente de la dosis entre todas las líneas celulares de cáncer de colon HCT116 tres (en peso, p53 - /-, y Bax - /-) como se indica por el aumento de las afinidades de Anexina-V en las poblaciones de células (Fig. 4A). Para analizar la muerte celular y determinar la dosis óptima para utilizar en una escala de tiempo 24 horas, se aplicó citometría de flujo después de Anexina-V tinción de las células expuestas a cuatro concentraciones fisiológicamente relevantes PMC-A. inducción de muerte celular era evidente para todas las dosis en todas las líneas celulares y el aumento dependiente de la dosis. Habida cuenta de que, más del 50% de las células wt estaban muertos después de la exposición 24 horas a 100 mu M PMC-A, se realizó el resto de los experimentos de inmunotransferencia usando dosis de 50 micras, con los cuales aproximadamente el 70% de las células permaneció vivo a las 24 horas post