Extracto
Los receptores olfativos (OR) se expresan en el epitelio olfatorio, donde se detectan olores, sino también en otros tejidos con funciones adicionales. Algunas RUP incluso sobreexpresa en células tumorales. En este estudio, hemos identificado RUP expresadas en las células tumorales enterocromafinas por RT-PCR, lo que demuestra que las células individuales pueden co-expresar varios RUP. Algunos de los receptores identificados y ya fueron reportados en otros tumores, pero son huérfanas (sin ligando conocido), como es el caso de la mayoría de los cientos de humanos RUP. Por lo tanto, los genes que codifican para las RUP humanos con ligandos conocidos se transfectaron en estas células, que expresan RUP heterólogas funcionales. El
in vitro
estimulación de estas células por los agonistas correspondientes o un perfume promovió la invasión de células de geles de colágeno. El uso de células de cáncer de próstata LNCaP, la estimulación de la PSGR (G específico de próstata acoplado a proteína del receptor), una forma endógena sobreexpresa OR, por β-ionona, su agonista odorante, dio como resultado el mismo cambio fenotípico. También puso de manifiesto la participación de una cinasa PI3 γ vía de señalización dependiente en esta promoción de la invasividad de las células tumorales provocada por la estimulación O. Por último, después de la inoculación subcutánea de células LNCaP en ratones inmunodeficientes GSN, el
in vivo
estimulación de estas células por el agonista β-ionona PSGR mejora de forma significativa aparición de metástasis y la difusión
Visto:. Sanz G , Leray I, Dewaele A, Sobilo J, Lerondel S, Bouet S, et al. (2014) Promoción de la invasividad de las células del cáncer y la metástasis emergencia causada por olfativa del receptor de estimulación. PLoS ONE 9 (1): e85110. doi: 10.1371 /journal.pone.0085110
Editor: Aamir Ahmad, Escuela de Medicina de la Universidad Estatal de Wayne, Estados Unidos de América
Recibido: 24 Abril, 2013; Aceptado: 1 de diciembre de 2013; Publicado: 8 Enero 2014
Derechos de Autor © 2014 Sanz et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el INRA y el CNRS (Centro Nacional de investigación Científica (Francia). Esta investigación se llevó a cabo en el ámbito de la EBAM LEA (el Laboratorio Asociado Europeo (LEA) titulado "solicitudes de pulsos eléctricos de campos en la biología y la medicina"). la proveedores de fondos no tiene función alguna en el diseño del estudio, la recogida y el análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
los receptores olfativos (OR) son receptores acoplados a proteínas G expresadas principalmente en las neuronas sensoriales olfativas (OSN) del epitelio olfativo, donde se detectan y discriminan miríadas de odorantes de acuerdo con un código combinatorio en el que un O se puede activar por diversos odorantes y un odorante puede estimular varios RUP [1], [2]. Por otra parte, las RUP se expresan en tejidos no olfativas [3] - [5] donde pueden jugar papeles adicionales. Ellos gobiernan en particular los espermatozoides quimiotaxis, regular la migración y adhesión de las células musculares, y controlar la secreción de serotonina por las células enterocromafines (CE) [6] - [10]. Varios estudios también reportaron que algunas RUP pueden ser marcadores tumorales, uno de ellos la modificación de
in vitro
la proliferación de células de cáncer de próstata LNCaP [11], [12], [13], [14].
en particular, las células de la CE pueden adquirir un fenotipo tumoral y RUP diferencialmente expresa en función de la evolución carcinoma neuroendocrino [15]. Las células BON, una línea celular humana CE derivado de una metástasis de un carcinoma de páncreas [16], [17], se describen de forma endógena a las RUP expresas [8], que podrían ser marcadores tumorales cuando se sobreexpresa [15]. Dado que las células BON se derivaron de una metástasis, hemos explorado si la activación de las RUP por odorantes agonistas podría tener un papel en la progresión tumoral. Con este fin, se decidió identificar las RUP expresadas en las células BON. Sin embargo no se conocen los agonistas o antagonistas específicos de los odorantes BON células ORS, al igual que para la mayoría de los cientos de humanos RUP identificados. por lo tanto hemos tratado de desarrollar un modelo mediante la transfección de estas células con RUP deorphanized. La expresión heteróloga alcanzado nos ha permitido evaluar el
in vitro
invasión de estas células a la estimulación con el ligando odorante del receptor transfectado. Además, hemos identificado PI3 quinasa γPI3Kγ como un componente de la vía de señalización inducida por la estimulación O y la promoción de invasividad de las células. También se usó un modelo más fisiológico
in vitro
, las células de cáncer de próstata LNCaP que sobreexpresan la PSGR (Específico de la Próstata G receptor acoplado a proteína) fue descrito, una endógeno y deorphanized o considerado como un marcador tumoral, y al que se para inhibir la proliferación de estas células
in vitro
[12]. A continuación se utilizó este modelo
in vivo
para analizar el papel de la estimulación RUP en la progresión tumoral, es decir en la emergencia de la metástasis y la difusión.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
los animales fueron tratados de conformidad con las directrices del gobierno francés respecto a los procedimientos operativos y cuidado de los animales. Protocolo fue aprobado por el concierto de ética para los experimentos con animales llamados "Comité d'Ethique en Expérimentation Animale de l'IRCIV" CEEA-26 (número de protocolo 2.012 a 043).
Transcripción reversa (RT)-PCR, clonación y secuenciación
total de ARN se extrajeron usando el reactivo TRIzol (Invitrogen) y se trató con DNasa I. RT se realizó con el «superíndice First-Strand®, Sistema de Síntesis para RT-PCR» kit (Invitrogen).
Para única célula RT-PCR, las células individuales se recogieron por aspiración en una pipeta de vidrio y RT se realizó utilizando el «Single Cell Superíndice ™ III células ADNc directa del sistema de síntesis» kit (Invitrogen) después de la ruptura celular, la desnaturalización de proteínas y el tratamiento con ADNasa.
Nested PCR se llevó a cabo a partir de 1 l de RT productos y el uso de cebadores degenerados dirigidos o regiones conservadas, o cebadores dirigidos específicamente o identificados con los cebadores degenerados. secuencias de cebadores degenerados fueron amablemente proporcionados por Stephan Bieri (Givaudan, Suiza). La ausencia de ADN genómico se controló utilizando GAPDH humano o cebadores beta-actina en los ARN tratados con DNasa I en ausencia de transcriptasa inversa.
productos de PCR amplificado con cebadores degenerados fueron clonados en el vector pGEM-T (Promega) y se secuenció por Beckman Coulter Genómica. productos de la PCR amplificados con cebadores específicos fueron secuenciados directamente (Beckman Coulter Genómica).
Químicos
Odorantes, DMSO y aceite mineral (M3516) se adquirieron de Sigma-Aldrich, Fluka o Acros Organics en el mayor pureza disponible. AS605240 se adquirió de Euromedex (Selleck, S1410) y gallein de TOCRIS biociencia. Parafina (CellWax) se obtuvo de la LMC, y hemalun, eosina, y Safran de RAL.
vectores de expresión de mamíferos
OR1G1 o OR17-40 secuencias codificadoras se introdujeron en la expresión de mamífero pCMV-Tag3B vector (Stratagene) de una manera que resulta en la fusión de un epítopo de cmyc en el receptor de N-terminal. Los vectores resultantes se denominaron pCMV-TagOR1G1 y pCMV-TagOR17-40.
Cultivo de células y transfección
células BON (subclon nº 7) fueron amablemente proporcionados por el Dr. Courtney M. Townsend (Departamento de Cirugía UTMB, Galveston, TX 77551, EE.UU.) [16], [17]. Ellos se cultivaron en DMEM /F-12 (Ham) sin rojo de fenol (Gibco, Invitrogen Corporation) suplementado con 10% de suero bovino fetal (Hyclone, Perbio) y antibióticos (100 U /ml de penicilina y 100 mg de estreptomicina /ml, Invitrogen) , a 37 ° C en un incubador humidificado con un 5% de CO
2. Las células fueron transfectadas transitoriamente con pCMV-TagOR1G1 o pCMV-TagOR17-40 usando jetPEI ™ (Polyplus de la transfección) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. O la expresión en la superficie celular se verificó mediante microscopía de inmunofluorescencia usando el anti-cmyc-Cy3 anticuerpo monoclonal (C6594, Sigma-Aldrich) en células no permeabilizadas.
células LNCaP se adquirieron de ATCC (clon FGC, No . CRL-1740 ™) en el paso 19, y se cultivaron en medio RPMI 1640 (ATCC, No. 30-2001) suplementado con 10% de suero bovino fetal (ATCC, No. 30-2021), a 37 ° C en un incubador humidificado con un 5% de CO
2.
el calcio de imágenes
BON células LNCaP y se sembraron en una placa de cultivo de 96 pocillos (placa de microtitulación negro, Greiner Bio-One), respectivamente, en una densidad de 10
5 y 0,5 × 10
5 células por pocillo. 24 horas después, las células se cargaron con 2,5 M de éster de acetoximetilo fluo-4 (Molecular Probes), como se describe anteriormente [18]. El calcio de imágenes se realizó utilizando un microscopio de epifluorescencia invertido (Olympus CK40) equipado con una cámara digital (ORCA-ER, Hamamatsu Photonics). Ca
2 + se observaron reponses a 460-490 nm de excitación y de emisión de longitudes de onda ≥ 515 nm. adquisición y análisis de datos se realizó utilizando el software SimplePCI (Hamamatsu, compix). Odorantes y el aceite mineral se prepararon extemporáneamente por una primera dilución en DMSO y diluciones en serie a continuación en una solución de sal de Hanks (Eurobio) suplementado con Hepes 20 mM, pH 7,2. Los estímulos se ensayaron a concentraciones que no provocan respuestas de calcio en las células transfectadas de manera simulada. 1 M de isoproterenol (Sigma-Aldrich) se aplicó como un control positivo. La señal de Ca
2 + se midió como el cambio relativo en la intensidad de fluorescencia? F /F = (F-F
0) /F
0, donde F
0 es el nivel de fluorescencia antes de la estimulación. Los resultados se expresaron como la media del Delta F /F de al menos veinte células.
in vitro
evaluación de tipo geles invasión de células
colágeno I se prepararon como se describe por de Wever [19]. Las células se cultivaron durante 48 horas antes de la siembra como una suspensión de células individuales depositados en la parte superior de los geles de colágeno tipo I. Para estimular RUP, odorantes y el aceite mineral se diluyeron primero en DMSO y luego en la solución de colágeno I o el medio de cultivo. Los efectos de los inhibidores específicos de PI3K (AS605240) y subunidades de proteínas G βγ (gallein) también fueron evaluados mediante su inclusión en el gel de colágeno y medio de cultivo. Para los controles, se añadió DMSO a la misma concentración final que se usa para diluir estas sustancias químicas. La cantidad de DMSO añadido no excedía de 0,2% y no modificó el número de células invasoras en comparación con las pruebas sin DMSO (datos no presentados). 24 horas después de su siembra, las células invasoras que presentan extensiones invasivos en el gel de colágeno y células no invasoras se contaron en 10-15 campos microscópicos seleccionados al azar. Los resultados se expresaron como el porcentaje de células invasoras (índice de invasión). se observó Morerover, citoesqueleto de actina F con faloidina conjugada con rodamina (Invitrogen). Para este propósito, las células se fijaron durante 20 min con paraformaldehído al 3% en PBS a temperatura ambiente, después se permeabilizaron durante 15 minutos con 0,5% Triton X-100 en PBS y se bloquearon durante 30 minutos con 2% de BSA, 1% de glicina en PBS. Las células fueron incubadas con rodamina-faloidina (1:300) en PBS durante 30 min a temperatura ambiente y lavaron extensamente con PBS antes de la observación con un microscopio de epifluorescencia invertido.
Ratones
Nod Scid Gamma ( GSN) ratones machos fueron criados en las instalaciones de alojamiento de animales del Instituto Gustave Roussy, con acceso libre a comida y agua. Las jaulas de plástico estaban conectados a bastidores ventilados controlados. Las jaulas con los animales expuestos al olor β-ionona estaban conectados a una unidad de ventilación separada.
in vivo
de evaluación de la invasión celular y la metástasis
células LNCaP en el paso 25 se inocularon en ratones GSN machos castrados 8 semanas de edad (la castración se realizó dos semanas antes de la inoculación de células). 10
6 células se suspendieron en 75 l de RPMI 1640 más 75 l de Matrigel (BD Biosciences) y se inyectaron con una aguja (26G) en el espacio subcutáneo, a los 2 sitios en cada flanco de los ratones. El odorante β-ionona se diluyó primero en DMSO a una concentración de 100 mM y luego en la mezcla de RPMI + Matrigel a la concentración final de 100 mM. DMSO se añadió también a la misma dosis a la mezcla de RPMI + Matrigel sin olor. Un primer grupo de 5 ratones se inoculó con células LNCaP (en presencia de DMSO) y no recibió tratamiento adicional. Otros cinco ratones fueron inoculados con células LNCaP (en presencia de DMSO) y se sacudió con aceite mineral tres veces al día durante 6 semanas y luego tres veces a la semana hasta el sacrificio. Un tercer grupo de 5 ratones se inoculó con células LNCaP en presencia de β-ionona en DMSO. Estos ratones se cepillaron con 1 mM β-ionona diluido directamente en aceite mineral tres veces al día durante 6 semanas y luego tres veces a la semana hasta el sacrificio. Antes de sacrificio, algunos animales se examinaron primero por tomoscintigraphy (SPECT, NanoSPECT /CT Bioscan) utilizando
99mTc-MDP, un agente de la gammagrafía ósea clásica para obtención de imágenes funcionales del hueso. Este análisis no se realizó en todos los animales, ya que apareció menos información que los rayos X en nuestro estudio. De este modo se exploraron todos los ratones
in vivo fotos: por microtomografía computarizada (μCT) (CT120, General Electric Healthcare) para detectar metástasis en los huesos. 360 X proyecciones de rayos se recogieron en incrementos de 1 ° (100 kVp, 50 mA, 20 ms de exposición) durante unos 5 minutos de tiempo total de exploración. Las imágenes fueron reconstruidas en volúmenes 3D (resolución de 50 micras) en un clúster de reconstrucción usando un algoritmo conebeam carpa-FDK modificado (software de reconstrucción GE). datos en 3D se procesaron utilizando MicroView (GE Healthcare). El análisis de datos se realizó por primera vez en rebanadas individuales (axial, coronal, sagital) y luego en volúmenes reconstruidas y las imágenes MIP (proyección de intensidad máxima). Los animales fueron sacrificados cuando el tamaño del tumor superó 1.500 mm
3. Tras la autopsia, los tumores y tejidos conocidos por albergar metástasis de los tumores de próstata como los ganglios linfáticos, los pulmones y espinas, se tomaron muestras. Hígados y las glándulas de Tyson también se tomaron muestras, algunos hígados que aparece anómala y algunas glándulas de Tyson sorprendentemente grande. Los tejidos se fijaron durante 24 horas en formaldehído y después se almacenó en etanol al 70% a 4 ° C. Para espinas, descalcificación se realizó por una incubación adicional en 10% de EDTA, pH 7,4, a 4 ° C durante una semana. Todas las muestras se deshidrataron en etanol y se incluyeron en parafina. Las secciones seriadas de 5 micras de espesor se prepararon y dewaxed en tolueno y rehidratada en etanol y después con agua. Algunas secciones fueron teñidas con hemalun (RAL), eosina y Safran (tinción HES). La inmunohistoquímica se realizó en otras secciones utilizando anti-PSGR (LS-A6332, Cliniscience), anti-PSA (ab9537, Abcam), o suero de conejo como control negativo, el Vectastain Elite ABC-peroxidasa Kits conejo IgG (Cliniscience), y una DAB revelación (SK-4100, Vector).
resultados
RUP expresadas endógenamente por las células BON
Dado que las células BON muestran una morfología heterogénea, que aislamos subclones homogéneos. O expresión fue investigado por PCR anidada en cDNAs de nueve clones usando cebadores degenerados dirigidos o regiones conservadas, y los productos de PCR de secuenciación. Detectamos OR transcripciones en seis de los clones (Tabla S1). Entre ellos, cinco muestra la expresión de más de una o gen o pseudogen, y el panel de RUP identificados variada a partir del clon a clon. Para confirmar estos resultados, se realizó PCR anidada con cebadores dirigido específicamente a las RUP previamente identificados. En realidad todos los nueve clones expresaron OR transcripciones (Tabla 1) y algunos de ellos (OR7D2, OR1F1) fueron encontrados en la mayoría de los clones. Hay que destacar que OR7A17, OR7D2 y OR2A1 transcripciones también se encuentran en varios tumores (EST enumerados en la base de datos HORDE).
A fin de evaluar que, contrariamente a las OSN, células BON co-expresan varios RUP, analizamos la expresión de O a nivel de una sola célula. Hemos tenido éxito en la amplificación de ADNc correspondientes a GAPDH o β-actina para la mayoría de las células ensayadas, pero o ADNc se podría amplificar sólo para unas pocas células, probablemente debido al bajo nivel de ARNm O a nivel de una sola célula. Nuestros datos muestran que algunas células individuales no BON co-expresan más de una o transcripción (Figura S1a).
expresión funcional heteróloga de RUP en las células BON
Dado que las células BON RUP expresan endógenamente, nos infered que también podían expresar de forma heteróloga RUP funcionales después de la transfección de la OR1G1 y OR17-40 genes. células BON parecían expresar estos receptores heterólogos y para exponerlos en la membrana plasmática (Figura S1b). También encontramos en las células BON la transcripción de REEP1, una proteína que facilita o expresión en OSN [20] (Figura s1c). a continuación, hemos demostrado que los receptores expresados de forma heteróloga son funcionales, la inducción de una respuesta de calcio cuando se estimulan con su respectivo ligando (1-nonanol para OR1G1 y helional para OR17-40 [18], [21]) (Figura 1). La respuesta de calcio inducida por la estimulación del receptor OR17-40 es menos pronunciada que la inducida por la estimulación del receptor OR1G1, pero sigue siendo significativo. Las diferencias entre los niveles o la respuesta puede deberse a diferentes niveles de expresión de los receptores, a una eficiencia de acoplamiento diferente con los endógenos proteínas G de células heterólogas, o para una eficiencia diferente de los ligandos usados. modelo de células transfectadas no respondieron a Nonol ni helional, lo que demuestra que los olores no probados son agonistas de las RUP endógenamente expresadas en las células BON.
BON células fueron transfectadas transitoriamente para expresar OR1G1 o OR17-40 receptores. 72h más tarde, las células se cargaron con fluo-4 y se estimularon con los respectivos ligandos de olor de las RUP transfectadas (1-nonanol y helional). respuestas de calcio debido a la interacción entre el O y su agonista específico odorante se expresan como la variación media de fluorescencia Delta F /F (%). (círculos abiertos) OR1G1 células, 1-nonanol; (Diamantes llenos) OR17-40 células, helional; barras indican la desviación estándar (n = 3). modelo de células transfectadas no respondieron a 1-Nonol ni helional.
O inducida por aumento de la invasión de células
El uso de células que expresan de forma heteróloga BON OR1G1 o OR17-40 receptores, se evaluó la invasividad de colágeno de tipo I geles [19] por estas células, estimulados o no con los agonistas de olor de estos RUP. En ausencia de estimulación odorante, la invasividad de las células BON no fue modificada por la expresión heteróloga de ORs (el índice de invasión se mantiene alrededor del 3%, la Figura 2a). estimulación nonanol aumentó significativamente el índice de invasión de las células que expresan OR1G1-(OR1G1 células) por un factor de 2,7, mientras que la estimulación helional aumentó el índice de invasión de células OR17-40 por un factor de 2,5 (Figura 2a). Hemos observado que el 10
-6 y 10
-7 M de Nonol indujo el mismo nivel de invasión, mientras que 10
-6 M apareció más eficientes en la activación de OR1G1 en los experimentos de imagen de calcio. Esto puede ser debido a la incapacidad de las células BON para alcanzar niveles de invasión más grandes (alrededor de 10% de células invasoras). Nonol y helional no tuvieron un impacto significativo en el control de las células transfectadas de manera simulada. Nonanol no tuvo ningún efecto significativo en las células que expresan OR17-40, ni en las células helional OR1G1 expresar. Además, la vainillina, un antagonista del receptor de OR1G1 [22], fue capaz de contrarrestar específicamente la invasividad inducida por nonanol en OR1G1 células. El índice de invasión de las células de control estimuladas por nonanol solo o por una mezcla de nonanol y la vainillina se mantuvo sin cambios (Figura 2a). extensiones celulares invasoras en geles de colágeno tipo I, la caracterización de las células invasoras, también se observaron después de la immunolabeling cystoskeleton F-actina (Figura 2b). En conjunto, estos resultados demuestran que,
in vitro de búsqueda RUP estimulación por odorantes puede promover específicamente la invasividad de las O-que expresan las células cancerosas.
(a) BON células fueron transfectadas transitoriamente para expresar OR1G1 o OR17-40 receptores o maqueta transfectadas. Las células se sembraron en geles de colágeno tipo I y estimulados por los respectivos ligandos odorizantes de OR1G1 y OR17-40 receptores (nonanol: agonistas OR1G1, vainillina: antagonistas OR1G1, helional: OR17-40 agonistas). células invasoras se contaron 24 horas más tarde. Los resultados se presentan como el índice de invasión. (B) Modificación del citoesqueleto de actina F de las células BON en colágeno de tipo I matrices. F-actina fue revelado por faloidina conjugada con rodamina. extensiones invasoras en geles de colágeno que caracterizan a las células invasoras se indican con flechas. (C) células LNCaP fueron sembradas en geles de colágeno tipo I y estimulados por ligandos PSGR (β-ionona: agonista, α-ionona: antagonista). células invasoras se contaron 24 horas más tarde. Los resultados se presentan como el índice de invasión en relación con las células control sin estimulación odorante. La desviación estándar del control fue de 13,42%. Las estadísticas se realizaron utilizando una prueba de Student de dos colas y las barras indican la desviación estándar (n = 3).
Hemos confirmado este resultado usando las células de cáncer de próstata LNCaP, que expresan endógenamente un OR, el PSGR. Este receptor tiene agonista conocido y odorantes antagonistas [12], respectivamente, la β-ionona y α-ionona. Se utilizó una concentración de 100 mM de β-ionona para estimular las células LNCaP, ya que esta dosis ya se informó para estimular la PSGR [12] y se indujo el mayor invasividad de las células LNCaP en nuestras manos (datos no mostrados). Como se muestra en la figura 2c, la estimulación de PSGR con 100 mM β-ionona aumenta la invasividad de las células LNCaP en un factor de 2,75 y este efecto fue totalmente anulada por el antagonista α-ionona. Sola, este antagonista no tuvo efecto sobre LNCaP nivel células invasión. Si bien no hay control negativo con células LNCaP que no expresar PSGR, el efecto farmacológico drástica de α-ionona argumenta a favor de un efecto específico de β-ionona través de la estimulación PSGR. La exclusión de un efecto químico específico no de β-ionona en las células LNCaP que inducen la invasividad también es apoyado por el hecho de que α-ionona, que es muy similar a la beta-ionona y se aplicó a dos veces la dosis β-ionona, no indujo la invasividad de las células LNCaP. Por otra parte, hemos probado el efecto de 100 mM β-ionona en la invasividad de las células PC3, otras células de cáncer de próstata que no expresan el PSGR [12], y no se observó un aumento de la capacidad de invasión de estas células. Los resultados experimentales se detallan a continuación también apoyan la idea de que la invasividad LNCaP se puede mejorar mediante la estimulación PSGR.
Participación de PI3K en la invasividad celular inducida por RUP
activación de PI3K a través de GPCRs pueden estar involucrados en la transformación de funciones tales como la invasión [23], y una diafonía entre la señalización odorante y PI3K fue descrito en las neuronas sensoriales olfativas [24], [25]. por tanto, se exploró si PI3K podría ser parte de la ruta de señalización que se desencadena por la activación odorante de ORs y promueve la invasividad de las células. En primer lugar hemos demostrado la expresión de PI3K en células BON y LNCaP por lisados crudos inmunotransferencia con un anticuerpo dirigido PI3K (datos no mostrados). a continuación, se evaluó la capacidad de invasión de las células que expresan BON hetorologously OR1G1 o de células LNCaP a la estimulación con agonistas de OR1G1 o PSGR, en presencia de un inhibidor específico de PI3K (AS605240). 10
-6m de AS605240 han sido reportados para inhibir completamente PI3K [26]. En cuanto a las células BON, utilizando 10
-6m y 10
-7M de AS605240, encontramos un tamaño similar (aproximadamente 80%), pero no la reducción total de la invasividad celular promovida por OR1G1 a la estimulación Nonol (Figura 3), lo que indica que el efecto máximo se observa a 10
-7M de AS605240. Por lo tanto, PI3K parece jugar un papel importante en la mediación de la invasividad de células BON promovido por el o la estimulación por su olor específico, aunque otras vías de señalización también pueden estar implicados. Implicación de PI3K se confirmó para las células LNCaP (Figura 3). Sin embargo, contrariamente a las células BON, PI3K AS605240 inhibidor indujo una reducción de la invasividad LNCaP incluso en ausencia de estimulación PSGR. Por lo tanto PI3K también parece estar implicado en la invasión basal de células LNCaP. Además, dado que PI3K puede ser activado por el G
βγ subunidad de las proteínas G a través de la activación de GPCR [27], se utilizó gallein, un G
βγ subunidades inhibidor que interfiere con la interacción de G
βγ subunidades con PI3K [28], y demostró que contrarresta el aumento de la invasividad de las células LNCaP inducida por la estimulación PSGR (Figura 3). Este resultado también es compatible con la participación de PI3K en la invasividad de las células tumorales inducida por la estimulación OR.
células que expresan de forma heteróloga BON el receptor OR1G1 se sembraron en geles de colágeno tipo I y se estimularon por nonanol (agonista OR1G1) en el presencia de un inhibidor de PI3K específico (AS605240). células LNCaP fueron sembradas en geles de colágeno tipo I y se estimularon por β-ionona (agonista PSGR) en presencia de un inhibidor específico de PI3K (AS605240) o un inhibidor de subunidades βγ de las proteínas G (gallein). células invasoras se contaron 24 horas más tarde. Los resultados se presentan como el índice de invasión en relación con la de las células control (sin olor ni AS605240 ni gallein). La desviación estándar del control fue de 4,74% para las células BON de control y de 13,86% para las células de control LNCaP. Las estadísticas se realizaron utilizando una prueba de Student de dos colas y las barras indican la desviación estándar (n = 3).
o la mejora inducida por la activación de la invasividad de las células del cáncer de
in vivo
Desde
in vitro
mejora de la invasividad de las células mediante la activación RUP sugiere un posible papel de (al menos algunos) RUP en la aparición de metástasis
in vivo
, se inocularon células tumorales de próstata LNCaP por vía subcutánea en inmunodeficiente NSG ratones (NOD SCID gamma). Animales se dejaron sin tratar, o diariamente cepillado sobre la piel con agonistas PSGR β-ionona diluido en aceite mineral (un excipiente oleoso necesaria para aplicar los odorantes lipófilos sobre la piel ratones), o con aceite mineral solo como control. El tamaño del tumor se midió y metástasis fueron detectados por
in vivo
de imagen y por inmunohistoquímica post mortem usando anticuerpos dirigidos PSGR o PSA (antígeno prostático específico) (ejemplos de la columna vertebral y las metástasis pulmonares se muestran en la Figura 4). se detectó expresión PSGR en tumores primarios y en todas las metástasis (ver otros ejemplos en la Figura S2), lo que confirma que este receptor estaba presente y posiblemente activado durante nuestros experimentos. Sin tratamiento, metástasis surgieron principalmente en los ganglios inguinales y occasionnally en la columna vertebral y el hígado (Figura 4a). Las metástasis localizadas en los ganglios inguinales estaban bien desarrollados, mientras que los ubicados en la columna vertebral y el hígado fueron micrometástasis. El número de metástasis aumento después del tratamiento con aceite mineral y su localización era más diversa en presencia de β-ionona. En realidad, las metástasis aparecieron en los pulmones y las glándulas de Tyson sólo para los ratones tratados con β-ionona (3 de cada 5 animales de glándulas de Tyson y 2 de cada 5 animales para los pulmones). Por otra parte, las metástasis localizadas en glándulas de Tyson estaban muy desarrollados, con tamaños cercanos 1.000 mm
3. En los pulmones, solamente se detectaron micrometástasis, al igual que en la columna vertebral y el hígado. Dado que los ratones no fueron sacrificados al mismo tiempo, pero dependiendo del tamaño del tumor, se muestra en las Figuras 5b y 5c de la evolución con el tiempo del número de metástasis de acuerdo con el número de ratones sacrificados y el número medio de metástasis por ratón en el momento de sacrificio para cada grupo experimental. Se observó que los ratones tratados con aceite mineral o β-ionona tuvieron que ser sacrificados antes, debido al crecimiento del tumor más rápido, y que muestran un aumento significativo en el número de metástasis en comparación con los ratones no tratados. Paralelamente también se observó que los tumores desarrollados en el 85% de los sitios inoculados en ratones no tratados, mientras que eran menos numerosos (50%) en los ratones tratados con aceite mineral o β-ionona.
Las metástasis se indican con flechas. En la columna, se observaron metástasis utilizando microtomografía computarizada (Proyección de intensidad máxima) y confirmaron post-mortem mediante tinción con HES y inmunohistología utilizando anticuerpos anti-PSA (antígeno específico de la próstata) y anticuerpos anti-PSGR (se presenta sólo una metástasis). En los pulmones, las metástasis se caracterizaron por HES y tinción inmunohistología utilizando anticuerpos anti-PSA y anti-PSGR
(a) El número de metástasis observadas en varios tejidos después de los ratones se sacrifican (blanco:. El control sin tratar ratones, grises: ratones tratados con aceite mineral, negras: ratones tratados con 1 mM de β-ionona en aceite mineral). (B) Número acumulado de metástasis, independientemente de su ubicación, como una función del tiempo transcurrido entre las células LNCaP de la inoculación y ratones sacrificar (blanco: los ratones de control no tratados, gris: ratones tratados con aceite mineral, negras: ratones tratados con β 1 mM ionona en aceite mineral). Los ratones se sacrificaron cuando el tamaño del tumor superó 1.500 mm
3. El número de ratones sacrificados se indica entre paréntesis para cada punto de tiempo y cada grupo de ratones. (C) Curvas de informes las proporciones de la cantidad de metástasis por el número de ratones sacrificados como una función del tiempo (negro La: ratones de control no tratados, gris: ratones tratados con aceite mineral, negras: ratones tratados con 1 mM β-ionona en aceite mineral).
los resultados con el aceite mineral eran intrigantes. Desde RUP pueden ser activados por diferentes moléculas [2], [12], [18], se investigó si el aceite mineral puede estimular la PSGR en
in vitro
ensayos de invasión celular y los experimentos de imagen de calcio. El aceite mineral aumentó tanto la invasividad y la respuesta cálcica de células LNCaP y el PSGR antagonistas α-ionona abrogadas estos efectos (Figura 6 a, b). Estos resultados demuestran que un componente de aceite mineral estimula las células LNCaP a través de la PSGR, promoviendo su invasividad. Además, las células LNCaP invasividad inducida por aceite mineral fue inhibida por PI3K o G
inhibidores βγ subunidades (respectivamente AS605240 y gallein), demostrando que la PI3K está involucrada en este proceso, ya que está implicada en la invasividad celular inducida por β-ionona. Sin embargo, incluso si el aceite mineral mejorada metástasis aparición, aparición de metástasis fue incluso más pronunciada en presencia de β-ionona, dando como resultado las células se extienda a los pulmones y las glándulas de Tyson que se produjeron sólo en presencia de β-ionona. Todos estos datos convergen para demostrar que la estimulación de un quirófano, el PSGR, puede contribuir a la diseminación de las células tumorales de próstata y en la generación de metástasis.
(a) células LNCaP fueron sembradas en geles de colágeno tipo I y se estimularon por aceite mineral o aceite mineral mezclado con 10
-4m β-ionona, 2,10
-4m α-ionona, 10
-7M AS605240 o 10
-5m gallein. El aceite mineral se diluyó primero 1/4 en DMSO (aceite mineral no fue totalmente solubilizado a esta dosis, pero esto nos permitió esperamos una muy grande solubilización de los componentes de aceite mineral) y después la solución se diluyó 1/1000 en el medio de cultivo o gel de colágeno I. células invasoras se contaron 24 horas más tarde. Los resultados se presentan como el índice de invasión en relación con la de las células control (sólo con el DMSO). Las barras indican la desviación estándar. La desviación estándar del control fue de 3,67%.