novela de diagnóstico y terapéutica de marcador en Colon
Extracto
Además de los cambios genéticos, la aparición de alteraciones epigenéticas se asocia con la acumulación de tanto genéticos y eventos epigenéticos que promueven el desarrollo y la progresión del cáncer humano. Anteriormente, se informó de un conjunto de genes candidatos que forman parte de la emergente "metiloma cáncer". En el presente estudio, primero a prueba 23 genes candidatos para la metilación del promotor en un pequeño número de tejidos tumorales de colon primario y controles. Sobre la base de estos resultados, se examinó a continuación la frecuencia de metilación de
oncostatina M-receptor β
(
OSMR
) en un mayor número de muestras de tejidos y de ADN en heces recogidas de pacientes de cáncer de colon y los controles. Hemos encontrado que
OSMR
fue metilado con frecuencia en tejidos de cáncer de colon primario (80%, 80/100), pero no en tejidos normales (4%, 4/100). La metilación de
OSMR
también fue detectado en ADN en heces de pacientes con cáncer colorrectal (38%, 26/69) (punto de corte en TaqMan-MSP, 4). La detección de otros marcadores metilados en ADN en heces mejoró la sensibilidad con poco efecto sobre la especificidad. Promotor de la metilación mediada por silenciamiento de
OSMR Hoteles en líneas celulares y células CRC con baja
OSMR
expresión eran resistentes a la inhibición del crecimiento por la oncostatina M. Nuestros datos proporcionan un fundamento biológico para el silenciamiento de
OSMR
en la progresión del cáncer de colon y resaltar una nueva diana terapéutica en esta enfermedad. Por otra parte, la detección y cuantificación de
OSMR
promotor de la metilación en el ADN fecal es un biomarcador de diagnóstico altamente específico para la CRC
Visto:. Kim MS, Louwagie J, Carvalho B, Terhaar sive Droste JS, Parque HL, Chae YK, et al. (2009) Promotor metilación del ADN del receptor ß-
oncostatina M
como novedosos de diagnóstico y terapéutica de marcador de cáncer de colon. PLoS ONE 4 (8): e6555. doi: 10.1371 /journal.pone.0006555
Editor: Jonathan Weitzman, Université Paris-Diderot, París 7, Francia |
Recibido: 6 Febrero, 2009; Aceptado: 30 de junio de 2009; Publicado: 7 Agosto 2009
Derechos de Autor © 2009 Kim et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por el Instituto Nacional del cáncer (U01-CA84986) y Ciencias OncoMethylome, SA, y el holandés Cancer Society (número de proyecto RUG desde 2004 hasta 3161). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. En virtud de un acuerdo de licencia entre OncoMethylome Ciencias, SA y la Universidad Johns Hopkins, el Dr. Sidransky tiene derecho a una cuota de regalías recibidas por la Universidad en las ventas de los productos descritos en este artículo. El Dr. Sidransky posee OncoMethylome Ciencias, SA de valores, que está sujeto a ciertas restricciones en virtud de la política universitaria. El Dr. Sidransky es un consultor pagado a las Ciencias OncoMethylome, SA y es un miembro pagado del Consejo Asesor Científico de la compañía. La vigencia de esta transacción está siendo administrado por la Universidad Johns Hopkins, de acuerdo con su conflicto de intereses políticas.
Introducción
El cáncer colorrectal (CCR) es uno de los cánceres más comunes entre los hombres y las mujeres y las cuentas para el 10% de todos los nuevos casos de cáncer y muertes por cáncer cada año [1]. La tasa de supervivencia global a 5 años de cáncer de colon se ha incrementado durante los últimos 20 años debido a la detección temprana de la mayor cantidad de evaluaciones. A pesar de muchos avances, todavía se necesita un conocimiento más avanzado de la patogénesis molecular de CRC o factores ambientales clave /de la dieta en el desarrollo de CCR. Por otra parte, la búsqueda de potenciales marcadores de diagnóstico y dianas terapéuticas para CRC ayudar en la detección y tratamiento del cáncer de colon temprano. surgen la mayoría de los CRC a partir de precursores adenomatosos, y la acumulación de mutaciones de ganancia de función en los proto-oncogenes y mutaciones de pérdida de función en los genes supresores de tumores (ETG) conduce a la progresión de las lesiones adenomatosos a carcinoma [2], [3], [4].
Además de las alteraciones genéticas que implican mutaciones de oncogenes y ETG, la progresión cancerígena de neoplasia benigna de adenocarcinoma puede ocurrir a través de cambios epigenéticos en los promotores de genes [5]. la expresión génica aberrante es una característica de los cánceres humanos, y los cambios en el estado de metilación del ADN puede tener profundos efectos en la expresión de genes. display ETG tanto la inactivación genética y epigenética en tumores humanos, y el silenciamiento transcripcional de ETG ha establecido hipermetilación como un mecanismo común para la pérdida de la función TSG en los cánceres humanos [6], incluyendo el cáncer de colon [7], [8]. Por lo tanto, el conocimiento de los patrones de metilación en todo el genoma puede ayudar a identificar las ETG clave inactivadas durante la formación de tumores [9], [10], [11].
Anteriormente, se informó de un conjunto de genes candidatos que comprenden parte de la emergente "metiloma cáncer" mediante el uso de un nuevo dato algoritmo estructura del promotor y de microarrays generados a partir de líneas celulares de cáncer de 22 forma derivados 5 principales tipos de cáncer [12]. En este estudio anterior, hemos examinado recientemente identificado los genes metilados específicos del cáncer en un panel de 300 tumores primarios que representan 13 tipos de cáncer. Sobre la base de los datos, el número de genes metilados conocidos específicos de cáncer se incrementó en aproximadamente un 40%.
En el presente estudio, hemos vuelto a examinar el estado de metilación de los genes metilados específicos del cáncer en un mayor número de ADN tejido y las heces de pacientes con cáncer de colon, así como pacientes sin cáncer. Hemos encontrado que
oncostatina M del receptor β-gratis (
OSMR
) y
β-1,4-galactosiltransferasa-1 gratis (
B4GALT
) eran altamente metilados en los tejidos CRC primarias, pero rara vez en la correspondiente mucosa normal adyacente ni en tejidos de colon normales no malignas. La metilación de estos genes también se detectó en ADN en heces de pacientes con cáncer de colon, pero generalmente ausente de pacientes sin cáncer. Por otra parte,
OSMR
y
B4GALT
la expresión de ARNm en tejidos de cáncer de colon fue significativamente las reguladas en comparación con los tejidos normales. Los estudios funcionales revelaron un papel supresor de
OSMR Hoteles en la progresión del cáncer de colon. Por lo tanto,
OSMR
metilación es biológicamente relevante y puede ser detectado con frecuencia en los tumores primarios de CRC e igualó de ADN en heces.
Resultados
Análisis de microarrays en tres líneas celulares de cáncer de colon humano ( HCT116, HT-29 y DLD1) identificaron 52 genes blancos potenciales basadas en la reactivación después del tratamiento con 5-aza-dC [12]. De estos 52 genes,
sirtuinas 2 gratis (
SIRT2
) fue contado dos veces en nuestra lista de genes candidatos, ya que tiene dos números de identificación de genes diferentes (NM_012237 y NM_030593) en la base de datos NCBI. Además,
metiltransferasa-metiltransferasa de ADN O6-gratis (
MGMT
) se informó previamente a puerto específico del cáncer promotor de la metilación en múltiples tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de colon [9], por lo que excluye
MGMT
de nuestro análisis adicional (52 -2 = 50).
secretada frizzled proteína relacionada con 4 gratis (
SFRP4
) había informado anteriormente a ser metilado en el cáncer de colon [16], [17] y fue incluido como un control positivo para la metilación de genes en nuestro estudio.
neurotrofina tirosina quinasa del receptor de tipo 2 gratis (
NTRK2
) y
tipo uroquinasa activador del plasminógeno gratis (
PLAU
) también se incluyeron porque no hay informes sobre la metilación de los dos genes en el cáncer de colon se han publicado todavía. lo tanto, examinar el estado de metilación de un total de 50 genes mediante secuenciación con bisulfito o C-MSP en líneas celulares de cáncer de colon (HCT116, DLD1, RKO y SW480) (Figura S1). Como resultado, hemos encontrado 23 genes a ser metilado en más de una línea celular (Tabla 1). La metilación en los otros 27 genes no se detectó en ninguna de las líneas celulares ensayadas.
Para identificar los genes que albergan específica por cáncer de metilación del promotor, se analizó el estado de metilación de los 23 genes en cinco o diez pares de emparejado CRC primaria (PT) y los correspondientes tejidos normales del colon (PN). También se incluyeron los tejidos normales mucosa del colon de pacientes sin cáncer (NN) para comparar la especificidad de metilación entre los pacientes con cáncer y no cancerosas. Se excluyeron los genes que albergaban metilación en NN con frecuencias superiores a 30%. Como resultado, se encontró que los
3'-5'-fosfoadenosina phosphosulfate sintasa 2 gratis (
PAPSS2
),
gen γ-tubulina 2 gratis (
TUBG2
),
NTRK2
,
B4GALT1
, y
OSMR
, así como
SFRP4
metilación específica del cáncer albergado con frecuencias altas (& gt; 30 %) (Tabla 2). Todos los 6 de estos genes no albergaba metilación en todos los NN probado, y las diferencias en NN
vs.
PT y metilación
vs.
Casos no metilación fueron estadísticamente significativas. Los resultados representativos de C-MSP, bisulfito-secuenciación, y COBRA en líneas de células y tejidos se muestran en la Figura 1A y la Figura S2.
A, estado de metilación de cada gen se examinó en las líneas celulares de CRC y tejidos por C -MSP después de la PCR con cebadores específicos de metilación. Los productos de PCR se corrieron en geles de agarosa al 4% pre-teñidos con bromuro de etidio.
In vitro
metilado, se utilizó DNA de linfocitos humano normal tratado con bisulfito (NL) como un control positivo para PCR, y se utilizó agua destilada (DW) como control negativo de la PCR.
β-actina
se utilizó para confirmar la integridad del ADN.
SLC39A4
y
SLC9A3R1
se metilado tanto en líneas de células y tejidos, pero
GANAB
,
PLAU
y
UBE3A
no fuera . Los otros 5 genes se metilado en una de las tres líneas de células de la prueba, y sólo metilados en los tejidos de CRC (PT). PN, emparejado tejidos normales del colon de pacientes con cáncer de colon; PT, emparejado CRC; NN, el epitelio de colon normal a partir de pacientes sin cáncer. C-MSP resultados de
OSMR Hoteles en líneas celulares y tejidos de CRC, se mostró en un informe anterior [12]. B, gráficos de dispersión de los valores de metilación de genes candidatos en seis tejidos y líneas celulares (CL). Los valores globales de metilación (valores de metilación TaqMan, TaqMeth V) y la especificidad óptima /sensibilidad en los límites óptimos calculados a partir de análisis ROC se muestran en la Tabla 3. Las flechas indican los valores óptimos de corte para cada gen. No hay casos de NN muestran TaqMeth V durante los óptimos valores de corte del
B4GALT1
y
OSMR
. HEK293, una línea de células no tumorigénicas, albergaba un alto nivel de
B4GALT1
metilación (TaqMeth V, 101.12), pero
OSMR
metilación no se detectó en la línea celular (TaqMeth V, 0.00 ). *, Muestras con una proporción igual a cero no pudieron reflejarse correctamente en una escala logarítmica, por lo que se presentan aquí como 0,1. Todos los ensayos se realizaron en formato duplicado, y los experimentos se repitieron dos veces. Los datos mostraron resultados reproducibles y concordantes, por triplicado. TaqMeth V se describe en Materiales y Métodos. C, los niveles de metilación cuantitativos de
B4GALT1
y
OSMR
en los tejidos primarios de colon. Diagrama de dispersión de
B4GALT1
y
OSMR
la metilación del promotor. Las flechas indican los puntos de corte óptimos para cada gen (3.877 para
B4GALT1 Opiniones y 22.01 para
OSMR
).
Para estudiar la metilación del promotor de éstos 6 genes por análisis en tiempo real TaqMan-MSP, hemos diseñado cebadores y sondas dirigidas específicamente las islas CpG de cada gen (Figura S3). Hemos aumentado el número de muestras a más de 25 pares de CRC primaria (PT) y los correspondientes tejidos normales del colon (PN), y 13 tejidos de la mucosa del colon normales de pacientes sin cáncer (NN). La distribución de los valores de metilación para cada gen se muestra en la Figura 1B. Debido a los parches clonales heterogéneos conocidos expandirse más allá de los límites del tumor, también se observa con frecuencia un bajo nivel de metilación en el PN. Los valores globales de metilación (valores de metilación TaqMan, TaqMeth V) se muestran en la Tabla 3.
B4GALT1
y
OSMR
albergaron los niveles más altos de metilación global de PT que los de PN y NN, y el las diferencias fueron significativas para ambos genes entre PT y PN (
P & lt; 0,001
) y entre PT y NN (
P & lt; 0,001
). Cuando los valores de metilación se compararon dentro de los distintos pares de muestras PN y PT, significativamente más altos niveles de metilación de
PAPSS2 TUBG2
,
NTRK2
, y
SFRP4
se encontró en el 60% ( 18/30), 50% (15/30), 30% (9/30) y 36% (11/30), respectivamente, en PN que en las muestras tumorales correspondientes (PT). los niveles de metilación más altos de
B4GALT1 Hoteles en muestras PN se encontró sólo en 4 casos (13,3%, 4/30), y la metilación de
OSMR
no se encontró en ninguna de las normales emparejados (0 %, 0/25).
la metilación de los 6 genes en el tejido mostró característicos de la curva ROC) perfiles altamente discriminativo receptor-operador (, distinguiendo claramente CRC (PT) de la mucosa del colon normal (NN) (
P & lt; 0,001
) (Figura S4A). AUROC (área bajo ROC) era más de 0,76 en todos los genes de la prueba. Con el fin de maximizar la sensibilidad y especificidad, los puntos de corte óptimos para los 6 genes se calcularon a partir del análisis ROC (PT
vs
. NN) y se muestran en la Tabla 3. En cortes fijados para especificidad óptima de 90% o más, la sensibilidad de cada gen en PT fue más del 70%. No hay casos de NN muestran TaqMeth V durante los óptimos valores de corte del
B4GALT1
y
OSMR gratis (100% de especificidad). La sensibilidad de
B4GALT1
y
OSMR
fueron del 83% (25/30) y 80% (20/25), respectivamente. Estos resultados indican que
B4GALT1
y
OSMR
puerto específico del cáncer de metilación en el CCR con alta frecuencia. Por lo tanto, nos centramos en
B4GALT1
y
OSMR
en estudio.
Hemos examinado el estado de metilación de
B4GALT1
y
OSMR
en 100 nuevos pares de CRC (PT) y los tejidos normales (PN) correspondientes por análisis TaqMan-MSP (Fig. 1C). El TaqMeth V en PT varió de 0 a 370,70 (valor de la mediana 3,70) para
B4GALT1
y de 0 a 749,27 (valor medio 59,24) para
OSMR
. El valor de PN varió de 0 a 9,70 (valor de la mediana 0,26) para
B4GALT1
y 190.68 (valor de la mediana 1,54) para
OSMR
. Los niveles de metilación global de
B4GALT1
y
OSMR
detectado en PT (22,33 ± 48,69 para
B4GALT1 Opiniones y 116.83 ± 151.52 para
OSMR
, media ± SD, n = 100) fueron también significativamente superiores a los de PN (0,90 ± 1,37 para
B4GALT1 Opiniones y 6,49 ± 21,52 para
OSMR
, media ± dE, n = 100) (
P & lt; 0,001
). En los puntos de corte óptimos (valores, 3,87 para
B4GALT1 Opiniones y 22.01 para
OSMR
) calculados en el análisis ROC (PT
vs
. PN) (Figura S4B) , la especificidad de los dos genes era más del 96%. La sensibilidad de
B4GALT1
y
OSMR
fueron de 49% (49/100) y el 80% (80/100), respectivamente. Tomados en conjunto,
B4GALT1
y
OSMR
fueron metilado con frecuencia en los tejidos primarios CRC, pero mostrada niveles ausentes o bajos de metilación en los tejidos normales correspondientes.
A continuación, se realizó un ciego análisis de análisis de metilación de genes en el ADN de heces de pacientes con o sin cáncer de colon. El estado clínico de los pacientes no se reveló hasta que se completó el análisis. También se examinó la hipermetilación de
SFRP1
como control positivo para la detección de la metilación de genes en las heces de ADN [18]. Los resultados del análisis ROC en el ADN en heces se muestran en la Figura 2. La Tabla 4 muestra la sensibilidad /especificidad de cada gen de cáncer de colon detectados en muestras de ADN de heces.
SFRP1
metilación no se detectó en los pacientes con cáncer de colon por vía endoscópica normal (0%, 0/15), y no se encontró en el 55% (11/20) de los pacientes con CRC, en el valor de corte óptimo calculado a partir de el análisis ROC. La metilación de
B4GALT1
y
OSMR
se detectó en el 64% (9/14) y 80% (16/20) de las muestras de ADN de heces de pacientes con CRC, respectivamente. Cuando la metilación de
SFRP1
y
OSMR
se combinó, la sensibilidad fue del 60% (12/20), y la especificidad fue del 100% (0/15). La discriminación entre pacientes sin cáncer y pacientes con CRC por
SFRP1
o
OSMR
metilación fue estadísticamente significativa (
P & lt; 0,01
).
Una prueba fue cegada realizado para el análisis de metilación de genes en el ADN de heces de pacientes con o sin cáncer de colon.
SFRP1
se incluyó para comparar la frecuencia de metilación de un gen metilado específico del cáncer conocido. La sensibilidad /especificidad sobre la base de los límites óptimos calculados a partir de análisis ROC se muestra en la Tabla 4.
OSMR
metilación fue probado de manera ciega en un conjunto más independiente de heces muestras (no se superponen con las muestras de la Tabla 4). ADN en las heces de los sujetos control sanos que no tenían abnormalties visuales en la colonoscopia fueron incluidos en este estudio. La sensibilidad de
OSMR
metilación en pacientes con CCR fue del 38% (26/69) y la especificidad fue del 95% (77/81) (Tabla 5). La diferencia entre pacientes con CRC y los controles normales fue estadísticamente muy significativa (
P & lt; 0,001
). Además, se detectó
OSMR
metilación en el 56% (15/27) y el 44% de las muestras (8/18) de ADN en heces por CCR en estadio II y III, los pacientes, respectivamente. Por otra parte, 34 de los 41 casos (83%) de ADN en heces de pacientes de control sin confundir CRC eran completamente negativas para
OSMR
metilación. Otros parámetros clínicos en los controles de confusión tales como la diverticulosis, hemorroides, pólipos y no se asociaron significativamente con
OSMR
estado de metilación en las heces (datos no mostrados).
Para examinar los niveles de transcripción de
B4GALT1
y
OSMR
, se realizó RT-PCR o RT-PCR análisis en tiempo real (Fig. 3) utilizando ADNc preparadas a partir de líneas celulares de CRC (HCT116, HT29, DLD-1 , RKO y SW480) y una línea de células no tumorigénicas, HEK293.
se observó OSMR
expresión sólo en las células en las que la metilación de
OSMR
no se ha encontrado (HCT116 y HEK293). Aumento de
OSMR
expresión mediante tratamiento con 5-aza-DC se informó anteriormente [12], lo que indica que la expresión de
OSMR
se correlaciona fuertemente con la metilación del promotor. Se detectó la expresión basal de
B4GALT1
en todas las líneas celulares ensayadas, y todas estas líneas celulares también albergaba metilación de
B4GALT1
. Sin embargo,
B4GALT1
se aumentó aún más por 5-aza-DC (Figura S5A), lo que indica que su expresión fue suprimida por la metilación del promotor, al menos parcialmente.
A, Expresión de
B4GALT1 Opiniones y
OSMR Hoteles en líneas celulares se examinó mediante análisis de RT-PCR. La metilación de
B4GALT1
en las líneas celulares se examinó por C-MSP o TaqMan-MSP. β-actina se utilizó como control de carga. M, la metilación; U, no metilación. B y C, en tiempo real RT-PCR se realizó en cinco pares (a - e) de lo normal (PN) y cDNA tumoral preparadas a partir de CRC pacientes (PT) (
la izquierda). La expresión de
B4GALT1 gratis (B) y
OSMR gratis (C) también se compararon entre los pacientes con cáncer de colon (T) o sin cáncer (NN) (
derecha). expresión relativa (veces) se calculó mediante la comparación de las proporciones de la expresión de ARNm de
B4GALT1
y
OSMR
a un gen de control interno, GAPDH. Los experimentos se realizaron por duplicado, y los valores indican las medias ± SD. *,
P & lt; 0,05
. Los experimentos se realizaron por duplicado, y los valores indican las medias ± SD. *,
P. & Lt; 0,05
A continuación, realizó en tiempo real RT-PCR en ADNc preparada a partir del tumor (PT) y los correspondientes tejidos normales (PN) de cinco cáncer de colon individuo pacientes (emparejado cDNA). En 3 de cada 5 casos de tumores,
OSMR
fue significativamente las reguladas (Fig. 3C,
la izquierda). La expresión de
B4GALT1
y
OSMR
en el tumor era de tres y cuatro veces menor que en el tejido normal (NN), respectivamente (Fig. 3B y C,
derecha) . Por tinción inmunohistoquímica de una micromatriz de colon normal y cáncer de tejidos con un anticuerpo anti-OSMR, detectamos expresión fuerte de
OSMR
en todos los tejidos no malignos normales (NN) y adyacente mucosa de colon normal (PN) de dos puntos los pacientes con cáncer (Fig. 4 y en la Tabla 6). Sin embargo,
OSMR
apenas se detectó en casi todos los tumores primarios (PT) (expresión débil en 4 de cada 10 casos). Estos resultados sugieren una disminución específica de
OSMR
ARNm y proteína en el desarrollo del cáncer de colon.
Fuerte expresión de
OSMR
se detectó en todos los tejidos normales no malignas (NN) y adyacente mucosa de colon normal (PN). Por el contrario,
OSMR
rara vez se detectó en las células neoplásicas de pacientes con cáncer de colon. los grados del tumor se indican.
Para investigar el papel de la metilación del ADN en la regulación de
OSMR
expresión, transfectadas pGL3- un
OSMR
-Pro2 -Luciferase construir en tres líneas celulares; un
OSMR
-negativo línea celular, SW480, y dos
OSMR
líneas celulares -positivos, HCT116 y HEK293. El constructo se trató con o sin
Sss
metilasa antes de la transfección. Actividad de la
OSMR
promotor no se detectó en SW480, pero se detectó un alto nivel de actividad promotora en HCT116 y células HEK293 (Fig. 5A). La inducción de la metilación de CpG con
Sss
I metilasa disminuyó la actividad a niveles mínimos.
A, Análisis de
OSMR
actividad promotora de ensayo indicador de luciferasa en OSMR-positivo (HCT116 y HEK293) y SW480) - (células negativas. La construcción del promotor se pre-trata con o sin
Sss
metilasa durante 8 horas antes de la transfección. Se detectó la actividad más alta en células HEK293. Los datos se expresan como veces de incremento sobre la actividad pGL3-basic. Los experimentos se realizaron por triplicado y los valores indican las medias ± SD. Se presentan los valores medios. B, piscina Un siRNA dirigidos a
OSMR Opiniones y no director de control fueron transfectadas transitoriamente en HCT116, y las células fueron tratadas con rhOSM (50 ng /ml) (
la izquierda). HCT116 células fueron tratadas con o sin péptido inhibidor de Stat3 (Stat3 Inh, 100 mM) que actúa como un potente bloqueador altamente selectiva, de la activación de Stat3 (
derecha). El crecimiento celular se determinó por el ensayo MTT. Los datos se expresan como absorbancia a 570 nm. Los experimentos se realizaron por triplicado y los valores indican las medias ± SD.
*, P & lt; 0,05
. C, 5-aza-DC (5 M) fue pre-tratada durante 48 horas en SW480 y células DLD-1, y luego co-tratados con rhOSM durante 48 hrs. El crecimiento celular se determinó por el ensayo MTT. *, 5-tratadas-aza-DC en comparación con las células control sin tratar (
P & lt; 0,05);
#, 5-aza-DC /rhOSM- células tratadas en comparación con el tratamiento con 5-aza-DC solo (
P & lt; 0,05
). D, La fosforilación de
Stat3
y
Erk
en respuesta a rhOSM (50 ng /ml) se analizó por transferencia de Western en HCT116 y líneas de células SW480. rhOSM aumentó fosforilada
Stat3
y
Erk Hoteles en células HCT116 pero no en las células SW480 (que carecen de LIFR-E ver más abajo). La igualdad de carga de proteínas fue supervisado por el total de
Stat3
,
Erk
y
β-actina evaluación
en las muestras. Reactivación de
OSMR fotos: por tratamiento con 5-aza-DC se determinó en SW480 y DLD-1 células por citometría de flujo (Figura S6). E. Expresión de
LIFR
y
gp130
se examinó en líneas celulares de CRC por RT-PCR.
LIFR
se expresó en células HCT116 pero silenciado en la mayoría de las otras líneas celulares de CRC probadas.
gp130
, el
OSMR
heterodímero, se expresó de forma ubicua en todas las líneas celulares ensayadas. estado de metilación del promotor de estos dos últimos genes no se examinó.
oncostatina M (OSM) es una interleucina-6 (IL-6) de citoquinas de tipo, pero más activos que IL-6 en la inhibición de la proliferación de numerosas líneas celulares de tumores sólidos [19], [20]. Recientemente, una correlación de la resistencia a la inhibición del crecimiento por OSM con la pérdida específica de la
OSMR
y la señalización de Stat3 se informó de [15]. Con el fin de examinar CRC resistencia de las células a la inhibición del crecimiento por OSM, transfectadas transitoriamente una piscina siRNA dirigidos OSMR y un no-siRNA dirigidos al control de
OSMR
expresando células HCT116, y realizó un ensayo de crecimiento celular normal después del tratamiento de las células con un OSM humana recombinante (rhOSM). Se observó inhibición significativa del crecimiento por rhOSM en las células HCT116, y la inhibición fue revertida por abajo ronda de
OSMR gratis (Fig. 5B, izquierda). Un péptido inhibidor de Stat3 (Stat3 Inh) que abrogó la activación de Stat3 (Fig. 5D) bloqueó la inhibición del crecimiento inducida por rhOSM en las células HCT116 (Fig. 5B, derecha). Consistentemente, la supresión del crecimiento celular por rhOSM no se observó en SW480 y DLD-1 células con
OSMR
metilación del promotor (Fig. 5C). Curiosamente, la inhibición del crecimiento celular por tratamiento con 5-Aza-dC en SW480 y las células DLD-1 (*,
P & lt; 0,05
) se mejoró significativamente por el tratamiento de rhOSM (#,
P & lt; 0.05
). Finalmente se observó que rhOSM activa la fosforilación de Stat3 en las células HCT116, independientemente OSMR niveles de expresión (Fig. 5D, izquierda). La expresión de
gp130
y
LIFR
mRNA se observó en las células HCT116 (Fig. 5E), lo que indica que la activación de STAT3 en células HCT116 con la expresión OSMR muy baja causada por siRNA transfección puede ser a través gp130 /LIFR (receptor tipo I de OSM) mediada por la señalización. la fosforilación de Erk aumenta en las células HCT116 transfectadas con siRNA dirigidos a
OSMR
, y el nivel basal de fosfo-ERK en las células SW480 con
OSMR
metilación fue mayor que en las células HCT116 (Fig. 5D). 5-aza-DC disminuyó parcialmente activado ERK en las células SW480, y rhOSM recuperó basal phopshorylation Erk en presencia de 5-aza-DC. Por lo tanto, metilado
OSMR de
disminuyó notablemente tumor de inhibición de señales de rhOSM y eventos de señalización clave.
Discusión
Promotor metilación de genes reguladores clave impulsa el proceso de cáncer y en el contexto adecuado puede servir como un marcador de diagnóstico y un objetivo terapéutico. metilación específica del cáncer sirve como un biomarcador importante para la detección temprana del cáncer. Tales marcadores pueden complementar la evaluación histopatológico de biopsias de tejido o potencialmente valerse por sí mismos como marcadores de la enfermedad en varios fluidos corporales tales como heces. Con este fin, la frecuencia de metilación de los genes identificados en tejidos primarios tiene importantes implicaciones clínicas.
Una serie de genes son comúnmente hypermethylated en el cáncer colorrectal (CCR) que incluye
hMLH1
,
p16INK4a
,
p14ARF
,
RAR-β
,
APC
,
MGMT
,
ciclina A1
,
CDX1
,
MYOD1
,
de la COX-2
y
WT-1 | [21], [22], [23]. Sin embargo, los genes metilados sólo en tejidos neoplásicos con alta frecuencia (más del 40%) son raros. En este estudio, hemos identificado
PAPSS2
,
TUBG2
,
NTRK2
,
B4GALT1
y
OSMR
[12], [ ,,,0],24] como los genes que albergan específica por cáncer de metilación del promotor en el cáncer colorrectal humano. La sensibilidad teórica de cada gen metilado era más de 70% y las especificidades fueron más de 90% en TaqMan-MSP. La frecuencia de metilación de un gen clasifica con sólo unos pocos otros genes metilados en alta frecuencia en el CCR (
ciclina A1, CDX1, RAR-β, MYOD1, p15INK4b y COX-2
) de una manera específica del cáncer [ ,,,0],10].
Los estudios sobre
B4GALT1
y
OSMR
han sido reportados en el cáncer humano.
B4GALT1
se localiza tanto en el complejo de Golgi y en la superficie celular [25], y se expresa constitutivamente en todos los tejidos incluyendo mucosa colorrectal humano [26], con la excepción del cerebro [27]. El papel de la superficie de la célula
B4GALT1
en el cáncer humano se ha informado; se trata de un gen regulados por estrógenos en células MCF-7 [28], y su nivel fue alterada en las células del cáncer de pulmón altamente metastásicas en comparación con sus padres células metastásicas menos [29].
B4GALT1
promueve la apoptosis mediante la inhibición de la vía de crecimiento epidérmico receptor del factor de [30] y aumenta la apoptosis inducida por cicloheximida en células de hepatocarcinoma humano [31]. La proteína quinasa B /Akt inhibe la apoptosis mediante la regulación a la baja de
B4GALT1
[25]. Además, la proliferación de células epiteliales mejorada de la piel y el intestino delgado y la diferenciación anormal en las vellosidades intestinales se encontraron en
ratones B4GALT1
deficientes [32], lo que sugiere que
B4GALT1
juega un importante y supresor papel en la proliferación de células epiteliales. Por lo tanto, su inactivación por metilación del promotor podría dar lugar a escape de los controles celulares normales y la progresión del cáncer.
OSMR es un receptor de la oncostatina M (OSM), una interleucina-6 (IL-6) de citoquinas de tipo identifica como un potente supresor de las células tumorales. OSM humana fue descrito originalmente por su capacidad para inhibir la proliferación de melanoma in vitro [33], [34], y sus objetivos para la inhibición del crecimiento incluyen los carcinomas de pulmón [35], los carcinomas de ovario [36], y los tumores de mama [37]. La resistencia a la inhibición del crecimiento por OSM en líneas celulares de melanoma metastásico se correlacionaba con una pérdida específica de OSMR, en conjunción con un menor nivel de acetilación de histonas en la región promotora OSMR, lo que sugiere que las células del melanoma metastásico podrían escapar el control de crecimiento de OSM por el silenciamiento epigenético de OSMR [15]. Descubrimos que la metilación del promotor se correlaciona fuertemente con la expresión OSMR y también encontró una correlación de resistencia a la inhibición del crecimiento por OSM con pérdida de OSMR en líneas celulares de CRC. Por lo tanto, la metilación del promotor es un regulador clave de la expresión OSMR y todos estos resultados apoyan una función de supresión de OSMR en el cáncer humano
OSM humana forma dos tipos de complejos de señalización heterodiméricos.; gp130 /receptor inhibidor de la leucemia de los factores (LIFR) (Tipo I complejo receptor de OSM) [39] y OSMR (tipo complejo receptor II de OSM) gp130 /[40]. gp130 /LIFR puede ser activado por LIF o OSM, pero gp130 /OSMR se activa solamente OSM. El complejo receptor de tipo II activa vías de señalización de OSM-específicos a través de la JNK /SAPK y las vías Estad1 /STAT5, mientras que tanto el tipo I y tipo II complejos activan STAT3 y ERK como vías de señalización comunes en las células del cáncer de mama [41]. Además, el tipo I y la señalización del receptor de tipo II pueden exhibir funciones antagónicas [42]. Se encontró que la inhibición del crecimiento de células OSM mediada no se observó en las células HCT116 con bajo nivel OSMR pesar de Stat 3 fosforilación. Dado que las células HCT116 expresan gp130 y LIFR, rhOSM probable fosforila Stat3 a través de tipo de señalización mediada por el receptor I OSM, pero en ausencia de gp130 /OSMR este efecto no es suficiente para mediar en la supresión del crecimiento sostenido [41]. En apoyo de esta idea, rhOSM no aumentó la fosforilación de STAT3 en células SW480, que carecen de la expresión LIFR
Desde el punto de vista clínico, nuestros resultados tienen implicaciones potenciales de diagnóstico y terapéuticas inmediatas y merecen una mayor atención. En un ensayo ciego realizado en el ADN de heces de pacientes con CRC,
B4GALT1
y
OSMR
metilación se detectaron con éxito con alta frecuencia y por lo tanto tienen potencial para identificar a las personas con cáncer de colon. Cuando probamos un gen metilado conocida adicional,
SFRP1
[18], en combinación con
OSMR
la sensibilidad del ensayo de aumento; 60% (12/20) de los cánceres de colon se detecta en el ADN en heces con perfecta especificidad (
P & lt; 0,001
). Estos datos sugieren que la metilación del promotor de
OSMR
podría servir como un verdadero indicador de la presencia de cáncer de colon.
terapéuticamente, ambos genes proporcionan pistas tentadoras para los nuevos enfoques en el tratamiento de la CRC. Las secuencias de cebadores se muestran en la Tabla S1.