Extracto
XB130, una nueva proteína adaptadora, media la proliferación cromosoma RET /PTC relacionados con el reordenamiento de las células del cáncer de tiroides y la supervivencia a través de fosfatidil -inositol-3-quinasa (PI3K) /Akt. Recientemente, XB130 se encontró en diferentes células de cáncer en ausencia de RET /PTC. Para determinar si RET /PTC se requiere de la proliferación relacionados con XB130 de células de cáncer y la supervivencia, las células de cáncer de tiroides WRO (con RET /mutación PTC) y células de cáncer de pulmón A549 (sin RET /PTC) fueron tratados con XB130 siRNA, y múltiple Akt abajo se examinaron las señales -stream. Llamar a la puerta abajo de XB130 inhibe la progresión G
1-S fase, y la apoptosis inducida espontánea y una mayor muerte celular por apoptosis inducida por estímulos intrínsecos y extrínsecos. Llamar a la puerta abajo de XB130 reducida fosforilación de p21Cip1 /WAF1, p27Kip1, FOXO3a y GSK3, el aumento de los niveles de p21Cip1 /WAF1protein y divisiones de la caspasa-8 y 9. Sin embargo, la fosforilación de FoxO1 y los niveles de proteína de p53 no fueron afectados por XB130 siRNA. También encontramos XB130 puede ser fosforilada por múltiples proteínas tirosina quinasas. Estos resultados indican que XB130 es un sustrato de múltiples proteína tirosina quinasas, y se puede regular la proliferación celular y la supervivencia a través de la modulación de señales seleccionado de aguas abajo de la vía PI3K /Akt. XB130 podrían estar involucrados en el crecimiento y la supervivencia de las células cancerosas diferentes
Visto:. Un Shiozaki, Shen-Tu G, X Bai, Iitaka D, De Falco V, Santoro M, et al. (2012) la proliferación de células XB130 media la Supervivencia del Cáncer y de señalización a través de Eventos Múltiples aguas abajo de Akt. PLoS ONE 7 (8): e43646. doi: 10.1371 /journal.pone.0043646
Editor: Laszlo Buday, Academia de Ciencias de Hungría, Hungría
Recibido: 23 Marzo, 2012; Aceptado: July 24, 2012; Publicado: August 23 de, 2012
Copyright: © Shiozaki et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de operación (MOP-13270 y MOP-42546) de los Institutos canadienses de Investigación en Salud, la concesión de becas de investigación de la Fundación Uehara Memorial y la Sociedad Internacional de Trasplante de corazón y pulmón para el Dr. Atsushi Shiozaki y por Associazione Italiana Ricerca sul Cancro (AIRC ). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
XB130 es un adaptador de proteínas recién descubierto para la transducción de señales intracelulares; Está implicado en la regulación de genes, la proliferación celular, la supervivencia celular, la migración celular, y la tumorigénesis [1]. Humana
xb130
gen fue descubierto durante el proceso de clonación de
gen AFAP humana [2], [3], [4]. Codifica 818 aminoácidos con un tamaño molecular aparente de aproximadamente 130 kDa. La estructura general de XB130 acciones similitud con AFAP por lo tanto también se conoce como AFAP1 como la proteína 2 (AFAP1L2). Como una proteína adaptadora, la región N-terminal de XB130 incluye varios sitios de fosforilación de tirosina y la secuencia rica en prolina, que potencialmente pueden interactuar con las proteínas que contienen el dominio SH2 y SH3, respectivamente. La parte media alberga dos dominios pleckstrin-homología (PH) que pueden dirigir proteínas a membranas celulares a través de interacciones con fosfolípidos específicos. La región C-terminal contiene un dominio de espiral de la bobina, lo que podría estar implicado en la oligomerización de proteínas y ADN [4] vinculante. XB130 puede interactuar y activar c-Src de tirosina quinasa, que conduce a la fosforilación de tirosina de múltiples proteínas elevada incluyendo XB130 y transactivación de AP-1 y SRE [4]. Durante la migración celular, XB130 regula reordenamiento del citoesqueleto de actina como se demuestra por su translocación a la periferia celular en lamellipodia. Silenciamiento endógeno XB130 puede causar una disminución en la tasa de cierre de la herida, inhibir la invasión de Matrigel, y reducir la persistencia lamellipodial y la propagación de células, lo que sugiere que desempeña un papel importante en la motilidad celular y la invasión [5].
XB130 está implicado en la proliferación de células del cáncer de tiroides y la supervivencia [1]. El cáncer de tiroides es un tipo de enfermedad maligna endocrina, que implica múltiples alteraciones genéticas y epigenéticas que conducen a MAPK y la activación de la vía de señalización de PI3K /AKT [6], [7], [8]. Una mutación común que se encuentra en el cáncer de tiroides es reordenamientos cromosómicos RET /PTC. La RET producto /PTC es una proteína producida a partir del reordenamiento cromosómico con la combinación de la porción 3 'del gen RET y de la 5' sección de un gen pareja. Esto resulta en una tirosina quinasa constitutivamente activada, RET /PTC [9]. RET /PTC exposiciones transformación de capacidad a través de efectuar la diferenciación, el potencial mitogénico y metastático en el cáncer de tiroides [10], [11]. RET /PTC provoca un robusto fosforilación de la tirosina de XB130, que promueve su asociación con la subunidad p85 de fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K). Esto a su vez activa Akt. Baja regulación de XB130 en TPC1 células de cáncer de tiroides papilar, que alberga el RET /PTC quinasa, la actividad de Akt fuertemente reducida, la progresión del ciclo celular y la supervivencia celular [12]. Además, en las células WRO, otra línea de células de cáncer de tiroides con RET /PTC mutación [13], las células transfectadas de manera estable con XB130 shRNA redujo el crecimiento del tumor en ratones desnudos. Microarray estudio identificó que múltiples genes regulados por XB130 están relacionados con la proliferación celular o la supervivencia, incluyendo muchos reguladores de la transcripción [14].
Desde XB130 es altamente expresado en la tiroides, se ha especulado que una tirosina-tiroides específica sustrato de quinasa. Recientemente, hemos encontrado expresión de XB130 en cáncer de esófago [15], y en otras líneas celulares de cáncer. En el presente estudio hemos tratado de determinar si XB130 juega un papel en las células cancerosas independientes de la presencia de RET /PTC. Además, aunque la vía PI3K /AKT se ha identificado como importante para la proliferación celular mediada por XB130 y la supervivencia, las señales aguas abajo de Akt son todavía por determinar. Por lo tanto, estudiamos estos eventos con células WRO, una línea celular de cáncer de tiroides humana con RET /PTC reordenación, y A549, una línea celular de adenocarcinoma de pulmón humano sin RET /PTC.
Materiales y Métodos
Líneas celulares, anticuerpos y otros reactivos
células de carcinoma de tiroides folicular WRO Humanos (establecidas por el Dr. GJF Juillard, Universidad de California-Los Angeles Escuela de Medicina, Los Ángeles, CA, EE.UU.) se mantuvieron en RPMI 1640, suplementado con 10% FBS, piruvato 1 mM y aminoácidos no esenciales (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD, EE.UU.) [13]. Las células humanas de adenocarcinoma de pulmón A549, obtenidas de ATCC (CCL-185; Manassas, VA) [16], se cultivaron en medio DMEM, suplementado con 10% FBS, 1% de penicilina-estreptomicina, y 1% de glutamina. Las células se cultivaron en un incubador humidificado estándar a 37 ° C con 5% de CO
2.
vectores de expresión para RET /PTC3, versiones activadas de ABL y SRC [17], o EGFR y ErbB2 [18 ], que se activan a la sobreexpresión, se describen en otros lugares. El anticuerpo monoclonal XB130 se generó como se describe anteriormente [4]. Los anticuerpos para fosfo-Akt (Ser473), Akt, fosfato GSK-3β (Ser9), p21Cip1 /WAF1, p27Kip1, p53, fosfo-FoxO3a (Thr32), FoxO3a, fosfo-SAPK /JNK (Thr183 /Tyr185), SAPK /JNK, p38 MAPK fosfo-(Thr180 /Tyr182), p38 MAPK, fosfo-p44 /42 MAPK (Thr202 /Try204), phosho-Src (Try416) eran de Señalización celular Tecnología (Beverly, MA, EE.UU.); anticuerpos monoclonales anti-fosfotirosina eran de Upstate Biotechnology Inc. (Lake Placid, NY, EE.UU.) y anti-c-myc (SC-40) eran de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EE.UU.). Los anticuerpos para GAPDH, ERK1, fosfo-p21 (Thr145), caspasa-8 y la caspasa-9 eran de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EE.UU.). anticuerpo anti-PCNA fue de Abcam (Cambridge, MA, EE.UU.). Anti-Ki-67, el clon Ki-S5, fue de Chemicon (Temecula, CA, EE.UU.). Anti-Src (GD11) y anti-Fas mAb (clon CH11) eran de Upstate Biotechnology Inc. (Lake Placid, NY, EE.UU.). (Thr157) de anticuerpos anti-fosfo p27Kip1 era de I + amp; D Systems Inc. (Minneapolis, MN, EE.UU.). Anti-p85 de PI3K anticuerpo fue de BD PharMingen (San Diego, CA, EE.UU.). Estaurosporina fue de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.).
Estudios Proteína
experimentos
Immunoblotting se realizaron de acuerdo con los procedimientos estándar descritos anteriormente [2], [3]. Brevemente, las células se lisaron con tampón de ensayo de precipitación radioinmune modificada (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 150 mM, EGTA 2 mM, EDTA 2 mM y 1% de Triton X-100) que contiene 10 mg /ml cada uno de aprotinina, leupeptina, pepstatina, 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 1 mM Na
3Vo
4, y 10 mM NaF. La concentración de proteína se midió con un ensayo de Bradford modificado (Bio-Rad, Munich, Alemania). Los lisados celulares que contienen la misma cantidad de proteínas totales se separaron por SDS-PAGE y después se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Schleicher & amp; Schuell, Whatman, Middlesex, Reino Unido). Después las membranas se sondearon con los anticuerpos indicados. Las proteínas fueron reveladas por un kit de detección de quimioluminiscencia (ECL) (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfort, Reino Unido). densidades de bandas se cuantificaron utilizando el software ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/) después de haber sido explorada de la película. El protocolo para la inmunoprecipitación se ha descrito anteriormente en detalle [3], [19].
siRNA transfección
Dos siRNAs fueron diseñados de acuerdo con la secuencia de XB130 como se describe anteriormente [4], [12] . Las células fueron transfectadas con 50 nM agruparon XB130 siRNAs utilizando el reactivo oligofectamine (Invitrogen, San Diego, CA, EE.UU.) de acuerdo con procedimientos estándar descritos anteriormente [4], [20]. El medio que contiene siRNA se reemplazó con medio fresco después de 24 h. El siSTABLE V2 no director siRNA#1 de Dharmacon (Lafayette, CO, EE.UU.) fue utilizado como control negativo. Para los estudios de proteínas, se recogieron las células transfectadas siRNA a las 48 h después de la transfección.
en tiempo real RT-PCR cuantitativa
cebadores específicos de secuencia para RET humana /PTC fueron diseñados por Balogh et al. : 5'-GTCGGGGGGCATTGTCATCT-3 'y 5'-AAGTTCTTCCGAGGGAATTC-3' [21]. El ARN total se extrajo utilizando RNeasy kit (Qiagen, Valencia, CA), y se sintetizó ADNc a partir del ARN total utilizando la transcriptasa inversa MuLV (Applied Biosystems, Carlsbad, CA). RT-PCR cuantitativa se realizó utilizando el kit SYBR Green I Maestro PCR en LightCycler480 (Roche, Indianapolis, IN). Cada ensayo incluyó una curva estándar de cinco diluciones en serie y un control negativo sin molde. Todos los ensayos se realizaron por triplicado. los niveles de expresión génica se normalizaron al nivel de SDHA, limpieza de genes [14].
Análisis de Ciclo Celular
La distribución del ciclo celular se analizó mediante citometría de flujo [22]. En resumen, se recogieron las células en solución salina tamponada con fosfato (PBS), y se fijaron en 70% durante la noche etanol frío. Las células fijadas se lavaron dos veces en PBS y se permeabilizaron con 0,1% Triton X-100 y 2 mg /ml RNasa A en PBS durante 30 min. Posteriormente fueron lavadas una vez en PBS y se tiñeron con 50 g /ml de yoduro de propidio (PI) (Sigma-Aldrich). Las células teñidas se analizaron con el flujo Cytomix FC500 sistema de citometría (Beckman Coulter, Fullerton, CA, EE.UU.).
Análisis de células apoptóticas
Después, las células tratadas con estaurosporina o fasab durante 24 h se cosecharon y se tiñeron con isotiocianato de fluoresceína (FITC) conjugado con Anexina V y PI utilizando el kit de Anexina V (Beckman Coulter, Brea, CA, EE.UU.) siguiendo los protocolos del fabricante y analizado por el flujo Cytomix FC500 sistema de citometría.
análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó mediante la prueba t de Student. Las diferencias se consideraron significativas cuando el valor de p fue inferior a 0,05. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software estadístico JMP versión 5 (SAS Institute Inc., Cary, NC, EE.UU.).
Resultados
Ciclo
XB130 Controles celular progresión de las células del cáncer de
Para explorar el papel de XB130 en el cáncer de la progresión del ciclo celular se realizó desmontables experimentos utilizando XB130 siARN en las células WRO carcinoma folicular de tiroides humana (con RET-PTC reordenamiento) y en células A549 de adenocarcinoma de pulmón humano (una línea celular utilizada comúnmente en estudios de cáncer de pulmón [15]). Dos siRNAs dirigidos a diferentes sitios de XB130 fueron diseñados. Hemos demostrado anteriormente que ambos reducen eficazmente los niveles de proteína XB130 y la fosforilación de Akt en células TPC-1 [12] y otros tipos de células (datos no presentados). La aplicación combinada de estas dos siRNAs reduce la concentración de cada siRNA a la mitad, por lo tanto puede reducir los posibles efectos fuera de la meta. Por lo tanto, hemos utilizado esta estrategia anteriormente [5], [12], y también en los presentes estudios. La citometría de flujo mostró que la baja regulación de la progresión del ciclo celular XB130 parcialmente bloqueada de G
1 a la fase S en células A549 WRO y como se determina mediante citometría de flujo (fig. 1A). Hay significativamente más células en las fases G1 que en cualquiera de la S o G2 /M fase (Fig. 1B). Mientras, transferencias de Western ilustran una reducción significativa de marcadores de proliferación celular, Ki-67 y PCNA, en las células XB130 siRNA tratados (Fig. 1C). La presencia de RET-PTC reordenamiento se confirmó en células TPC-1 (como control positivo) y en células WRO, mientras que es la ausencia en las células A549, como se muestra por RT-PCR (Fig. 1D). Estos resultados indican que XB130 juega un papel importante en la regulación de la proliferación de células cancerosas, ya sea en presencia o ausencia de RET /PTC.
(A y B) El descenso de regulación de XB130 inhibieron G
1- progresión de la fase S en células WRO y A549. Las células transfectadas con siRNA control o XB130 se tiñeron con PI y se analizaron mediante citometría de flujo. La media ± SEM.
n = 6.
*
p Hotel & lt; 0,05 (en comparación con el control de siRNA). (C) la reducción de los niveles de Ki67 y PCNA en células WRO tratada y A549 XB130 siRNA, según lo determinado por el Western Blot.
n = 3. *
p Hotel & lt; 0,05 (en comparación con el grupo tratado con el control de siRNA). (D) La presencia de RET /PTC reordenamiento se confirmó tanto en las células TPC-1 y WRO utilizando RT-PCR. Las células A549 no contienen RET /PTC reordenamiento.
XB130 Controles de supervivencia de las células del cáncer de
Para determinar el papel de XB130 en la supervivencia de las células cancerosas, se trataron células A549 WRO y con XB130 siRNA y citometría de flujo utilizado para cuantificar y para discriminar entre la extrínseca (mediada por receptores de muerte) vía apoptótica, y la intrínseca (mitocondrial mediada) vía apoptótica [23]. El descenso de regulación de la apoptosis inducida XB130 temprano (Anexina V positivo /negativo PI) en las células WRO a las 48 h después de la transfección de siRNA (Fig. 2A). Además, XB130 siRNA mejorada extrínseca (FASAB, clon CH11, 100 ng /ml) e intrínseca (estaurosporina, 200 nM) de apoptosis inducido por el estímulo temprano y apoptosis tardía (Anexina V /PI doble positivo) (Fig. 2A). Por otra parte, en las células A549 cultivadas en el medio que contiene 10% de FBS, la baja regulación de XB130 no mejoró espontánea ni la muerte celular estaurosporina-o inducida por FASAB, incluso a 500 ng /ml de FASAB (Fig. S1A) . Además, el uso combinado de FASAB (500 ng /ml) y IFN-γ (100 ng /ml), una condición que se ha informado anteriormente a la muerte celular inducida en varios otros tipos de células [24], [25], no lo hizo inducir la apoptosis en células A549 (Fig. S1B). Western Blot reveló que la expresión de Fas endógeno en células A549 es incluso mayor que la de las células WRO (Fig. S1c). Sin embargo, bajo condiciones libres de suero, el tratamiento XB130 siRNA aumento de la apoptosis inducida por estaurosporina temprana en las células A549 (Fig. 2B). Estos resultados indican que las células A549 son resistentes tanto a señales apoptóticas mediadas intrínsecamente extrínseca y. Sin embargo, XB130 está implicada en la supervivencia celular en ambas líneas celulares en condiciones experimentales divergentes.
(A) Down-regulación de XB130 mejorada muerte celular espontánea e inducida de las células WRO cultivadas con 10% de FBS. Las células transfectadas con el control o XB130 siRNA fueron tratados con estaurosporina (STS, 200 nM), o anticuerpo Fas (FASAB, CH11 clon, 100 ng /ml) durante 24 h. La apoptosis se determinó por citometría de flujo utilizando PI /anexina V doble tinción. (B) El descenso de regulación de la apoptosis estaurosporina XB130 mejorada inducida en condiciones libres de suero en las células A549. células A549 transfectadas con control o XB130 siRNA se incubaron en medio libre de suero con o sin 200 nM para STS 24 h.
n = 6.
media ± SEM. *
p Hotel & lt; 0,05 (en comparación con el control de siRNA). (C) XB130 puede ser fosforilada por la proteína tirosina quinasas distintas de RET /PTC. La inmunoprecipitación con anticuerpo anti-myc en células HEK293 transfectadas con XB130 myc-etiquetados, junto con RET /PTC3, EGFR, Src, Abl, o erbB2, mostró un aumento en la fosforilación de tirosina XB130 utilizando anticuerpo anti-fosfotirosina.
A pesar de que las células A549 no tienen RET /PTC, otras PTK endógenos podría fosforilar XB130. De acuerdo con ello, hemos demostrado la fosforilación de tirosina de proteínas dramático en células A549, que se puede reducir de manera efectiva por el inhibidor de SRC, PP2 [26]. Para probar si si otras proteínas quinasas podrían fosforilar XB130 en tirosina, las células HEK293, una línea celular comúnmente utilizado para probar la interacción proteína-proteína, se transfectaron con myc-etiquetados XB130 junto con RET /PTC3 como un control, u otro unido a la membrana ( EGFR, erbB2) o citosólica (SRC, ABL) tirosina quinasas. Los lisados celulares se inmunoprecipitaron con anticuerpo anti-myc y se transfirieron con anticuerpo anti-fosfotirosina. Aunque en diferentes niveles, todas las proteínas tirosina quinasas co-expresada con XB130 aumentaron su fosforilación de tirosina (Fig. 2C).
XB130 se une a p85 subunidad de la PI3K y controles Akt actividad en las células del cáncer de
la cascada de señalización de dos conocidos que están implicados en la regulación de la progresión y la supervivencia celular a través de la fosforilación de proteínas son la PI3K /Akt y p38 MAPK vías [7]. Hemos probado los componentes clave de señalización en estas dos vías y encontramos que la fosforilación Src, JNK y ERK no se vio afectada en XB130 siRNA células tratadas (Fig. S2). Por otra parte, la fosforilación de p38 fue incluso aumentó significativamente después del tratamiento XB130 Siran en células WRO (Fig. S2), que excluye más la posibilidad de p38 como una señal de corriente abajo que media relacionada XB130 proliferación celular y la supervivencia.
Hemos demostrado anteriormente que XB130 regular la progresión del ciclo celular de cáncer de tiroides y la supervivencia a través de su interacción con PI3K, que conduce a la activación de Akt. XB130 tiene un motivo YxxM en el N-terminal a partir de la tirosina 54 que se puede unir a cualquiera de los N-o el dominio SH2 C-terminal de p85 de la subunidad de PI3K (Fig. 3A), como se demuestra por GST-fusión de tracción proteínas -Por las ensayos, co-inmunoprecipitación, la competencia de fósforo-péptido, y el uso de XB130 mutantes [12]. Recientemente, la unión entre XB130 y p85 también fue reportado por Yamanaka et al. en LRTF 5-células de la tiroides de rata con MOLDI-TOF MS de ensayo [27]. En ambas células WRO y A549, la unión entre XB130 y la subunidad p85 de PI3K se demostró por co-inmunoprecipitación (Fig. 3A). Akt es una diana aguas abajo de PI3K, y su fosforilación en Ser 473 es un indicador sensible de la actividad de Akt [28]. XB130 siRNA redujo efectivamente XB130 los niveles de proteína; un fenómeno asociado con una disminución de la fosforilación de Akt en ambos WRO y A549 células (Fig. 3B).
(A) Representación esquemática de las estructuras de proteínas de la subunidad p85 XB130 y de PI3K. Las interacciones de XB130 con p85 se detectaron por la co-inmunoprecipitación de células WRO y A549. (B) XB130 siRNA redujo efectivamente los niveles de proteína XB130 y la fosforilación de Akt en las células WRO y A549. células transfectadas siRNA se cosecharon a las 48 h después de la transfección.
n = 5.
*
p Hotel & lt; 0,05 (en comparación con el control de siRNA) guía empresas progresión del ciclo
XB130 controles de las células del cáncer y la supervivencia a través de Akt múltiple de Down Stream. moléculas
p27Kip1 y p21Cip1 /WAF1 están involucrados en la regulación de la progresión del ciclo celular a través de la inhibición de las quinasas dependientes de ciclina CDK1 y CDK2. El inhibidor de la quinasa dependiente de ciclina p27Kip1 translocación nuclear puede causar la interrupción de G1; Akt es capaz de fosforilar p27Kip1, y así bloquear su translocación y la función [29], [30], [31]. El inhibidor de quinasa dependiente de ciclina p21Cip1 /WAF1 puede modular negativamente la progresión del ciclo celular mediante la inhibición de la activación de complejos de ciclina /cdk2 [32]. La activación de Akt también puede fosforilar p21Cip1 /WAF1 y mantenerlo en el citoplasma, lo que puede ser crítico para la supervivencia celular [33]. Después del tratamiento XB130 siRNA, la fosforilación de p27Kip1 y p21Cip1 /WAF1 se redujeron significativamente tanto en las células A549 (WRO y la Fig. 4A y B).
(A y B) El descenso de regulación de XB130 disminución de la fosforilación de p21 y p27, y aumento de la expresión de p21 en las células WRO y A549. Las expresiones de p27 y p53 no fueron afectados por la baja regulación de XB130. (C y D) El descenso de regulación de XB130 disminuyeron fosforilaciones de FOXO3a y GSK3 en células WRO y A549.
n = 4.
*
p
. & Lt; 0,05 (en comparación con el control de siRNA) guía empresas
El descenso de regulación de XB130 también aumentó significativamente el nivel de proteína total de p21Cip1 /WAF1 (Fig. 4A y B). FOXO3a puede unirse a y activar el promotor de p21Cip1 /WAF1, que ha forkhead elementos de unión adyacentes a un elemento de unión SMAD. PI3K /Akt fosforilación mediada FOXO3a puede conducir a su exportación desde el núcleo y, posteriormente, prevenir p21Cip1 /WAF1 expresión de genes [34]. La caída XB130 reduce la fosforilación de FOXO3a (Thr32), sin afectar a los niveles totales FOXO3A (Fig. 4C y D). Esta disminución de la fosforilación de FOXO3a puede ayudar a aumentar la expresión p21Cip1 /WAF1. Entre los miembros de la familia FOXO, FoxO1 se sabe que estimula la transcripción de p27Kip1 [35]. La caída XB130 no pudo cambiar la fosforilación de FoxO1 (Thr24) y FoxO1 (Ser256) (datos no mostrados). Coincidentemente, el tratamiento XB130 siRNA no tuvo efecto sobre los niveles de proteína p27Kip1 en ambas líneas celulares (Fig. 4A y B).
Otro mecanismo por el que Akt puede promover la proliferación de las células es de fosforilar e inactivar GSK3, protegiendo así la ciclina D1 , la mejora de la actividad /CDK6 CDK4, y facilitar la entrada de células en la fase S del ciclo celular [36]. La fosforilación de GSK3 se redujo después del tratamiento XB130 siRNA (Fig. 4C y D). La proteína p53 supresor de tumores es un factor de transcripción que puede inducir o bien la detención del crecimiento o apoptosis. Sus niveles y actividades son controladas principalmente por MDM2, que se puede unir directamente p53 y promover su ubiquitinación y degradación. Akt puede fosforilar MDM2 y aumentar así la degradación de p53 [37]. Down-regulación de XB130 con siRNA, sin embargo, no afectó a los niveles de p53.
Akt puede inhibir la apoptosis a través de múltiples mecanismos. Por ejemplo, Akt es capaz de fosforilar la procaspasa-9, evitando su escisión en la caspasa-9 pro-apoptóticos, que media en la señal intrínseca inició la apoptosis [38]. La inhibición de Akt mejorado la activación inducida por TRAIL de la caspasa-8, que media la señal extrínseca inició la apoptosis [39]. Down-regulación de XB130 aumentó la escisión de la caspasa-8 y caspease-9 en células WRO (Fig. 5A y B). En las células A549, la baja regulación de XB130 disminución del nivel de procaspasa-8 y el aumento de escinde la caspasa-9 (Fig. 5A y B). Activación (escisión) de la caspasa-8 y la caspasa-9 son pasos esenciales para vías extrínsecas e intrínsecas de la muerte celular, respectivamente [23]. Esto puede explicar por qué tanto la muerte celular inducida por la señal extrínseca e intrínseca se ve reforzada por el tratamiento XB130 siRNA.
(A y B) fragmentos escindidos de ambos caspasa-8 y 9 fueron notablemente aumentada por la anulación de abajo en XB130 WRO células. En las células A549, la baja regulación de XB130 disminuyó la procaspasa-8 y el aumento de escinde la caspasa-9.
n = 4.
media ± SEM. *
p
. & Lt; 0,05 (en comparación con el control de siRNA) guía empresas
La fosforilación de p21Cip1 /WAF1 por Akt puede resultar en su acumulación citoplasmática y promueve la supervivencia celular [40]. Factores de transcripción forkhead de la familia pueden desencadenar la apoptosis mediante la inducción de la expresión de genes que son esenciales para la muerte celular, tales como Bim y Fas ligando [41], [42]. Akt puede fosforilar FOXO3a, para bloquear su translocación desde el citoplasma al núcleo [41]. Por lo tanto, la baja regulación de XB130 con siRNA redujo la fosforilación de p21Cip1 /WAF1 (Fig. 4A y B) y FOXO3a (Fig. 4C y D). Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que XB130 está implicado en la regulación de la proliferación celular y la supervivencia a través de múltiples moléculas corriente abajo de PI3K /Akt.
Discusión
XB130 se ha encontrado para ser una sustrato y pareja de unión de RET /PTC, un oncogénico proteína tirosina quinasa [12]. Recientemente, hemos encontrado expresión de XB130 en una variedad de líneas celulares derivadas de tiroides, de pulmón, de esófago, de páncreas y cáncer de colon. En el presente estudio, hemos demostrado que XB130 está implicado en la proliferación y supervivencia de las células del cáncer de tiroides WRO (con RET /PTC mutación) y células de carcinoma de pulmón A549 (sin RET /PTC mutación). Down-regulación de XB130 con también redujo siRNA proliferación y supervivencia de células de cáncer de esófago (datos no mostrados). Estos resultados indican que, además de RET /PTC XB130 puede mediar actividades de otras proteínas tirosina quinasas. De hecho, cuando se co-expresa con XB130, varios receptores tirosina quinasas y tirosina quinasas no receptoras fueron capaces de aumentar significativamente la fosforilación de XB130. Se ha demostrado recientemente que los inhibidores de la familia Src, PP1 o PP2, abolió la fosforilación de tirosina inducida por cAMP de XB130 y su interacción con p85 PI3K [27]. Por lo tanto, es plausible que XB130 podría ser un sustrato de múltiples proteína tirosina quinasas, y que puede mediar el progreso del ciclo celular y la supervivencia en múltiples tipos de células de cáncer.
XB130 se une específicamente subunidad p85 de PI3K, que activan posteriormente Akt. Akt juega un papel esencial en la proliferación celular y la supervivencia. Baja regulación de XB130 con siRNA múltiples moléculas afectadas aguas abajo de Akt. Esto sugiere que XB130 es un importante regulador de /proliferación de células cancerosas relacionadas Akt PI3K y la supervivencia.
En la última década, ha habido un creciente interés en la ruta PI3K /Akt como una de las centrales vías para la proliferación celular y la supervivencia [43], [44], [45]. El
clase Ia-
PI3K son heterodímeros con una subunidad reguladora (p85, p85β o p55δ) y una subunidad catalítica de p110 (p110α, p110β o p110δ) [46]. residuos de fosfotirosina específicos sobre los receptores de factores de crecimiento activados o en proteínas adaptadoras pueden unirse a dominios SH2 de p85, lo que aumenta la actividad enzimática de la subunidad catalítica de p110 y también recluta la enzima a la membrana, donde se cataliza la formación de segundo mensajero lipídico, PIP3, por phosphorylate phosphoatidylinositol-4,5-bifosfato (PIP2) en la posición 3 'en su anillo inositol [47] (Fig. 6). Hemos encontrado un sitio de unión consenso p85 (YxxM) en el N-terminal de XB130 que se puede unir a cualquiera de los N-o el dominio SH2 C-terminal de p85 determinado por pull-down ensayos de proteínas de fusión con GST, y que XB130 es co-inmunoprecipitado con p85 en células de carcinoma de tiroides humano TPC-1. Fosfo-péptido que contiene la secuencia de YxxM XB130 (pero no su forma no fosforilada) redujo la interacción XB130 /p85 y supresión de N-terminal suprimido interacción entre XB130 y p85 [12]. En un estudio reciente, Yamanaka et al. encontrado rata XB130 se asoció con la subunidad p85 de PI3K, y se nombró como PI3KAP. Esta interacción es esencial para mejorar la amplificación de cAMP inducida por la actividad mitogénica de IGF-5 en LRTF células de la tiroides [27]. En el presente estudio, la interacción entre XB130 y p85 se encuentra tanto en las células de la tiroides y cáncer de pulmón. Es importante destacar que la baja regulación de XB130 afectó a muchas proteínas aguas abajo de la vía PI3K /Akt. Estas evidencias indican que XB130 es un importante regulador de la vía PI3K a través de su unión con p85 específico.
La activación de Akt es una característica de los cánceres de tiroides [48], [49], [50]. Los tumores de pulmón también muestran un alto nivel de Akt fosforilada [51]. El tratamiento de células de la tiroides o cáncer de pulmón con inhibidores de PI3K, LY294002 o wortmanina, dio lugar a una disminución del crecimiento o la viabilidad celular [48], [49], [50], [52], [53], [54]. Debido a su papel fundamental en la regulación de la transcripción de genes, la progresión del ciclo celular, y la supervivencia, Akt se ha implicado en muchos tipos de cáncer [47], [55]. Identificación de XB130 como un regulador aguas arriba eficaz de la vía PI3K /Akt puede revelar nuevas dianas terapéuticas para la terapéutica del cáncer.
oncoproteínas puede mejorar el crecimiento del tumor mediante la alteración de la progresión del ciclo celular y /o la modulación de la muerte celular. La regulación por disminución de XB130 con siRNA no sólo la progresión del ciclo celular reducida, pero la muerte celular también se ha mejorado, lo que indica que XB130 es un regulador clave de aguas arriba de ambos procesos celulares. Nuestros resultados indican que XB130 regula la progresión del ciclo celular y la supervivencia a través de múltiples moléculas, incluyendo p21Cip1 /WAF1, p27Kip1, FOXO3a, GSK3, la caspasa 8 y caspasa 9 (Fig. 6). Aunque aún no hemos analizado todos los sustratos conocidos de Akt, nuestros resultados sugieren fuertemente que XB130 ejerce su función de regulación de la proliferación celular y la supervivencia a través de la vía PI3K /Akt. Además, la baja regulación de XB130 no afectó down-stream reguladores FoxO1 y p53 que indica que además de XB130 actividad de Akt relacionadas, estas moléculas se pueden regular además por otros mecanismos de señalización, que a su vez garantiza la especificidad de las funciones relacionadas con XB130.
en resumen, hemos demostrado que XB130 podría regular la proliferación celular y la supervivencia a través de la modulación de la vía PI3K /Akt en células de la tiroides y cáncer de pulmón. XB130 podría ser una novela oncogénica en múltiples tipos de cáncer. La interferencia de ARN se ha convertido en una herramienta poderosa para modular la función de genes tanto
in vitro
y
in vivo
[56], [57]. Expresión de orientación XB130 con esta técnica podría ser una opción atractiva para la terapia del cáncer.
Apoyo a la Información
Figura S1.
Down-regulación de XB130 con siRNA no afectó a la apoptosis en las células A549 en presencia de 10% de FBS. Las células A549 se cultivaron en DMEB más 10% de FBS. (A) El descenso de regulación de XB130 no aumentó la muerte celular espontánea e inducida. las células A549 se trataron con 200 STS nM, o 500 ng /ml FASAB para 24 h. (B) FASAB (500 ng /ml) con IFN-γ (100 ng /ml) no indujo la apoptosis, tal como se analizó por citometría de flujo utilizando PI /anexina V doble tinción.
n =
3. Media ± SEM. (C) La expresión de Fas se confirmaron en el A549 y células WRO por el Western Blot
doi:. 10.1371 /journal.pone.0043646.s001 gratis (TIFF)
figura S2.
niveles de fosforilación de Src y MAPK en las células WRO y A549 transfectadas con siRNA control o XB130. Fosforilaciones de Src, ERK y JNK no fueron afectados por la baja regulación de XB130 en las células WRO y A549, mientras que phosphrylation de p38 fue aumento de las células WRO.
n
= 4. Los análisis se realizaron por el Western Blot. La media ± SEM. *
p Hotel & lt; 0,05 (en comparación con el control de siRNA)
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