Extracto
Prohibitin 1 (PHB1) es una proteína altamente conservada que junto con su homólogo prohibitina 2 (PHB2) se localiza principalmente en la membrana mitocondrial interna. Aunque se identificó originalmente por su capacidad para inhibir la progresión de G1 S /en los fibroblastos humanos, su papel como supresor de tumores se discute. Para determinar la función de prohibitins en el mantenimiento de la homeostasis celular, hemos generado líneas celulares de cáncer que expresan shRNAs prohibitina dirigida. Se demuestra que las proteínas de la prohibitina son necesarios para la proliferación de células cancerosas. Baja regulación de la expresión prohibitina reducido drásticamente la tasa de división celular. Además, la morfología mitocondrial no se vio afectada, pero la pérdida de prohibitins dio lugar a la degradación de la OPA1 proteína de fusión y, en ciertas líneas celulares de cáncer, a una capacidad reducida para exhibir crecimiento independiente de anclaje. Estas células cancerosas también mostraron escasa adherencia a la matriz extracelular. En conjunto, estas observaciones sugieren prohibitins juegan un papel crucial en los procesos de adhesión en la célula y sosteniendo así la propagación de las células cancerosas y la supervivencia
Visto:. Sievers C, G Billig, Gottschalk K, T Rudel (2010) ¿Son Prohibitins Se requiere para la proliferación de células del cáncer y la adherencia. PLoS ONE 5 (9): e12735. doi: 10.1371 /journal.pone.0012735
Editor Syed A. Aziz, Health Canada, Canada |
Recibido: 15 Julio, 2010; Aceptado: 6 Agosto de 2010; Publicado: 14 Septiembre 2010
Derechos de Autor © 2010 Sievers et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por la financiando a través del VI Programa Marco de Investigación de la Unión Europea, proyecto de la derecha (LSHB-CT-2004 hasta 005.276) para TR. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Prohibitins (PHB1 y PHB2) son proteínas altamente homólogas que se conservan durante la evolución y ubicuamente expresado [1] - [3]. Prohibitins localizan principalmente a la mitocondria pero también se encuentran en el núcleo y en las balsas de lípidos de la membrana citoplasmática [1], [4] - [7]. La localización de balsas lipídicas es también una característica de otros miembros de la familia estomatina /prohibitina /flotilin /HflK /C-dominio (SPFH) de las proteínas [8].
PHB1
Los estudios realizados hasta la fecha han asociado con diversos papeles en el mantenimiento de la homeostasis celular. El trabajo inicial sugirió que funciona como un inhibidor de la síntesis de ADN, un papel que más tarde fue asignado a su 3'UTR [9], [10]. Una forma de expresión T-alélica de PHB1 se asoció con un mayor riesgo de cáncer de mama [11]; sin embargo, esta asociación no se confirmó en un entorno clínico [12], [13]. PHB1 co-localiza con factores de transcripción de la familia E2F en el núcleo de las células de carcinoma de mama [14], e interactúa con la proteína supresora de tumores Rb pRb en el núcleo resulta en la inhibición del ciclo celular [15]. Correspondientemente, se encontró el silenciamiento mediado por siRNA de expresión PHB1 para aumentar la proliferación de células de cáncer de mama [16]. A pesar de estos indicios de una actividad supresora de tumores, estudios recientes han demostrado también la proliferación celular reducida a la pérdida de expresión PHB1 en fibroblastos de embriones de ratón y otras células primarias; . Y el rescate de la proliferación celular a la sobreexpresión de mitocondrial orientada PHB2 [17]
Nuestro trabajo reciente indica PHB1 también juega un papel en la migración celular: silenciamiento transitoria de PHB1 por caída siRNA mediada condujo a un fenotipo aglutinación en células HeLa, comparable a la de un defecto de Her2 /ErbB2 o Rac, es decir células agrupadas mostraron tinción de membrana marcada para pan-cadherina y β-catenina. Los autores de contacto entre las células se rompieron sugeridas en las células tumorales debido a la pérdida de PHB1 [6]. Los estudios en levaduras han demostrado consistentemente que PHB1 y PHB2 actúan como chaperonas mitocondriales en la membrana mitocondrial interna [3], [18] - [20]. PHB1 y PHB2 son interdependientes en el nivel de proteínas y la pérdida de una conduce simultáneamente a la pérdida del otro [21]. Interactúan con proteasas mitocondriales, en particular MAAA, que se requiere en el ensamblaje de complejos de la cadena respiratoria [22], [23]. Un knock-out de prohibitins en la levadura condujo a un período de vida replicativa reducida y un defecto en el potencial de membrana mitocondrial [18], [24]. Varios estudios recientes también han abordado la función mitocondrial de prohibitins en líneas celulares humanas: La sobreexpresión de PHB1 se encontró para proteger contra el estrés oxidativo [25]; Además, desmontables mediada por siRNA de PHB2 condujo a la degradación de la proteína de fusión mitocondrial OPA1 [17] y la fragmentación de la red mitocondrial [21]. Sin embargo, todavía no está claro si la expresión prohibitina estabiliza el potencial de membrana mitocondrial (MMP) [17], [26], [27].
A continuación mostramos prohibitins juegan un papel en el mantenimiento de la homeostasis celular y la proliferación de las células cancerosas y células primarias. El agotamiento de prohibitins no tuvo un efecto importante sobre la función mitocondrial, pero sí afectó a la adhesión de las células a la matriz extracelular.
Materiales y Métodos
Cultivo de células
células
HEK293 y HeLa se obtuvieron de Colección alemana de microorganismos y cultivos celulares (DSMZ). células HT1080wt, Jurkat y Capani se obtuvieron de American Type Culture Collection (ATCC). IF6 células fueron un regalo de U. Rapp, Würzburg. Las células HeLa fueron probados y autenticados por DSMZ través STR-huellas dactilares. células HEK293 y células HT1080wt se cultivaron en DMEM con 10% de FCS, 1% penicilina /estreptomicina, 10 mM HEPES pH 7,4 y 4 mM L-glutamina. células HeLa, células IF6 y células Jurkat se cultivaron en RPMI con 10% de FCS, 1% de penicilina /estreptomicina. células HT29 se cultivaron en medio de McCoy, suplementado con 10% de FCS y 1% de penicilina /estreptomicina. células Capan I se cultivaron en medio RPMI con 20% de FCS y 1% de penicilina /estreptomicina. Todas las células se cultivaron a 37 ° C con 5% de CO2.
Generación de líneas celulares knockdown shRNA
shRNA-expresión de vectores se construyeron clonando diferentes shRNAs en el pLL3.7 o vector pLVTHM. Para generar un sistema de vector inducible, los shRNAs desde el sistema de expresión constitutiva pLVTHM se subclonaron en el sistema de vector inducible pLVPT, mediante la transferencia de la casete que contiene el shRNA y el promotor H1 a través de los sitios de restricción XhoI /XbaI. Todas las construcciones fueron verificadas por secuenciacion. Las secuencias de nucleótidos de los objetivos de shRNA utilizados son los siguientes: shLuci, 5'-AACTTACGCTGAGTACTTCGA-3 '; PHB1-0, 5'-GCGGAGAGAGCCAGATTTG-3 '; PHB1-3, 5'-GACACATCTGACCTTCGGGAA-3 '; y PHB2-0, 5'-GACAGAGAGGGCCAAGGAC-3 '. Transducidas de manera estable, las líneas celulares desmontables constitutivos o inducibles que se construyeron como se describe anteriormente [28]; véase también http://tronolab.epfl.ch/). Brevemente, las células HeLa se transdujeron con el respectivo vector lentiviral en presencia de polibreno (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.). Para la transducción de pLVPT vectores lentivirales, la expresión de shRNA se indujo por tratamiento con doxiciclina 1 mg /ml (Sigma) durante 3 días y las células se clasifican para expresión eGFP con el citómetro de flujo MoFlo® (Dako Denmark A /S, Glostrup, Dinamarca) . Para la validación de los niveles desmontables, el ARN se aisló utilizando el kit RNAeasy (Qiagen, Hilden, Alemania). Quantitative PCR en tiempo real se realizó con el Kit QuantiTect SYBR Green PCR en tiempo real (Qiagen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Todos los vectores se obtuvieron de D. Trono, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne, Francia.
Ensayo en agar blando
Las células (2 × 10
3) se inocularon en un 0,3% baja temperatura de fusión agarosa (Sigma) en DMEM suplementado con 10% de FCS, y se contaron las colonias después de 2-4 semanas de incubación a 37 ° C y 5% de CO
2.
la proliferación celular y el ciclo celular análisis
para la tinción de CFSE, se recogieron las células y se lavaron dos veces en PBS, teñidas con CFSE 5 M durante 5 min a temperatura ambiente (RT). Residual CFSE se eliminó lavando dos veces con PBS y las células se sembraron en placas de 6 pocillos y se cultivaron en medio de cultivo celular. La intensidad de fluorescencia CFSE se midió mediante análisis FACS cada 24 horas durante 5 días. ensayos de BrdU se realizaron utilizando el kit
Proliferación Celular ELISA, BrdU (quimioluminiscente) (Roche) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células se sembraron a 3,5 x 10
3 en un blanco con borde de placa de 96 pocillos. BrdU se añadió a una concentración final de 10 mM durante 1 hora. Peroxidasa anticuerpo anti-BrdU conjugado se añadió a las células durante 30 a 60 min a TA y se midió la luminiscencia después de una incubación de 3 a 10 min usando un luminómetro de microplacas Monolight 3096 (BD Bioscience).
TMRE tinción
para analizar el potencial de membrana mitocondrial, 100 nM TMRE se añadió al medio de cultivo y las células se incubaron adicionalmente durante 30 minutos en condiciones normales de cultivo. La incorporación se midió por FACS. Para el control de la pérdida completa del potencial de membrana, se añadió 1 M CCCP durante 5 min.
niveles de ATP
síntesis de ATP celular se midió utilizando un ATP
La bioluminiscencia kit de ensayo hsü
(ROCHE), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, 10
5-10
7 células /25 l por pocillo de una placa de 96 pocillos fueron lisadas en el mismo volumen de reactivo de lisis celular por incubación durante 5 min a TA. Cincuenta microlitros del reactivo de luciferasa reconstituido se añadió a la bien por inyección automatizada (BD Bioscience, Monolight luminómetro). Se tomaron medidas (duración de 2 segundos) después de un retraso de 1 segundo.
Western blotting
Las células se lisaron en tampón de muestra 2 x que contenía DTT 200 mM y se separaron las proteínas mediante SDS-10% PÁGINA. Después de la electroforesis, las proteínas se electrotransfirieron a una membrana microporosa fluoruro de polivinilideno y immunodetected utilizando anticuerpos contra OPA1 (BD Biosciences), PHB1 y PHB2 (NeoMarkers) y actina (Sigma). fragmentación OPA1 se cuantificó usando software AIDA.
Inmunofluorescencia tinción
Las células cultivadas en cubreobjetos se fijaron con 4% paraformaldehído durante 30 min a RT, y luego se permeabilizaron en 0,5% de Triton X-100. A continuación, las células se inmunotiñeron usando los siguientes anticuerpos: anti-ratón Tom20 (BD Biosciences) (1:100 dilución, 2 h RT), ratón anti-paxilina-1 (BD Transduction) (1:100), faloidina-Alexa 488 ( MoBiTec) (1:200) y burro anti-ratón, Cy ™ 3 (1:100). La cuantificación de la red mitocondrial se realizó utilizando el software ImageJ.
Microscopía Electrónica de Transmisión
Las células agotadas de prohibitins mediante la inducción de la expresión de shRNA durante 10 días se fijaron con glutaraldehído al 2,5%, se fijaron posteriormente con 0,5% de tetróxido de osmio y contrastada con ácido tánico y acetato de uranilo. Las muestras se deshidrataron en una serie de etanol y embebidos en Polybed. Ultrathin secciones se analizaron en un microscopio electrónico de transmisión Leo 906E (Leo GmbH).
ensayo de adhesión
Para medir la adhesión de células, las microplacas se recubrieron con 1 mg /ml de fibronectina, 2 mg /ml colágeno o 3 mg /ml de BSA, respectivamente. la expresión de GFP estaba por debajo de la sensibilidad del fluorómetro (a 488 nm), por lo que células teñidas con CFSE antes de la siembra. Las células se incubaron en pocillos recubiertos durante 30 minutos a 37 ° C.
Para analizar la migración celular y la adhesión, las células inducidas con doxiciclina durante 8 días fueron sembradas en condiciones subconfluent, en placas de cultivo celular o cubreobjetos, durante 20 h seguido de 4 horas de privación de suero. Las células fueron tratadas con 50 mM Forskolin durante 20 min para inducir la activación de AMPc /PKA y de ese modo lamellipodia y la formación de adhesión focal. Los filamentos de actina y adhesiones focales se visualizaron mediante inmunocitoquímica y adhesiones focales fueron contados manualmente.
Resultados
pérdida selectiva de células PHB1 empobrecido
Hasta la fecha no hay consenso sobre la función de PHB1 Ha sido alcanzado; en células de cáncer de mama, se ha informado PHB1 para actuar como un supresor de tumores [15], [16], mientras que en células endoteliales primarias agotamiento de PHB1 resultó en la proliferación celular reducida [26]. Para definir el papel de PHB1 en células HeLa, una línea celular de adenocarcinoma, hemos generado líneas celulares estables que expresan shRNAs PHB1 dirigida utilizando el sistema de expresión lentiviral pLL3.7 shRNA constitutiva [29]. Expresión de tres shRNAs diferentes, shPHB1-2, shPHB1-3 y shPHB1-0, dirigidas a la región de codificación de PHB1 indujo el agotamiento de PHB1 por interferencia de ARN (RNAi) en el mRNA (Fig. 1A) y proteína (Fig. 1B) nivel. El agotamiento de PHB1 correlacionado con la expresión simultánea de la proteína marcadora eGFP (Fig. 1C), lo que indica el éxito de la transducción lentiviral de estas células. entonces hemos crecido las diferentes líneas celulares y se controló la composición de la población de células mediante microscopía y análisis FACS. Se observó una reducción selectiva de las células que expresan shPHB-de la piscina de células, visible por una reducción en la población de células eGFP-positivo (Fig. 1D). Esta pérdida no se debió a un aumento de la apoptosis de las células que expresan shRNA-(datos no presentados), pero un crecimiento más rápido de las células que expresan la proteína no transducidas, PHB1, y por lo tanto, las células eGFP-negativos, que mostró proliferación normal.
(a, B) PHB1 ARNm y los niveles de proteína se redujeron de manera eficiente en células que expresan shPHB1-0, shPHB1-2 y shPHB1-3 usando el constitutiva lentiviral pLL3.7 sistema de expresión como se demostró por QRT-PCR y Western Blots, respectivamente. (C) En el momento de transducción lentiviral integración estable se indica mediante la expresión de GFP. (D) Con la expresión de shRNAs validados positivamente dirigidos PHB1 ARNm de la fracción de células que expresan GFP se redujo el plazo de diez días a partir de la transducción de un grupo de células transducidas dentro, como se muestra por análisis FACS. células (E) transducidas HeLa que expresan el vector de control o shRNAs PHB1 focalización se sembraron en agar blando. control de las células sólo crecieron en condiciones independientes de anclaje y colonias formadas.
Para probar si esta observación era específico para las células HeLa, una serie de diferentes líneas celulares de cáncer, incluyendo las células, Capan1, células T Jurkat HT1080wt , células IF6 y HT29, se transdujeron con la misma construcción lentiviral shRNA y su crecimiento monitorizados como antes. El análisis de transferencia Western reveló expresión de shPHB1-0 resultó en el agotamiento de PHB1 en todas las líneas celulares ensayadas (Fig. S1A). Además, similar a las células HeLa, el cultivo prolongado resultó en una pérdida de células eGFP-positivos (Fig. S1B), descartando un efecto específico de línea celular. Curiosamente, se observó un fenómeno similar en la proliferación de células primarias humanas endoteliales de vena umbilical (HUVEC) después de la transducción de shPHB1-0 (datos no presentados), lo que sugiere que la pérdida de PHB1 interfiere con la proliferación.
Dado que el crecimiento independiente de anclaje es una característica de las células del cáncer [30], que también evaluó este fenotipo en nuestras líneas celulares que expresan constitutivamente shRNAs orientación PHB1. Las células se sembraron en agar blando y el crecimiento de un seguimiento como antes. Las células de control y no transducidas exhibieron características normales de crecimiento, formando colonias y la proliferación, mientras que las células desmontables-PHB1 permanecían como células individuales (Fig. 1E), lo que indica PHB1 juega un papel en el crecimiento independiente de anclaje.
PHB1 /se requiere PHB2 para la proliferación de las células cancerosas
Desde el silenciamiento de la expresión condicional de PHB1 llevó a la pérdida de la proliferación y en consecuencia un crecimiento excesivo de las células no transducidas, los estudios a largo plazo sobre los efectos de la expresión PHB1 reducida a nivel molecular no estaban posible. Por lo tanto, expresamos la misma shRNAs validado para la caída funcional de PHB1 en un vector lentiviral bajo el control de un promotor inducible por doxiciclina [28]. Para analizar el papel de PHB2 y su interacción con PHB1, hemos diseñado un shRNA adicional dirigida específicamente PHB2 ARNm (para más detalles, véase Materiales y Métodos).
Se observaron reducciones en PHB1 y proteínas PHB2 expresión 3 a 4 días después la adición de doxiciclina, llegando a ser marcadamente reducida a los 5-6 días y luego permanecer de forma estable reduce hasta por 10 días (Fig. 2A, B). El agotamiento de una proteína prohibitina condujo a la pérdida de la otra (Fig. 2C). Este efecto probablemente fue debido a la desestabilización de proteínas como los niveles de mRNA del gen no silenciada se mantuvieron constantes (datos no mostrados). Como ya se observó en el silenciamiento constitutiva de PHB1 (Fig. 1D), el silenciamiento inducible de prohibitins condujo a la proliferación reducida de células. Los ensayos de incorporación de BrdU revelaron la síntesis de ADN reducida 5 días después de la inducción de PHB1 y el agotamiento PHB2 (Fig. 2D). Para evaluar la tasa de proliferación a nivel de una sola célula, las células se tiñeron con succinidylester fluorescente carboxi (CFSE); esta mancha se distribuye uniformemente en el citoplasma y distribuye estequiométricamente a las células hijas durante la división celular. La proliferación celular se disminuyó claramente en PHB1- o células PHB2-agotado en comparación con las células control (Fig. 2E). Además, estas células mostraron una reducción en la independencia de anclaje y no crecieron en agar blando (Fig. 2F). Por lo tanto, nuestros datos demuestran que prohibitins juegan un papel en la proliferación celular.
(A, B) de la transducción con el sistema lentiviral pLVPT permite doxiciclina shRNA expresión inducible. Dentro del tiempo indicado de PHB1 inducción y expresión de la proteína PHB2 se redujo de manera eficiente. (C) La expresión inducible de cualquiera PHB1 objetivo o PHB2 objetivo ARNm condujo a una expresión reducida de ambas proteínas, como se muestra mediante inmunotransferencia de tipo Western. (D) Análisis de la incorporación de BrdU muestra células HeLa que expresan shPHB1-0, shPHB1-3 o shPHB2-0 durante 10 días muestran una tasa de proliferación reducida en comparación con las células que expresan el control shRNA (shLuci). (E) la intensidad de CFSE, medido por FACS a 0 h (1), 24 h (2), 48 h (3), 72 h (4), y 96 h (5) es mayor en las células desmontables prohibitina indicando reducida dilución de CFSE ayunar replicar las células hijas. (F) La intensidad de CFSE se mide por FACS cada 24 h durante 5 días y la mediana de cada pico se representó frente a la otra. (G) la expresión inducible de shRNAs resultó en el mismo fenotipo de la reducción /pérdida de crecimiento independiente de anclaje en PHB1 (shPHB1-0, shPHB1-3) y PHB2 (shPHB2-0) desmontables células como se observa con el sistema de expresión constitutiva.
Pérdida de prohibitins conduce a la fragmentación de las mitocondrias
Desde prohibitins se localizan principalmente a las mitocondrias [1], decidimos probar si el agotamiento de prohibitins afectada la integridad de las mitocondrias. Usando microscopía de inmunofluorescencia se observó una clara fragmentación de la red mitocondrial en células que expresan shPHB1-3, que aumentó con el tiempo (Figura 3A, B.); Expresión de shPHB2-0 no inducir un aumento significativo en la fragmentación de la red mitocondrial (Fig. 3A, B). Además, la expresión de shPHB1-3 resultó en una caída más eficiente de ambos prohibitins.
(A, B) Las mitocondrias de células de prohibitina desmontables se tiñeron con anti-Tom 20 y fragmentación mitocondrial se cuantificó usando el software ImageJ. Una inducción prolongado con doxiciclina dio lugar a un aumento de la fragmentación en las células que expresan shPHB1-3. (C) transferencias de Western que muestran que la expresión prolongada shPHB1-3 doxiciclina inducida condujo a una caída más fuerte que la prohibitina expresión shPHB2-0, en correlación con un aumento de la fragmentación de la fusión de fragmentos competentes a y b de OPA1. (D) La cuantificación mostró que las formas competentes de fusión se degradan en los fragmentos más pequeños c y e. (E) Cuantificación de OPA1 patrones en las células de control (shLuci), las células PHB1-agotado (shPHB1-3) y las células tratadas con CCCP 60 M durante 80 min (CCCP) para inducir la pérdida de ΔΨm. El patrón OPA1 en las células tratadas con CCCP diferían de shPHB1-3 células que expresan, como los fragmentos A y B se pierde por completo, mientras que se incrementaron los fragmentos más pequeños dye. (F) imágenes TEM de las células con una caída prohibitina inducida por 10 días mostraron una apariencia más densa de las mitocondrias de las células de control shLuci que expresan, pero la morfología de la estructura de crestas no se cambió.
Entre muchas otras proteínas, OPA1 juega un papel importante en el control de la fusión mitocondrial [31] y crestas integridad [32]. Desde las publicaciones anteriores han demostrado que prohibitins son necesarias para la expresión estable de OPA1 [17], [21], se analizó el efecto de PHB1 y el agotamiento PHB2 sobre los niveles de mitocondrial OPA1 proteína de fusión. proteínas OPA1 se expresan como siete variantes de empalme, visible como cinco bandas (A-E) en una transferencia Western, atribuido en parte a la actividad de fusión de OPA1 [33]. Se observó la degradación de OPA1 en células agotadas de prohibitins, que se correlacionaban con la eficiencia de prohibitins agotamiento. En particular, la fusión de fragmentos competentes a y b se perdieron y los pequeños fragmentos C-e incrementaron en el agotamiento del PHB1 por períodos de tiempo más largos (Fig. 3C, D). Curiosamente, en las células que expresan bandas shPHB2-0 a y b se mantuvo intacta, y sólo aumenta en la banda de correo se observó (Fig. Figura 3C). El efecto fue específico para OPA1 ya que la degradación de otra proteína mitocondrial, incluyendo Hsp60, ATP sintasa y Tims y Toms no se observó (datos no presentados). Estos resultados apoyan una actividad selectiva de la shPHB1-3 en la fragmentación y degradación mitocondrial OPA1.
A partir de estudios previos se sabía que la disipación de la MMP induce la degradación OPA1 y fragmentación mitocondrial [33]. Por lo tanto, hemos probado si el patrón de fragmentación OPA1 inducida por el agotamiento PHB1 y MMP fue similar. Las células fueron tratadas con el desacoplamiento de cianuro reactivo carbonilo
m
clorofenil hidrazona (CCCP) y las bandas OPA1 se detectaron por inmunotransferencia. patrones de proteínas OPA1 eran claramente diferentes en las células sin MMP en comparación con los empobrecido de PHB1 (Fig. 3E). Los fragmentos competentes de fusión de OPA1 se degradaron y expresión de fragmentos C, D y E se incrementó en ausencia de MMP. En las células de prohibitina-agotado, la expresión de la expresión banda d fuertemente se disminuyó, mientras que la banda B se redujo sólo ligeramente, lo que sugiere que los diferentes mecanismos responsables de los efectos observados. En un experimento de curso de tiempo, se observó que CCCP provoca fragmentación mitocondrias antes de la degradación OPA1 (datos no presentados), lo que indica que la degradación OPA1 puede ser una consecuencia de la fragmentación mitocondrial en este caso.
Para probar si el silenciamiento de PHB1 induce la pérdida de MMP, teñidas shPHB1-3 células con perclorato tetrametilrodamina éster etílico (TMRE), un colorante penetra en las células que está retenido por las mitocondrias activas expresar. intensidad de la tinción TMRE fue similar en el control y las células PHB1-agotado (Fig. S2A), lo que sugiere que la membrana mitocondrial permanece intacto a pesar de la fragmentación de las mitocondrias en estas células. De acuerdo, los niveles de ATP se mantuvo sin cambios en las células agotadas de prohibitins (Fig. S2B). Dado que la degradación OPA1 También se ha demostrado que conducen a cambios en la morfología de crestas [32], se determinó la estructura de las crestas de las mitocondrias en las células agotadas de prohibitins utilizando microscopía electrónica de transmisión (TEM). En las células PHB1 silenciados y de control, estructura de crestas se mantuvo intacta (Fig. 3F), indicativo de una fisiología mitocondrial normal.
Cell- To- contacto celular es inhibida en las células de prohibitina empobrecido
Durante nuestros estudios iniciales sobre las líneas de células desmontables prohibitina, se observó que la pérdida de células de prohibitina-agotado era dependiente de la densidad a la cual se sembraron las células en placas de cultivo celular. A altas densidades de células, la pérdida de desmontables células se redujo pero no impedido (Fig. 4A). Por otra parte, la pérdida de expresión prohibitins causó un cambio en la morfología celular en ciertas líneas celulares de cáncer: células HeLa, especialmente cuando sembraron a baja densidad tiende a permanecer como células individuales con una morfología alargada, que recuerdan a los fibroblastos (Fig 4B.). Se observó un fenotipo similar cuando se mantuvieron células HeLa en condiciones de suspensión mediante la siembra de ellas en placas de cultivo celular de agarosa-cubierta: sólo se controlan las células colonias formadas, mientras que las células de prohibitina silenciados por células no formaron contactos a célula y colonias (Figura 4C. ).
(a, B) silenciamiento de la expresión prohibitina durante 10 días dio lugar a una morfología celular estirada con el núcleo ligeramente elevada. (A) Cuando se sembraron a baja densidad prohibitina desmontables células se mantuvo como células individuales con un mínimo contacto célula-célula. (B) A mayor densidad de semillas, células de prohibitina-desmontables todavía mostraba una morfología alargada, pero cualquiera de racimos formados (shPHB1-3) o se mantuvo predominantemente como células individuales con contactos célula-célula reducida. La tasa de proliferación de las células desmontables prohibitina también se incrementó en comparación con las células sembradas a baja densidad normal. (C) La prevención de anclaje mediante la siembra de células en placas de agar de cultivo de tejidos recubiertos de la fuerte degradación de la tasa de proliferación y la formación de colonias en las células de prohibitina una caída, mientras que las células de control (células que expresan shLuci) grandes grupos de células formado. (D) Prohibitin-agotan y las células de control se trataron con CFSE para aumentar la intensidad de la fluorescencia y se sembraron sobre el colágeno proteínas de matriz extracelular o fibronectina, o en BSA durante 30 min. las células no adherentes se lavaron y se midió la intensidad de fluorescencia. knockdown Prohibitin reduce significativamente la adhesión. (E) células inducida por doxiciclina se sembraron en cubreobjetos durante 20 h, seguido de privación de suero durante 4 h. Después del tratamiento con 50 mM Forskolin de 20 min, las imágenes de campo claro mostraron la formación de lamelipodios en células de control pero no en las células agotadas prohibitin-. Además, las células de prohibitina-agotado mostraron una disminución de la formación de adherencias focales como se muestra mediante tinción inmunocitoquímica utilizando faloidina y anticuerpos anti-paxillin. (F) Para la cuantificación de las adhesiones focales en células control y prohibitina desmontables, α-paxillin 1 Puestos teñidas fueron contados en 30 células por condición.
Para estudiar la formación de contactos célula-matriz, se sembraron las células en placas revestidas con la proteínas de la matriz extracelular fibronectina o colágeno. La adhesión de PHB1- y células PHB2-agotado a estas proteínas de la matriz se inhibió significativamente (Fig. 4D). Para cuantificar mejor unión célula-matriz, la formación de adhesión focal fue inducida por forskolina después de la privación de suero. La inmunofluorescencia reveló reduce la difusión y la formación de filamentos de actina (Fig. 4E), además de una reducción en el número de adhesiones focales (Fig. 4E, F). Estos datos sugieren que prohibitins también juegan un papel en la interacción célula-matriz.
Discusión
Desde el descubrimiento de su actividad anti-proliferativa, prohibitins se han implicado en múltiples funciones celulares [10] , [18], [34]. Sin embargo, varias líneas de evidencia indirecta, como su sobreexpresión en numerosas células del cáncer [35], indicaron que prohibitins no estaban funcionando como un supresor tumoral clásico. Aquí, se muestra prohibitins son un requisito previo fundamental para la proliferación celular del cáncer y la supervivencia. Utilizamos la expresión de shRNA-lentivirus mediada específicamente para reducir los niveles de ARNm y PHB1 PHB2 y proteínas, respectivamente. Usando el sistema de expresión constitutiva pLL3.7, hemos demostrado que, en todas las líneas celulares de cáncer analizadas, número de células, que expresan un mRNA PHB1 orientación shRNA se redujeron desde el interior de una piscina de las células transducidas y no transducidas. Además, las células PHB1-agotado eran incapaces de crecer en condiciones independientes de anclaje. Nuestros resultados están de acuerdo con dos estudios recientes que demuestran que el silenciamiento de PHB1 o PHB2 RNAi mediada por, respectivamente, conduce a la reducción de la proliferación en las células endoteliales primarias y fibroblastos embrionarios de ratón [17], [26]. Estos datos están en marcado contraste con un estudio previo que muestra aumento de la proliferación de la línea celular de melanoma cáncer de mama MCF-7 en siRNA mediada por silenciamiento de PHB1 [16]. Es posibles prohibitins juegan un papel diferente en células de cáncer de mama en comparación con otros tipos de células de cáncer.
De acuerdo con el hallazgo inicial de que el RNA de 3'UTR de PHB1 ejerce efectos citotóxicos sobre las células del cáncer [9] , [10], la expresión de un T-alélica PHB1 3'UTR se ha relacionado con un aumento de la susceptibilidad a cáncer de mama [11]: sin embargo, varios estudios clínicos han contradicho estos hallazgos [12], [13]. Además, la secuenciación de la PHB1 3'UTR de diferentes líneas celulares de cáncer, incluyendo células MCF-7, reveló una mayor frecuencia de variación de secuencia global en comparación con las células no cancerosas primarias en lugar de una expresión predominante de un T específica de alelo (CS y TR, sin publicar). Estos hallazgos sugieren que prohibitins juegan un papel en la carcinogénesis, pero el nivel en el que se ejerce el efecto, es decir, 3'UTR ARN o proteína, aún no está claro: Silenciamiento de cualquiera PHB1 o ARNm PHB2 por RNAi resultó en una reducción de la respectiva 3 ' UTR, sino también en una caída de ambas proteínas prohibitina. Dado que la expresión de toda la prueba shRNAs llevó a una tasa de proliferación más lenta, este fenotipo es más probablemente una consecuencia de la pérdida de proteínas prohibitina.
Para evaluar el efecto a largo plazo de agotamiento de la prohibitina, hemos generado líneas celulares HeLa con shRNA expresión inducible. En estas células PHB1 y PHB2 ARNm eran eficaz y selectivamente las reguladas tras la inducción de las proteínas shRNA y prohibitina de genes específicos fueron suprimidas de forma reversible. Al igual que en el silenciamiento constitutiva de PHB1 o PHB2, la inducción de la expresión de shRNA reduce la proliferación de células y la formación de colonias en placas de agar impedido suaves, indicativo de un defecto en el crecimiento independiente de anclaje. Estas líneas celulares nos han permitido poner a punto PHB1 y el silenciamiento PHB2 bajo condiciones estandarizadas y para investigar el mecanismo subyacente a la fuerte fenotipo asociado con el agotamiento prohibitina. Se analizaron primero el efecto de agotamiento de la prohibitina en los niveles de mitocondrial OPA1 proteína de fusión como publicaciones anteriores han demostrado que prohibitins son necesarias para la expresión estable de OPA1 [17], [21]. Hemos podido demostrar que la expresión OPA1 depende de los niveles de prohibitins. Una ligera reducción de prohibitins, visto poco después de la inducción de la producción shRNA, condujo a una fragmentación parcial de la fusión OPA1 competente fragmenta a y b. En posteriores del tiempo de inducción y por lo tanto más fuerte agotamiento de prohibitins, la fragmentación OPA1 aumentó y las mitocondrias apareció fragmentada. Una reducción incompleta de las proteínas prohibitina, como se ha visto con la expresión de shRNAs shPHB1-0 y shPHB2-0, sólo dio lugar a la fragmentación OPA1 leve y sin fragmentación de la red mitocondrial. Análisis posteriores revelaron que, incluso fuerte y de larga duración agotamiento de PHB1 por ejemplo, en las células que producen shPHB1-3, no causó la disipación de MMP
Hasta la fecha, los efectos de la pérdida prohibitina en células de mamíferos no están aún claros:. Schleicher et al. [26] y Ross et al.