Extracto
El cáncer de próstata es el segundo cáncer más comúnmente diagnosticado en los hombres en todo el mundo. Poco se sabe sobre el papel de los cilios primarios en cáncer de próstata pre-invasiva e invasiva. Sin embargo, la expresión de los cilios reducido se ha observado en los cánceres humanos incluyendo el cáncer de páncreas, carcinoma de células renales, cáncer de mama, colangiocarcinoma, y melanoma. El objetivo de este estudio fue caracterizar la expresión de los cilios primarios en el cáncer de próstata humana pre-invasiva e invasiva, y para investigar la correlación entre los cilios primarios y la vía de señalización de Wnt. tejidos de la próstata humano representante de las etapas de la formación de cáncer de próstata (próstata normal, neoplasia intraepitelial prostática (PIN), y cáncer de próstata invasivo (incluyendo invasión perineural)) se tiñeron para las proteínas ciliares. Se determinó la frecuencia de los cilios primarios. Se observó una disminución en el porcentaje de células ciliadas en PIN, cáncer invasivo y lesiones invasión perineural en comparación a la normalidad. longitudes Cilia se midieron también para probar indirectamente funcionalidad. Los cilios eran más corto en PIN, el cáncer y lesiones invasión perineural, lo que sugiere la disfunción. cilios primarios se han mostrado para suprimir la ruta de Wnt. El aumento de la señalización de Wnt se ha implicado en el cáncer de próstata. Por lo tanto, se determinó una correlación entre la pérdida de cilios primarios y el aumento de la señalización de Wnt en la próstata normal y en el cáncer de próstata pre-invasiva e invasiva. Para investigar la señalización Wnt en nuestra cohorte, secciones de tejido de serie fueron teñidos para β-catenina como una medida de la señalización de Wnt. β-catenina nuclear se analizó y se encontró que la señalización de Wnt a ser mayor en las células de un-ciliadas en la próstata normal, PIN, un subconjunto de cánceres invasivos, y la invasión perineural. Nuestros resultados sugieren que los cilios normalmente funcionan para suprimir la vía de señalización Wnt en las células epiteliales y que la pérdida de cilios puede jugar un papel en el aumento de la señalización de Wnt en algunos cánceres de próstata. Estos resultados sugieren que los cilios son disfuncionales en el cáncer de próstata humano, y aumentan la señalización de Wnt se produce en un subconjunto de cánceres
Visto:. Hassounah NB, Nagle R, Saboda K, Roe DJ, Dalkin BL, McDermott KM (2013 ) primaria cilios están hundidos en el pre-invasores e invasiva del cáncer de próstata. PLoS ONE 8 (7): e68521. doi: 10.1371 /journal.pone.0068521
Editor: Vladislav V. Glinskii, Universidad de Missouri-Columbia, Estados Unidos de América
Recibido: 01 de marzo de, 2013; Aceptado: 30-may de 2013; Publicado: 2 Julio 2013
Derechos de Autor © 2013 Hassounah et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Ciencias de Arizona (http://www.sfaz.org), la beca de formación de Biología del cáncer (NIH; T32CA009213), la Universidad de Arizona Cancer Center Soporte Grant (NIH; P30CA023074), un R00 (NIH NICHD; R00HD056965); y la mejor que nunca Fundación (http://azcc.arizona.edu/outreach/bte). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cilio primario es un orgánulo basada en microtúbulos que sobresale de la membrana plasmática y actúa tanto como una "antena" para detectar señales extracelulares. cilios primarios son generalmente inmóviles, pero pueden detectar señales físicas y químicas. Las células con cilios primarios tienen sólo un único cilio que se extiende desde la superficie celular. En la base del cilio primario es el basal del cuerpo (también conocida como la madre centriolo), que está anclado a la membrana plasmática. El cuerpo basal nuclea los haces de microtúbulos que se extienden hasta el cilio (Figura 1A). Cientos de proteínas han sido identificados que conforman el cilio primario [1]. Muchas de estas proteínas se localizan en el cilio para regular las funciones sensoriales o de señalización del cilio primario. Los cilios actúan como antenas a través de la detección de señales extracelulares y ayudan a regular la señalización celular; por ejemplo, los cilios primarios son reguladores negativos de la vía de Wnt [2,3]. En concreto, los cilios primarios amortiguan la respuesta de señalización de Wnt por compartimentar las proteínas de señalización Wnt, como el regulador positivo Jouberin [3]. Los cilios tienen un papel demostrado en la biología del desarrollo y enfermedades humanas conocidas como ciliopatías (por ejemplo, síndrome de Joubert (JBTS), la enfermedad poliquística del riñón (PKD), el síndrome de Bardet-Biedl (BBS), y Nefronoptisis (NPHP)) [4].
Imágenes de (A) normal de la próstata y (B) el cáncer de próstata invasivo. En serie diapositivas adyacentes fueron teñidas con H & amp; E para visualizar la morfología del tejido o teñidas con fluorescencia para los núcleos (Hoechst; azul), los cilios primarios (Ac-Tub; rojo) y los centrosomas (γ-Tub; verde). Las estructuras etiquetadas son lumen (Lum), cáncer (Ca), y el estroma (Strm). El recuadro muestra la ampliación de (A) un cilio primario en una célula epitelial normal y (B) un centrosoma sin un cilio en una célula de cáncer. El asterisco indica que la tinción inespecífica (C, arriba). Diagrama de cajas del porcentaje de células epiteliales ciliadas y cáncer por paciente para cada tipo de tejido: normal, neoplasia intraepitelial prostática (PIN), cáncer (Ca), y la invasión perinerual (Peri). línea de color naranja y la flecha corresponden a Q4 (cuartil 4; mayor que el 75
percentil para el tejido normal) y la línea azul y la flecha corresponden a Q1 (cuartil 1, inferior o igual al 25
percentil para el normal tejido). Las estadísticas se realizaron mediante regresión lineal (*** = p & lt; 0,001) (C, abajo). El porcentaje de pacientes con una cilios anormalmente alto porcentaje (Q4; naranja) o un por ciento de los cilios anormalmente baja (Q1; azul). (D) Porcentaje de células de cáncer de Ki67 positivas invasivas y células de cáncer de invasión perineural por paciente (eje x) frente a células de cáncer por ciento ciliadas para el mismo paciente (eje y). El análisis estadístico fue una correlación de Spearman no paramétrico.
Los cilios también desempeñan un papel causal en la tumorigénesis [5,6]. Los modelos de ratón demuestran que en algunos contextos los cilios son necesarios para promover el cáncer, mientras que en otros entornos pérdida de cilios aumenta la incidencia de tumores. expresión cilios reducido se ha observado en los cánceres humanos incluyendo el cáncer de páncreas, carcinoma de células renales, cáncer de mama, colangiocarcinoma, y melanoma [7-11]. Estos estudios apoyan la hipótesis de que los cilios primarios puede actuar como un orgánulo supresor tumoral en algunos tejidos. La pérdida de cilios primarios se demostró de nuevo en la neoplasia intraepitelial pancreática premalignas, lo que sugiere que la pérdida de cilios puede que tenga que ocurrir temprano para permitir la formación de cáncer de páncreas [10].
La frecuencia y la funcionalidad de los cilios primarios en preinvasora e invasivo humana cáncer de próstata no se ha caracterizado con cuidado. El cáncer de próstata es el segundo cáncer más comúnmente diagnosticado y la sexta causa principal de muerte por cáncer en los hombres en todo el mundo. La vía de señalización Wnt canónica se ha implicado en el cáncer de próstata humano, pero el papel de esta vía en el cáncer de próstata no se entiende completamente. El presente estudio tiene como objetivo caracterizar la frecuencia de los cilios primarios y la función en el cáncer de próstata humano y para examinar la correlación entre la expresión de los cilios primarios y señalización de Wnt. Se demuestra que la frecuencia de los cilios primarios se reduce en todas las etapas del cáncer de próstata, a partir de lesiones preinvasivas temprana para etapas invasivas. longitudes de los cilios primarios también están disminuidos en cáncer de próstata pre-invasiva e invasiva, lo que sugiere la pérdida de función. Además, demuestran que la ausencia de cilios se correlaciona con un aumento de la localización nuclear de β-catenina en el tejido normal de la próstata, y β-catenina nuclear está aumentada en PIN, un subconjunto de los cánceres de próstata, y las áreas de invasión perineural.
Materiales y Métodos
muestras de tejido humano
Todas las muestras de tejido incluido en parafina fijado en formol se obtuvieron a partir del tejido celular Adquisición y /Molecular Análisis de Servicios compartidos (TACMASS) en la Universidad de Arizona Cancer Center. muestras de tejido de prostatectomía fueron compradas a los pacientes sometidos a prostatectomía radical abierta de 2006 a 2009. El tejido de sólo un paciente fue adquirida a través de la resección transuretral de la próstata. Para el tejido de la próstata, un total de 32 bloques de 25 casos fueron elegidos en base a la presencia de áreas de interés, los cuales fueron identificados por un patólogo que observa la hematoxilina archivado y eosina (H & amp; E) de deslizamiento del tejido teñidas para cada bloque de tejido . De los 25 casos, 23 casos tenían un cáncer localizado en el bloque de tejido. En siete casos, dos bloques de tejido fueron utilizados del mismo paciente para obtener todas las áreas de tejido de interés. microarrays de tejidos (TMA) se desliza también fueron utilizados a partir de tejido adquirido de los pacientes sometidos a prostatectomía radical abierta desde 1992 hasta 2001. Cinco diapositivas TMA contienen ~ Se utilizaron 54 núcleos (1 mm cada una) por portaobjetos. Cada muestra del paciente fue representado cuatro veces entre el TMA se desliza con tres núcleos de tejido tumoral y un núcleo a partir de tejido normal. A partir de los TMA diapositivas, núcleos de tejido de un total de 53 pacientes fueron elegidos en base a la presencia de tejido utilizable con el cáncer y /o lesiones invasión perineural. Del tejido TMA a partir de los 53 pacientes, 1 paciente tenía sólo lesiones invasión perineural. Para todas las muestras de tejido de próstata descritas, una sola urólogo realiza las cirugías. También se obtuvieron datos de los pacientes y clínicos para la mayoría de los pacientes, incluyendo la edad en el momento de la cirugía, el estadio tumoral patológico, los niveles de pre-operatorio de próstata libre de antígeno específico (PSA), la recurrencia bioquímica, el tiempo hasta la recurrencia bioquímica, la penetración capsular, y el volumen del tumor más grande. consentimiento por escrito fue dado por los pacientes para que su información se utiliza para la investigación. recurrencia bioquímica se define como PSA libre en suero & gt; 0,1 ng /ml para dos mediciones consecutivas. El rango de la longitud de tiempo entre la cirugía y la última de seguimiento es de 10 meses a 16 años. Patológicamente normales, tejidos de la próstata sin cáncer de 10 pacientes se utilizaron como controles y se obtuvieron de pacientes con cáncer de vejiga que se sometió a cistoprostatectomías.
secciones de tejido en serie se cortaron para cada muestra. La primera sección de serie se tiñó para H & amp; E y la sección de tejido entero fue escaneada con un objetivo de 20x utilizando el escáner de diapositivas DMetrix automatizado (DMetrix, Inc.). Las imágenes digitales fueron anotados utilizando el software del ocular (DMetrix, Inc.) por un patólogo certificado para cada una de las áreas de interés por lámina de tejido. Para toda la cohorte, las áreas de interés utilizados fueron como sigue: próstata patológicamente normal a partir de pacientes con cáncer de vejiga (n = 10), patológicamente de próstata normal adyacente al cáncer (n = 16), la hiperplasia prostática benigna (BPH; n = 8), neoplasia intraepitelial prostática (PIN; n = 24), PIN de bajo grado (LG PIN; n = 13) y el PIN de alto grado (HG PIN; n = 18), de bajo grado (LG; suma la puntuación de Gleason = 6; n = cánceres 35) y de alto grado (HG; lesiones n = 40), y la invasión perineural (n = 18); suma de Gleason score & gt; 6. Todos los tipos de tejidos se tomaron de las prostatectomías radicales, excepto por el tejido de la próstata patológicamente normal a partir de pacientes con cáncer de vejiga (estos eran de cistoprostatectomías). Siete pacientes tenían tanto LG (aumento del tamaño nuclear nuclear a citoplásmica ratio, y el aumento) y HG (presencia de nucleolos prominentes, aumento del tamaño nuclear nuclear a citoplásmica ratio, y el aumento) PIN. Gleason suma puntuación es un método de clasificación utilizado para evaluar el grado de diferenciación [12]
inmunofluorescencia
La serie de diapositivas de tejidos a la H & amp;. Portaobjetos teñido-E se utilizó para co-tinción de cilios, los centrosomas y citoqueratina 5 (CK5). diapositivas tejido incluido en parafina se desparafinaron en un incubador seco a 65 ° C durante 15 minutos y se hidrataron mediante lavado con xileno (2 x 10 min), 100% de isopropanol (2 x 10 min), 70% de isopropanol (2 x 10 min) , 50% de isopropanol (2 x 10 min), y agua ultrapura (2 x 10 min). Todos los lavados fueron a temperatura ambiente. la recuperación de antígenos con una solución desenmascaramiento EDTA 1 mM se realizó con un Retriever 2100 (Microscopía Electrónica de Ciencias) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. diapositivas de tejido se colocaron en placas de cubierta Shandon (Thermo Scientific, Cat#72-110-017) y luego en Sequenza Slide Bastidores (Thermo Scientific, Cat#NC0263065). diapositivas de tejido fueron bloqueadas con tampón de dilución de anticuerpos ChemMate (Ventana Medical Systems, Inc., Cat#ADB250) con suero de cabra (5%) (Invitrogen Corporation, Cat#16210-064) durante 45 minutos a temperatura ambiente. Los anticuerpos primarios y secundarios se diluyeron en el tampón de dilución de anticuerpos ChemMate a escala 1: 1000. Los anticuerpos primarios se utilizaron contra tubulina acetilada (ratón IgG monocloncal
2B, Sigma, Cat#T7451, clon 6-11B-1), γ-tubulina (IgG1 monoclonal de ratón, Sigma, Cat#T5326, el clon GTU-88), y (policlonal de conejo, Abcam, Cat#ab24647) CK5, y se incubaron en el tejido durante la noche a 4 ° C. Cinco portaobjetos se tiñeron con otro anticuerpo primario contra CK5 (listo para el uso del ratón monoclonal IgG1, Leica Microsystems, Cat#CK5-R-7-CE) para verificar la especificidad del anticuerpo CK5 utilizado. diapositiva tisú de una próstata con áreas normales y cancerosas también se tiñeron con un anticuerpo primario contra Arl13b (monoclonal de ratón IgG
2a, UC, Facility Davis /NIH NeuroMab, N295B clon /66) para verificar el marcado de los cilios con el anticuerpo contra tubulina acetilada. Los portaobjetos se lavaron con PBS durante 10 minutos (3 x 10 min). Los anticuerpos secundarios utilizados eran isotiocianato de tetrametilrodamina (TRITC) marcado con anticuerpo de cabra anti-ratón-IgG
2B (Southern Biotech, Cat#1090-1003), cabra Alexa 633 marcado con anti-ratón-IgG1 (Invitrogen, Cat#A21126) , cabra Alexa 546 marcado con anti-ratón-IgG
2 bis (Invitrogen, Cat#A21133) e isotiocianato de fluoresceína (FITC) marcado con anticuerpo de cabra anti-conejo-IgG (Southern Biotech, Cat#4052-02). Los anticuerpos secundarios se incubaron sobre el tejido durante 45 minutos a temperatura ambiente. Se lavaron los portaobjetos con PBS durante 10 minutos (3 x 10 min). Hoechst 33342 (Cat#H3570, Invitrogen) se utilizó como contratinción en 1: 1000 y se incubó en portaobjetos durante 10 minutos, seguido de lavado con PBS durante 5 minutos (2 x 10 min). Las diapositivas fueron montadas con cubreobjetos 1,5 (0,16 a 0,19 mm de espesor) (Fisher Scientific, Cat#12-544B) usando Prolong Oro Antifade montaje de los medios de comunicación (Cat#P36934, Invitrogen).
Confocal de imágenes
la diapositiva tejido que estaba en serie adyacente al escaneada digitalmente H & amp; e portaobjetos se tiñeron con fluorescencia de los cilios, los centrosomas, CK5 y Hoechst. El Leica TCS SP5 II de barrido láser microscopio confocal (Leica Microsystems) se utilizó para la imagen de las diapositivas con fluorescencia manchado. Las áreas de interés fueron encontrados usando un objetivo de baja potencia de magnificación (10x, 0,4 Apo PI) de contraste para visualizar Hoechst en la diapositiva con fluorescencia manchados y haciendo referencia a la anotada H & amp serie adyacente; E, que fue escaneada digitalmente. Esto nos permitió encontrar exactamente la misma área de interés que había sido anotada por el patólogo en el H & amp; E. Una vez que se encontró el área de interés, pilas Z A continuación, se adquieren con el diodo de láser violeta a 405 nm para detectar la tinción de Hoechst a un espesor total de 2 ± 0,5 micras, con una Z-paso dado cada 1 m. Los cilios Después se fotografiada dentro de estas áreas de interés usando un objetivo 63x (1,4 NA PL Apo) con los láser de helio-neón (543 nm y 633 nm), CK5 fue fotografiada con el láser de argón (488 nm), y el diodo de láser violeta (405 nm) se utilizó para detectar la tinción de Hoechst. Z-pilas fueron adquiridas a un espesor total de 5,0 ± 0,5 micras, con un Z-paso que se da todos los (resolución de imagen de 2048x2048 píxeles) 0,34 micras. Se adquirió una serie de imágenes por 1-6 ubicación usando el objetivo 63x según el tipo de tejido por paciente y esto varía dependiendo del tamaño de la ubicación. Z imágenes se procesaron posterior a la adquisición de proyecciones de máxima utilizando el software Leica LAS AF para el análisis de imágenes.
se obtuvieron
análisis de imagen confocal
Los cilios de frecuencias y longitudes de los cilios para cada tipo celular utilizando el Leica LAS software AF. Los cilios se anotó solamente cuando ambos axonema ciliar y el centrosoma se veían juntos. Para cada tipo de células [CK5 positivo (CK5 +) epitelial /células cancerosas, (CK5-) células epiteliales /cáncer CK5 negativos, y las células CK5-estromales], los núcleos se contaron usando la herramienta de recuento, y las longitudes de los cilios se midieron usando la barra de escala herramienta. El número de los cilios por tipo de célula se divide por los núcleos totales por tipo de célula para obtener un porcentaje de células ciliadas. Al menos 171 núcleos se contaron según el tipo de tejido por paciente (max = 2,770, mediana = 782). La mediana de longitudes cilios por paciente se determinaron y se utilizan en los datos y los análisis estadísticos. Boxplots ilustran los datos, en el que el 75
y 25
º percentiles están marcadas por los límites de la caja superior e inferior, respectivamente. La línea de color negro dentro del cuadro indica la mediana. Los valores atípicos se definen como & lt; 25
percentil -1.5X rango intercuartil, o & gt; 75
percentil + 1,5X rango intercuartil (círculos abiertos). los valores extremos se definieron como sea & lt; 25
percentil -3X rango intercuartil, o & gt; 75
percentil + 3X rango intercuartil (círculos vendidos). Hemos utilizado los datos obtenidos sobre ciento cilios y longitud cilios encontrado en la próstata normal para establecer un punto de corte para proporcionar un punto de comparación con respecto a los cilios que se encuentran en muestras PIN y cáncer. Las 25
º percentiles superior e inferior fueron elegidos como nuestros puntos de corte normales relativos y esto se mantuvo constante a través de nuestro análisis. A partir de los diagramas de caja, el porcentaje de pacientes con un porcentaje anormal de las células ciliadas o longitud cilios mediana anormal se calcularon. Estas mediciones anormales fueron definidas por la 75
y 25
º percentiles de lo normal. Los valores se consideraron anormalmente alta si se cayó encima de la 75
percentil de lo normal y anormalmente baja si caían en o por debajo del 25
percentil de la normalidad. No se sabe nada acerca de las longitudes exactas de los cilios necesarios para la función normal. Por lo tanto, nuestro superior e inferior 25
º percentil de corte sólo proporcionan un marco de referencia para la comparación a la normalidad.
La inmunohistoquímica
diapositivas de tejido incluido en parafina fijadas con formalina se tiñeron con un similares protocolo utilizado para las diapositivas immunofluorescently manchadas descritas anteriormente. La recuperación del antígeno se llevó a cabo como se ha descrito, pero con la solución de antígeno desenmascarar vectorial (1: 106) (Vector Laboratories, Cat#H-3300), seguido de inactivación de la actividad de la peroxidasa endógena a temperatura ambiente durante 20 minutos utilizando peróxido de hidrógeno en metanol (0,3% ). Diapositivas luego fueron lavados con PBS (4 x 10 min), se colocaron en placas de cubierta Shandon (Thermo Scientific, Cat#72-110-017) y luego en Sequenza Slide Bastidores (Thermo Scientific, Cat#NC0263065). Diapositivas fueron bloqueadas con el bloqueo de 2,5% de suero de caballo normal tampón (Vector Laboratories, Cat#S-2012) durante 20 minutos, y luego con tampón de dilución de anticuerpos ChemMate (Ventana Medical Systems, Inc., Cat#ADB250) con suero de cabra (5 %) (Invitrogen Corporation, Cat#16210-064) durante 45 minutos. Todos los lavados y etapas de bloqueo fueron a temperatura ambiente. Los anticuerpos primarios se diluyeron en el tampón de dilución de anticuerpos ChemMate. Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: ß-catenina anticuerpo primario (1: 400, IgG1 monoclonal de ratón, BD Transduction Laboratories, Cat#610154) y Ki67 (1: 100, IgG1 monoclonal de ratón, Dako, Cat#M7240, clon MIB-1 ). Colon diapositivas de tejido de adenocarcinoma se utilizaron como control positivo para la β-catenina y la tinción de Ki67. diapositivas de tejido con anticuerpo secundario solamente se utilizaron como un control negativo. Los anticuerpos primarios se incubaron en los tejidos durante la noche a 4 ° C. a continuación, se lavaron los portaobjetos en PBS (3 x 10 min). Un anti-conejo universales, anti-ratón anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa (Reactivo ImmPress universal, Vector Laboratories, Cat#MP-7500) se incubó en el tejido durante 30 minutos, seguido de un lavado en PBS durante 5 minutos. 3-amino-9-etilcarbazol (AEC) con alta sensibilidad cromógeno sustrato (Dako, Cat#K3461) fue su uso como el sustrato de peroxidasa para β-catenina y la tinción de Ki67. AEC se incubó en portaobjetos durante 3 minutos para la tinción de β-catenina y 7 minutos para la tinción Ki67. diapositivas de tejidos se enjuagaron con agua destilada durante 5 minutos. Hematoxilina 1 (Thermo Scientific, Cat#7221) se utilizó para contrateñir los portaobjetos de tejido. Hematoxilina 1 se diluyó 1: 3 y se incubaron en portaobjetos de tejido durante 15 segundos y luego se enjuaga con agua del grifo hasta que el agua corrió clara. Se utilizó Faramount medios acuosos de montaje (Dako, Cat#S3025) para las diapositivas de montaje con 1,5 cubreobjetos (desde 0,16 hasta 0,19 mm de espesor) (Fisher Scientific, Cat#12-544B).
La inmunohistoquímica análisis
diapositivas de enteros teñidos para β-catenina fueron escaneados utilizando un escáner DMetrix automatizado de 20 aumentos (DMetrix Inc.). Los cortes teñidos para Ki67 fueron escaneados utilizando un objetivo de 20x con el escáner BioImagene (Ventana Medical Systems). Los mismos lugares utilizados para el análisis de los cilios primarios se encontraron haciendo referencia a la H & amp anotada; E diapositiva. Estas áreas de interés fueron exportados como archivos TIFF a partir de los archivos de exploración DMetrix, y como archivos JPEG de los archivos de exploración BioImagene, y se cargan en Definiens Tissue Studio 3.0 Software (http://www.tissuestudio.com). Tejido Studio 3.0 software ha sido probado de acuerdo absoluto con recuentos manuales manuales realizadas por dos investigadores independientes. Las imágenes de las seis de la próstata normal y seis localizaciones de cáncer de próstata se puntuaron a ciegas para la tinción nuclear de Gli1, donde cada núcleo se puntuó como positivo o negativo. Para cada imagen, Tissue Studio 3.0 se utiliza conjuntamente para cuantificar el número de células /núcleos positivos y negativos. Una prueba estadística que se utiliza para medir la consistencia de acuerdo y absoluta de las mediciones realizadas por diferentes observadores (correlación intraclase) se aplicó a los datos obtenidos para las seis tejidos normales y cancerosas de la próstata. El coeficiente de correlación intraclase se determinó como 0,7, utilizando el programa SPSS 19 (Statistical Package for the Social Sciences; IBM Corporation)., Que se considera un fuerte acuerdo
Para el análisis de Ki67, un poco de tejido del paciente no se podía utilizar para el análisis debido a demasiadas secciones de serie faltantes entre el portaobjetos teñido-Ki67 y el H & amp; e deslizante, por lo que es imposible localizar el área exacta utilizada para el análisis de los cilios primarios. El número de pacientes utilizados para el cáncer fue de 72, y el número de pacientes utilizados para la invasión perineural era 15. Para el análisis con Ki67 Definiens Tejido de estudio, un núcleo modificado (positivo /negativo) se utilizó solución. Los compartimentos epiteliales /cáncer y del estroma de las áreas de cáncer y la invasión perineural se analizaron por separado mediante el retorno de la inversión Selección manual (Seleccionar tramos) herramienta de segmentación, con una segmentación de 8. La hematoxilina y el umbral inmunohistoquímico (IHC) se fijaron en 0,12 unidades arbitrarias (UA ) y 0,03 UA, respectivamente. El umbral de IHC se determinó mediante la identificación de los más ligeros núcleo manchado positivamente en el conjunto de la muestra y usando este valor como el punto de corte para la positividad. Un paso Núcleo Morfología y filtro se utiliza para excluir objetos erróneamente identificados como núcleos. A partir de los resultados exportados, los índices positivos se calculan según el tipo de tejido por paciente
.
Algunos tejido del paciente no se podía utilizar para el análisis de β-catenina debido a la insuficiencia de las secciones de serie, o demasiadas secciones de serie faltantes entre la β- catenina manchada diapositiva y la H & amp; e deslizante, por lo que es imposible encontrar la ubicación exacta. Por lo normal, el número de ubicaciones utilizadas fue de 26, de 10 pacientes. Por PIN, el número de localidades fue de 19, de 13 pacientes. Para el cáncer, se utilizaron 154 localidades, de 64 pacientes. Para las lesiones de invasión perineural, el número de ubicaciones utilizadas fue de 23, de 11 pacientes. Para el análisis de β-catenina con Definiens Estudio de tejido, el porcentaje y la intensidad de la tinción nuclear en el tejido epitelial y canceroso fue adquirida. Stroma se excluyó del análisis, ya β-catenina se expresa principalmente en las células epiteliales. Para el análisis, se utilizó una solución de núcleos, la membrana y células modificadas. La ampliación y la resolución se fijó a 20x y 0,5 m /píxel, respectivamente. Se utilizó una selección de ROI Manual (Draw polígonos) para el normal, PIN, el cáncer, y las áreas de invasión perineural para analizar por separado el compartimento epitelial. En las células normales, basales, que fueron identificados por la posición, morfología y de acuerdo con la sección de tejido adyacente serie CK5 manchados, fueron seleccionados por separado de las células luminales para el análisis. En PIN, el cáncer y lesiones invasión perineural, se seleccionó toda la compartimiento epitelial /cáncer para el análisis. Después se seleccionaron las regiones de interés, los núcleos y las células separadas se identificaron utilizando manualmente los parámetros y umbrales fijados, seguido de clasificación de los núcleos basados en umbrales establecidos manualmente. Para identificar los núcleos y células, "membrana" fue elegido para el marcador IHC. Para la detección de núcleo, los umbrales de hematoxilina y IHC se fijó en 0.055 unidad arbitraria (a.u.) y 1,02 a.u., respectivamente. Para la detección de las membranas y las células, el umbral de IHC se fijó a 0 a.u., y el espesor de la membrana a 1 pixel. umbrales de clasificación Los núcleos se establecen para clasificar un núcleo que tienen ya sea no, bajo, medio o alto de tinción inmunohistoquímica. Estos umbrales se eligieron de forma individual sobre la base de diapositivas de una muestra de tejido de la próstata de control utilizado en cada ciclo de tinción, mediante la identificación de la tinción nuclear oscuras y más claras. La tinción más ligero se utilizó para establecer el umbral no /baja tinción, se utilizó la mayor tinción para el umbral alto /medio, y el valor entre esos dos umbrales se utilizaron para el umbral de baja /media. Los umbrales para ninguna tinción nuclear /baja oscilaron entre 0.3-0.4 au, la tinción de baja /media osciló entre 0,45-0,55 au y media /alta tinción varió entre 0,6-0,7 au
La puntuación histológica se calcula a partir de la siguiente fórmula: 3X (% de núcleos manchado alta) + 2X (% núcleos medio manchado) + 1X (% de núcleos teñidos baja). La puntuación histológico se determinó para cada lugar separado que se había utilizado para el análisis de los cilios, y esto se representa gráficamente frente ciento cilios. Debe tenerse en cuenta que existen múltiples ubicaciones por paciente, y se ha tenido en cuenta durante el análisis estadístico.
El análisis estadístico
Porcentaje de células ciliadas y las longitudes de los cilios se realizaron mediciones de las células individuales por agente y tipo celular: CK5 +, CK5-, y las células del estroma. Gráficos de dispersión de las células ciliadas por ciento y las longitudes de los cilios revelaron distribuciones muy desigual. Como resultado, se presentan las medianas en tablas de estadísticas de resumen. La significación estadística se evaluó mediante un modelo de regresión lineal que se agrupan en los casos con el fin de controlar para múltiples observaciones por participante. Las variables dependientes fueron transformados logarítmicamente para hacerlos más normal. Las diferencias entre las categorías de diagnóstico se obtuvieron mediante las variables indicadoras de ajuste para cada diagnóstico. Las tendencias lineales en la gravedad de diagnóstico se puso a prueba mediante el ajuste de diagnóstico como una variable continua. La correlación entre el porcentaje de los cilios y la puntuación de Ki67 de cáncer se realizó utilizando una correlación de Spearman no paramétrico. Las asociaciones entre ciento cilios y los datos del paciente se cuantificaron utilizando regresión lineal. Análisis de las diferencias en β-catenina nuclear se realizó utilizando la correlación, regresión lineal, y las tablas de dos por dos. Todos los análisis se realizaron en STATA (StataCorp). Un valor de p menor de 0,05 fue considerado estadísticamente significativo. Los análisis estadísticos no controlan para comparaciones múltiples.
Resultados
expresión cilios primaria disminuye en preinvasora e invasiva del cáncer de próstata
Para caracterizar la frecuencia de los cilios primarios en diferentes niveles de gravedad de cáncer de próstata humano, se determinó la presencia cilios primarios para los diferentes tipos de tejidos: tejido normal, libre de cáncer, neoplasia intraepitelial prostática (PIN), cáncer y lesiones invasión perineural (véase la Tabla 1 para más detalles). La primera sección de serie se tiñó con H & amp; E para identificar las áreas de lo normal, PIN, cáncer y lesiones invasión perineural. El H & amp; diapositiva E se utiliza como referencia para encontrar los tipos de tejido de interés en la sección de serie adyacente, que estaba manchada para tubulina acetilada (Ac-Tub) para visualizar los cilios primarios y γ-tubulina (γ-Tub) para identificar asociados centrosomas (Figura 1A y 1B). frecuencia de los cilios primaria y la longitud se cuantificaron. Un total de 90,427 núcleos se contó con un promedio de 20,782 núcleos contados según el tipo de tejido y un rango promedio de 248-1603 núcleos por paciente (Tabla S1A en la Tabla S1).
N (%)
Edad el momento del diagnóstico (años) n = 76 & lt; 6020 (26,3) 60-6411 (14,5) 65-6926 (34,2) 70-7416 (21,1) & gt; 743 (3,9) La mediana = 65 media = 64 ± 7 Rango = 46-77Gleason scoren suma = 75635 (46,7) 7-1040 (53,3) * PIN de grado n = grade13 24Low (54.2) de alta grade18 (75) Patológica stagen = 77pT1-pT225 (32.5) pT352 (67.5) Volumen de tumor más grande (cc) n = 25 & lt; 3,08 (32) 3,0 a 6,09 (36) 06/01 a 09/04 (16) desde 9,1 hasta 122 (8) & gt; 122 (8) La mediana = 4 Mean = 6,3 ± 8,3 Rango = 0.13-42Pre-operatorio PSA libre de suero (ng /ml)n=58<3.03 (5,2) 3.0-6.024 (41,4) 6.1-9.015 (25,9) 9.1-124 (6,9) & gt; 1.212 (20,7) mediana media = 6,4 = 11,2 ± 20,4 Rango = recurrencia 1.8-154Biochemical * * n = 78Yes44 (56,4) No34 (43.6) Tabla 1. Resumen de los pacientes y los datos clínicos. sérico tan libre
* Siete muestras de pacientes han tanto de bajo grado y PIN de alto grado (prostática neoplasia intraepitelial). ** La recidiva bioquímica definida PSA & gt; 0,1 ng /ml para dos mediciones consecutivas. Tiempo desde la cirugía para durar los niveles de PSA grabados para los pacientes sin recurrencia bioquímica rangos de 12,5 meses a 15,2 años, y los pacientes con recurrencia el momento de la cirugía a intervalos de recurrencia bioquímica de 1,3 meses a 13, 1 años. Descargar CSV CSV
La pérdida de cilios primarios se observó en las muestras preinvasoras prostáticas (PIN de bajo grado (LG) y de alto grado (HG) combinado). El porcentaje medio de células epiteliales ciliadas en el PIN (media = 5,7%) disminuyó 36% en comparación con las células epiteliales normales (media = 8,9%; p = 0,24; Figura 1C, la parte superior y en la Tabla S1 A en la Tabla S1). Si bien esto no es una diferencia estadísticamente significativa, el 70,8% de las muestras PIN tenía una anormalmente baja (caída igual o inferior al 25
percentil de Q1 normal) porcentaje de células epiteliales ciliadas (Figura 1C, la parte inferior y en la Tabla S1 B en Tabla S1). También hubo una tendencia lineal significativa en general a la disminución de los cilios ciento al aumentar la gravedad del cáncer de próstata (p & lt; 0,0001; Tabla S1 A en la Tabla S1). Aunque este modelo supone aumento de la gravedad de lo normal, PIN, el cáncer invasivo, y luego a la invasión perineural, reconocemos que no todos los cánceres se desarrollan en esta secuencia. Debe tenerse en cuenta que la separación de las muestras de PIN en grupos LG y HG no reveló una diferencia estadísticamente significativa en el porcentaje de células ciliadas lo largo del estudio, por lo que LG y HG PIN no se separaron para obtener más ciento cilios análisis.