Extracto
β-catenina desempeña el doble papel en la adhesión de la formación del complejo y de la vía de señalización Wnt . Aunque la expresión β-catenina parece ser upregulated y vía de señalización Wnt está activada en la mayoría de los cánceres, su nivel de expresión parece estar perdido en el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). Hemos informado anteriormente de que el promotor de la β-catenina se hypermethylated en dos líneas celulares de cáncer. En el presente estudio, hemos ampliado nuestro análisis del estado de metilación de β-catenina región promotora y su expresión de proteínas en siete líneas celulares de cáncer y una serie de 143 casos de cáncer de pulmón humano primario con los tejidos adyacentes no neoplásicas. metilación cuantitativa análisis específico PCR (qMSP) mostró metilación de β-catenina región promotora en cinco líneas celulares de NSCLC, con un aumento de los niveles de proteína β-catenina en 5'-Aza-2 'desoxicitidina tratamiento (5-aza-dC). El estado de metilación en SPC (metilado) y A549 (no metilado) se confirmó por secuenciación de bisulfito de PCR. tratamiento con 5-aza-DC inhibe la invasividad de las SPC, pero no A549. El análisis de inmunofluorescencia mostró expresión β-catenina membranosa se perdió en SPC y podría restablecerse por 5-aza-dC, mientras que el tratamiento Wnt3a llevó a la translocación nuclear de β-catenina en tanto SPC y A549. ensayos de luciferasa Dual-indicaron que 5-aza-dC tratamiento no causó ningún aumento significativo en la actividad de señalización Wnt en comparación con el tratamiento con Wnt3a. El efecto de agente de desmetilación en SPC puede ser revertida por el agotamiento de β-catenina pero el agotamiento no E-cadherina que indicaba que la metilación mediada por el silenciamiento de β-catenina podría mejorar NSCLC invasión y metástasis de manera independiente E-cadherina. inmunohistoquímica resultados posteriores confirmaron además que β-catenina hipermetilación del promotor correlaciona con la pérdida de la expresión de la proteína inmunorreactiva, metástasis de ganglios linfáticos positivos, TNM etapa de alta y de mal pronóstico. El presente estudio implica β-catenina hipermetilación del promotor en el mecanismo de cambios epigenéticos subyacentes NSCLC metástasis y la progresión, lo que indica el potencial de la β-catenina como un objetivo epigenética novedoso para el tratamiento de pacientes con CPNM
Visto:. Miao Y, Wang L, Zhang X, Xu X, Jiang G, Fan C, et al. (2014) Promotor metilación mediada por silenciamiento de β-catenina Mejora la invasividad de células no pequeñas de cáncer de pulmón y predice un pronóstico adverso. PLoS ONE 9 (11): e112258. doi: 10.1371 /journal.pone.0112258
Editor: Pier Giorgio Petronini, Universidad de Parma, Italia |
Recibido: 17 Abril, 2014; Aceptado: 9 Octubre 2014; Publicado: 14 Noviembre 2014
Derechos de Autor © 2014 Miao et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 81000942 a Yuan Miao y No. 30900562 Yang Liu) . Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón sigue siendo un problema clínico importante debido a sus pobres pronóstico y las opciones de tratamiento limitadas [1]. La alta mortalidad de cáncer de pulmón es atribuible en gran medida a la falta de un diagnóstico precoz y la metástasis observado con frecuencia en el momento del diagnóstico [2]. El análisis de los cambios biológicos que subyacen a la patogénesis de esta enfermedad maligna, la identificación en las primeras etapas, y la prevención de la metástasis, por lo tanto, pueden ser las principales opciones para mejorar el pronóstico sombrío general de este tipo de cáncer
.
La invasión tumoral y metástasis se produce cuando las células tumorales adquieren la capacidad de desprenderse del tumor primario y entrar en los canales de tejidos o linfovascular circundantes, un proceso que depende críticamente de la interrupción de las uniones de adhesión entre las células tumorales [3]. β-catenina es especialmente interesante durante este proceso, ya que no sólo participa en este complejo de adhesión, sino también una parte integral de la vía de señalización Wnt [4] - [6]. Una gran mayoría de los cánceres incluyendo colorrectal, hepatocelular, de tiroides, y cáncer de ovario, las mutaciones β-catenina puerto y cambios en otros genes, tales como el gen APC, lo que conduce a la acumulación nuclear de β-catenina y la activación de la vía de señalización Wnt [ ,,,0],4], [7], [8]. Sin embargo, la evidencia indica que la expresión nuclear de β-catenina es raro y actividad de señalización Wnt es downregulated en el cáncer de pulmón [5], [9] - [11]. Un creciente número de estudios han descrito y analizado la asociación entre la pérdida de la expresión de β-catenina y parámetros clínico en pacientes con cáncer de pulmón [9], [11]. Sin embargo, los mecanismos subyacentes siguen siendo controvertidos. Un informe reciente mostró que el nivel de proteína β-catenina no se vio afectada por el agotamiento de E-cadherina [12]. Por lo tanto, debe haber otros mecanismos responsables de la expresión β-catenina downregulated en NSCLC.
metilación aberrante promotor podría resultar en el silenciamiento de genes en diversos tumores malignos, incluyendo el cáncer de pulmón [13], [14]. A pesar de que la señalización Wnt se activó y la expresión de β-catenina se reguló en el carcinoma gástrico primario, Ebert
et al.
Mostró que el promotor de la β-catenina se hypermethylated que dio lugar a la pérdida de la expresión de β-catenina en la célula la línea derivada de metástasis hepáticas de cáncer gástrico, pero no los cánceres primarios [15]. En conjunto, se especuló que la metilación de promotores de β-catenina puede jugar un papel en la regulación de la invasividad de las células cancerosas. Nuestro informe más reciente encontró que la hipermetilación de promotores de β-catenina se observaron en dos líneas celulares de cáncer primario, que diferían de que en el cáncer gástrico [16]. Dado que las actividades de vía de señalización Wnt fue menor en el CPNM de lo que en otros tipos de cáncer, la hipótesis de que la hipermetilación de promotores de β-catenina en NSCLC puede explicar la alta frecuencia de metástasis y mal pronóstico en pacientes con CPNM.
A continuación, se estudió el impacto de la metilación del promotor progresión tumoral statuson β-catenina y la invasión, mediante la utilización de las dos líneas celulares de cáncer de pulmón y muestras de pacientes que nuestros modelos experimentales.
Materiales y Métodos
muestras de tejido humano y líneas celulares
Este estudio se llevó a cabo con la aprobación de la junta de revisión institucional de la Universidad médica de china (Shenyang, china). consentimiento escrito fue dado por los participantes para su información que se almacena en la base de datos del hospital para sus muestras que se utilizaron en este estudio. Toda la investigación clínica se ha llevado a cabo de acuerdo con los principios expresados en la Declaración de Helsinki. Ciento cuarenta y tres casos de cáncer de pulmón humano primario con los correspondientes tejidos no tumorales adyacentes que fueron sometidos a resección quirúrgica con intención curativa, se recogieron desde el Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de China entre octubre de 2004 y julio de 2006. Se definió la supervivencia de los pacientes como el tiempo desde el día de la cirugía para el final del seguimiento o día de la muerte debido a la recurrencia o metástasis. Ninguno de los pacientes recibió radioterapia o quimioterapia antes de la resección quirúrgica, y todos los pacientes recibieron quimioterapia después de la cirugía de rutina. La población de pacientes del estudio ha sido reportado en nuestra literatura anterior [17]. El diagnóstico y la diferenciación grado histológico fueron evaluados en hematoxilina y eosina secciones teñidas, de acuerdo con las directrices de clasificación de la OMS de 2004 [18]. Las 143 muestras fueron reevaluados con respecto al subtipo histológico, la diferenciación y el estadio del tumor. La estadificación del tumor se determina de acuerdo con la séptima edición de la Unión Internacional contra el Sistema Cáncer (UICC) La estadificación TNM para el cáncer de pulmón [19]. Las muestras incluyeron 44 casos de carcinoma de pulmón de células escamosas y 99 casos de adenocarcinoma de pulmón. Cincuenta y uno tumores fueron altamente diferenciada y 92 tumores fueron moderadamente o pobremente diferenciados. Metástasis en los ganglios linfáticos estaban presentes en 70 casos y ausente en 73 casos. Los tumores incluyen 81 casos de la enfermedad en estadio I-II y 62 casos de fase
A-III
III de la enfermedad B.
Siete líneas celulares NSCLC, que se utilizan comúnmente en nuestro laboratorio, se seleccionaron para la célula experimentos. Las líneas de células HBE, A549 y H1299 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA, EE.UU.). El PG-BE1 (BE1), PG-LH7 (LH7), líneas de células SPC-A-1 (SPC), y LTEP-A-2 (LTE) se obtuvieron de Shanghai Cell Bank (Shanghai, China). Todas las células se cultivaron en medio RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) que contenía suero de ternera fetal al 10% (Invitrogen), 100 UI /ml de penicilina (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.), y 100 mg /ml de estreptomicina ( Sigma). Las células se cultivaron en placas de cultivo estériles y se pasaron cada 2 días utilizando 0,25% de tripsina (Invitrogen).
extracción de ADN y cuantitativa en tiempo real específica de metilación de reacción en cadena de polimerasa
se extrajo ADN genómico a partir de líneas celulares y 10-m-secciones gruesas de 10% fijado en formol, bloques de tejido tumoral embebido en parafina neutros utilizando el Kit QIAamp DNA Mini (QIAGEN, Hilden, Alemania). El ADN genómico se trató con bisulfito de sodio usando un kit de la metilación del ADN EZ (D5005, Zymo Research, Orange, CA, EE.UU.). ensayos de metilación específica de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (PCR) se realizaron en el sistema de PCR ABI 7900HT Fast en tiempo real (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). Los pares de cebadores fueron los siguientes: β-catenina adelante, 5'-GGAAAGGCGCGTCGAGT-3 'y revertir, 5'-TCCCCTATCCCAAACCCG-3', con la sonda TaqMan 5'-6FAM- CGCGCGTTTCCCGAACCG-TAMRA-3 '; ß-actina adelante, 5'-TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT-3 'y revertir, 5'-AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA-3', con la sonda TaqMan 5'-6FAM-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-TAMRA-3 '. El servicio de limpieza β-actina de genes (ACTB) se utilizó para normalizar una reacción de control independiente de metilación. Para la cuantificación relativa, cantidades del ADN metilado (porcentaje de referencia metilado) a una región del promotor de β-catenina se normalizaron al valor de metilación del calibrador, que se definió como 100%. Se utilizó ADN metilado universal (QIAGEN) como calibrador. El porcentaje de referencia metilado se definió como 100 × 2
(sampleACTB (ct) - sampleβ-catenina (ct)) /2
(calibratorACTB (ct) - calibratorβ-catenina (ct)) [20]. Para discriminar entre los niveles de metilación individuales, un valor de corte de 4% o más se definió como "metilado" y un valor de corte de menos de 4% como "no metilado" basado en un estudio anterior [21].
bisulfito secuenciación PCR (BSP) de los promotores de β-catenina
Se utilizó el software v1.0 metil Primer Express (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) para analizar el
CTNNB1
región promotora del gen -1,124-11,114 pb. ADN de las células de cáncer de pulmón se extrajo y después se trató con bisulfito de sodio usando un kit de la metilación del ADN EZ (Zymo Research) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los β-catenina cebadores-promotor específico para la secuenciación de bisulfito se construyeron utilizando datos de la secuencia promotora y el software de diseño de cebadores (Primer Premier 5; Premier Biosoft International, Palo Alto, CA, EE.UU.); las secuencias de cebadores se muestran en la Tabla 1. Los cebadores fueron diseñados para amplificar una región rica en CpG del promotor que abarca 189 sitios CpG (19 sitios CpGCpG). Los productos de PCR fueron purificados utilizando el kit de extracción de purificación de ADN multifuncional (DP1501, BioTeke Corporation, Beijing, China) y se ligaron en el vector simple pum-T (DP6803, BioTeke Corporation, Beijing, China), y al menos cinco clones independientes, cada uno eran elegido para el análisis de secuencias por BIQ analizador.
El tratamiento con 5-aza-dC y Wnt3a
células de cáncer de pulmón cultivadas fueron tratadas con diferentes concentraciones de 5-aza-2'- desoxicitidina (5-aza-dC) (Sigma) disuelto en medio de cultivo cada 24 horas. El uso de ensayos q-MSP y MTT, se seleccionó la concentración de fármaco requerida para el promotor β-catenina CpG desmetilación isla con ningún efecto significativo sobre el crecimiento celular (7 M) y se recogieron las células después del cultivo continuo durante 48 horas (Figura S1).
Las células fueron tratadas con 500 ng /ml recombinante Wnt3a (R & amp; D Systems, Minneapolis, MN, EE.UU.).. por 48 horas
interferente pequeño ARN tratamiento
Las líneas celulares que eran se sembraron en placas de seis pocillos con medio fresco sin antibióticos durante 24 h antes de la transfección. Las células se transfectaron con β-catenina siRNA (sc-29209, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.), E-cadherina siRNA (sc-35242, Santa Cruz) y el control de siRNA (sc-37007, Santa Cruz Biotechnology), usando Lipofectamine-2000 (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Todos los siRNAs se componen de un conjunto de dos meta-específica 19-25 nt siRNAs, se recogieron las células a las 48 horas después de la transfección.
Western blot.
La proteína total a partir de células se extrajo en tampón de lisis (Pierce) y se cuantifica usando el método de Bradford. Entonces, las proteínas (50 g) se separaron por SDS-PAGE (12%) y se transfirieron a fluoruro de polivinilideno (PVDF) membrana (Millipore, Billerica, MA, EE.UU.). Posteriormente, las membranas se incubaron durante la noche a 4 ° C con anticuerpos monoclonales contra la E-cadherina (sc-8426, 1: 200; Santa Cruz Biotechnology), β-catenina (610 154, 1: 500; BD Transduction Laboratories, Lexington, KY, EE.UU. ) o GAPDH (sc-365 062, 1: 500, Santa Cruz Biotechnology). Después de la incubación con peroxidasa acoplada IgG anti-ratón (Santa Cruz Biotechnology) a 37 ° C durante 2 h, las proteínas unidas se visualizaron utilizando ECL (Pierce) y se detectaron utilizando Sistemas BIOimagen (UVP Inc., Upland, CA, USA). Los niveles de proteína relativos se calcularon sobre la base de la proteína GAPDH como control de carga.
ensayo de invasión de Matrigel.
ensayos de invasión celular se realizaron con una cámara de 24 pocillos Transwell con un tamaño de poro de 8 micras (Corning Costar Transwell, Cambridge, MA, EE.UU.), y los insertos se revistieron con 20 l de Matrigel (dilución 1:03, BD Biosciences). Entonces, 48 h después de la transfección, se tripsinizaron las células y se transfirieron a la cámara de Matrigel superior en 100 l de medio libre de suero que contenía 3 x 10
5 células y se incubaron durante 16 horas. Medio suplementado con 10% FBS se añadió a la cámara inferior como el quimioatrayente. El número de células invasoras se contaron en 10 campos de microscopio de alta potencia seleccionados al azar. Los experimentos se realizaron por triplicado.
tinción inmunofluorescente.
Las células se fijaron con paraformaldehído al 4%, se bloquearon con 1% de BSA y después se incubaron con el anticuerpo β-catenina monoclonal (610154, 1 : 400; BD transducción Laboratories) durante la noche a 4 ° C, seguido de incubación con isotiocianato de fluoresceína (FITC) conjugado con anticuerpos secundarios (1: 200, Zhongshan Golden Bridge, Pekín, china) a 37 ° C. Los núcleos se contratiñeron con 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). La microscopía de epifluorescencia se realizó utilizando un microscopio Nikon TE300 invertido (Melville, NY, EE.UU.) y microscopía confocal se realizó utilizando un microscopio de barrido láser confocal Resplandor 2000 (Carl Zeiss, Thornwood, NY, EE.UU.).
Dual-luciferasa ensayos.
las transfecciones se realizaron usando Lipofectamina 2000 (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Las células se sembraron en placas de 24 pocillos durante 24 h antes de la transfección con plásmidos de genes reportero pGL3-OT o pGL3-DE (0,5 mg), junto con el plásmido de control pRL-TK (50 ng). Después de la incubación durante 30 horas a 37 ° C, la expresión del gen reportero fue detectado por el sistema de doble ensayo de luciferasa (Promega, Madison, WI, EE.UU.). la actividad de transcripción de genes mediada Tcf-se determinó por la relación de pGL3-OT a pGL3-de la actividad de la luciferasa, que se normalizó a la actividad de luciferasa de Renilla a partir del plásmido de control pRL-TK. Se realizaron todos los experimentos, por duplicado, un mínimo de tres veces. Para analizar los efectos de la 5-aza-DC y β-catenina siRNA en la señalización de Wnt, se añadió 5-aza-DC y β-catenina siRNA fue co-transfectadas con pGL3-OT o pGL3-DE para ensayos de luciferasa.
la inmunohistoquímica (IHC)
se realizó un análisis inmunohistoquímico de la expresión de β-catenina usando un anticuerpo β-catenina-específico monoclonal (610154, 1: 200; BD Transduction Laboratories) como se describe anteriormente y se evaluó de acuerdo con nuestro informe anterior [17], [22].
análisis estadístico.
SPSS versión 13.0 para Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, EE.UU.) se utilizó para todos los análisis. Las pruebas de chi-cuadrado y de correlación de Spearman se utilizaron para examinar las posibles correlaciones de estado de metilación β-catenina en el CPNM con su estado de metilación en el tejido pulmonar normal adyacente y los factores clínico-patológicos. Se utilizó la prueba U de Mann-Whitney para analizar los resultados de q-MSP, Western blot, ensayos invasivos Matrigel y ensayos doble-luciferasa. El método de Kaplan-Meier se utilizó para estimar la probabilidad de supervivencia de los pacientes, y las diferencias en la supervivencia de los subgrupos de pacientes se compararon mediante la prueba de log-rank de Mantel. Los datos se presentan como la media de los experimentos realizados por triplicado.
P
. & Lt; 0,05 fue considerado para indicar diferencias estadísticamente significativas
Resultados
El análisis del estado de metilación de la región promotora del gen de la β-catenina en las células de cáncer de pulmón
Los niveles de metilación del promotor de β-catenina fueron probados en líneas celulares de cáncer de pulmón. Como se muestra en la Figura 1A, cinco líneas de células (LH7, BE1, SPC, LTE y H1299) exhibieron altos niveles de metilación, mientras que dos líneas celulares (HBE y A549) eran no metilado. El análisis de la región promotora del gen CTNNB1 -1124 - 11.114 pb en líneas celulares de cáncer reveló la presencia de dos islas CpG en las posiciones -1,124 - 876 y 10.676 - 11.114, respectivamente. Estas secuencias contenían 189 sitios individuales CG, de los cuales 19 eran CG-dinucleótidos. Utilizando el método de secuenciación genómica de bisulfito de sodio, hemos diseñado cebadores para analizar las primeras islas CpG en una región de base par 1.331 (-614-717) que contiene parte de la región del promotor de β-catenina a través de su sitio de inicio de la transcripción en el RCP y líneas celulares A549 . Múltiples sitios de metilación se identificaron en células SPC, mientras que sólo unos pocos residuos 5-metilcitosina se observaron en varios clones secuenciados derivados de células A549 (Fig. 1B y 1C).
(A) Análisis cuantitativo de la MSP β catenina región promotora en líneas celulares de cáncer. (B) región promotora del gen de la β-catenina: Posición de las islas CpG y el diseño de cebadores se indican mediante líneas y flechas. (C) La metilación de uno de los 19 dinucleótidos CG-en la región de -614 pb a -270 pb de ambos A549 y SPC. Los círculos negros representan los sitios CG metilados, círculos vacíos representan sitios CG no metilados.
El tratamiento de las células con 5-aza-DC restaurado expresión de β-catenina y la invasión de células de cáncer de pulmón a través inhibido el restablecimiento de la β-catenina membranosa expresión más que por la activación de la vía de señalización Wnt
el producto químico 5-aza-dC se ha utilizado tanto in vitro como in vivo para inhibir la metilación del ADN. En este estudio, todos los siete líneas celulares (HBE, LH7, BE1, SPC, A549, LTE y H1299) se trataron con 5-aza-dC (Fig. 2A, 2B). La expresión de β-catenina fue restaurada en las cinco líneas celulares (LH7, BE1, SPC, LTE y H1299) en la que β-catenina metilación del promotor había sido comprobados con anterioridad. Sin embargo, no se observaron cambios significativos en las líneas de células HBE y A549 (no metilados). Además, investigó los efectos del tratamiento con 5-aza-DC de la capacidad de invasión de las líneas de células de pulmón. Como se muestra en las Figuras 2C y 2D, el tratamiento 5-aza-dC resultó en una marcada inhibición de la invasividad de las células SPC, mientras que no hubo ningún efecto mensurable en las células A549 (Ver Figura S2 para resultados matrigel en otras líneas de células). Posteriormente, la capacidad de 5-aza-dC para activar la vía de señalización Wnt se investigó usando células de proteínas-simulado Wnt3a como control positivo. En comparación con las células tratadas con Wnt3a, ensayos de doble luciferasa revelaron que 5-aza-dC tratamiento dio lugar a cambios significativos en las actividades de la señalización de Wnt (Fig. 2E). El análisis de inmunofluorescencia reveló que el tratamiento con 5-aza-dC restaurado expresión β-catenina membranosa en SPC, pero no las células A549. Además, se detectó la expresión de β-catenina en el núcleo en las células tratadas con Wnt3a, mientras, se observó una distribución membranosa en las células no tratadas (Fig. 2F). En conjunto, estos datos sugieren que, a diferencia de otros carcinomas, la metilación del promotor de β-catenina era un fenómeno común en NSCLC, y puede ser responsable de la regulación a la baja de la expresión de β-catenina el aumento de la invasividad de las células de cáncer de pulmón.
niveles (a) de la proteína β-catenina después de tratamiento con 5-aza-dC (7 M) en líneas celulares de cáncer. (B) Cuantificación de la expresión de proteínas después del tratamiento 5-aza-dC. (C) Imágenes representativas de las células en la parte inferior de las membranas Transwell muestran los cambios en el número de células invasoras (× 400, barra de escala = 50 m). (D) Número de células invasoras en la superficie inferior del filtro se contó, cada uno llevaba a cabo por triplicado. (Las barras representan SD *
P
. & Lt; 0,05, en comparación con el control). (E) Dual-Luciferase resultados del ensayo muestran que 5-aza-dC tratamiento dio lugar a cambios significativos en las actividades de Wnt de señalización en comparación con las células tratadas Wnt3a. Cada uno de los experimentos se repitió por triplicado. (D) La tinción de inmunofluorescencia que muestran que β-catenina se localiza principalmente en la membrana de las líneas celulares A549 y SPC. El tratamiento con 5-aza-DC alteró las cantidades de expresión de β-catenina membranosa. Sin embargo, β-catenina se transloca en el núcleo después del tratamiento Wnt3a (barra de escala = 20 m, anticuerpo β-catenina fue reemplazado por IgG de ratón normal como control negativo).
5-Aza-dC tratamiento restaura la expresión β-catenina en un e-cadherina independiente de manera
con el fin de confirmar aún más la función de la metilación del promotor de β-catenina, ARNsi β-catenina-específica se introdujo en SPC y las células A549. En comparación con las células transfectadas con siRNA control mezclado, las células transfectadas con siRNA β-catenina presentaron menor β-catenina y la expresión de E-cadherina, que no puede ser restaurada por el tratamiento con 5-aza-DC (Fig. 3A, B). A continuación, hemos derribado E-cadherina con siRNA E-cadherina-específico en estas dos líneas celulares. la expresión de E-cadherina se redujo tanto en las células SPC y A549, mientras que, la expresión de β-catenina no se disminuyó visiblemente por el agotamiento de E-cadherina en comparación con el control. Con tratamiento con 5-aza-DC, la expresión de β-catenina se reguló de manera significativa en las células SPC sin importar la expresión de E-cadherina (Fig. 3C, D). Además, investigó los efectos del tratamiento con 5-aza-DC cuando se introduce con β-catenina-siRNA y E-cadherina-siRNA en la capacidad de invasión de las líneas de células de pulmón. Como se muestra en las Figuras 3E y 3F, ya sea β-catenina o el agotamiento E-cadherina conducido a un aumento significativo de la capacidad invasiva de células tanto SPC y A549. Por tratamiento con 5-aza-dC, el número de las células migratorias se redujo significativamente en las células SPC E-cadherina-agotado, que no se observó en células A549. Sin embargo, las capacidades invasivas de las células SPC y A549-agotado β-catenina no fueron obviamente inhibidas por tratamiento con 5-aza-dC. Además, los ensayos de luciferasa duales-revelaron que ni 5-aza-dC tratamiento ni β-catenina-agotamiento resultaron en cambios significativos en las actividades de Wnt de señalización en comparación con las células tratadas con Wnt3a (Fig. 3G). Por consiguiente, la inhibición de la expresión β-catenina por su metilación del promotor parece la regulación negativa de la invasividad de las células del cáncer de pulmón de una manera independiente E-cadherina. la tinción de inmunofluorescencia mostró que el membranosa β-catenina se ve reforzada por tratamiento con 5-aza-DC sólo en línea de células SPC, pero no en la línea celular A549. El agotamiento de β-catenina atenúa membranosa β-catenina en ambas líneas celulares A549 y SPC, pero el agotamiento de E-cadherina no tiene ningún efecto sobre la expresión membranosa de β-catenina en cualquiera CCP o línea celular A549. El tratamiento con 5-aza-DC alteró ligeramente las cantidades de expresión de β-catenina membranosa después de β-catenina o el agotamiento de E-cadherina en la línea celular SPC, pero no en la línea celular A549.
Después de desmontables de β-catenina ( A) o e-cadherina (C), la expresión de proteínas de SPC y líneas de células A549 se examinaron 48 h después del tratamiento 5-aza-dC usando los anticuerpos indicados. (B, D) Los gráficos muestran la cuantificación de la expresión de la proteína después de tratamiento con 5-aza-DC y transfección de siRNA. GAPDH se utilizó como control. (E) Imágenes representativas de las células en la parte inferior de las membranas Transwell muestran los cambios en el número de células invasoras (× 400, barra de escala = 50 m). (F) Número de células invasoras en la superficie inferior del filtro se contó, cada uno llevaba a cabo por triplicado. (Las barras representan SD *
P
. & Lt; 0,05, en comparación con el control). (G) Resultados de ensayo de luciferasa Dual-muestran que el tratamiento y la β-catenina agotamiento 5-aza-dC no dio lugar a cambios significativos en las actividades de Wnt de señalización en comparación con las células tratadas Wnt3a. Cada uno de los experimentos se repitió por triplicado. tinción (H) de inmunofluorescencia que muestran que el membranosa β-catenina se ve reforzada por 5-aza-DC tratamiento sólo en la línea celular SPC, pero no en la línea celular A549. El agotamiento de β-catenina atenúa membranosa β-catenina en ambas líneas celulares A549 y SPC, pero el agotamiento de E-cadherina no tiene ningún efecto sobre la expresión membranosa de β-catenina en cualquiera CCP o línea celular A549. El tratamiento con 5-aza-DC alteró ligeramente las cantidades de expresión de β-catenina membranosa después de β-catenina o el agotamiento de E-cadherina en la línea celular SPC, pero no en la línea celular A549. (Barra de escala = 20 m, anticuerpo β-catenina fue reemplazado por IgG de ratón normal como control negativo).
hipermetilación del promotor de β-catenina correlacionado con su pérdida de la expresión membranosa en la muestra NSCLC
a continuación se investigó el estado de metilación del promotor de β-catenina en muestras de tejidos clínicos. ß-catenina se expresa predominantemente en la membrana celular en muestras de tejido de pulmón normal (83,9%, 120/143; Fig. 4A), con reducción de la expresión membranosa en los tejidos de NSCLC (18,9%; 27/143; la Fig. 4B, C). Posteriormente, los niveles de metilación del promotor β-catenina se cuantificaron mediante PCR en tiempo real específica de metilación. El uso de un valor de la hipermetilación de más de 4% como punto de corte, la hipermetilación de β-catenina (media ± SD, 8,60% ± 11,41%; rango, 0-100%) se encontró en 74 (51,7%) de las muestras de NSCLC 143, que fue significativamente mayor que en el tejido pulmonar normal adyacente (13,3%, 19/143, con una media ± dE, 2,66% ± 2,63%; rango, 0-100%;
P Hotel & lt; 0,001; Fig. 4D ). Tomados en conjunto, nuestro estudio sugiere que la metilación β-catenina se correlacionó significativamente con la pérdida de la expresión de β-catenina membranosa (
P
= 0,001).
(A) la expresión de β-catenina en el epitelio pulmonar normal con una fuerte tinción membranosa. expresión β-catenina membranosa se perdió en el pulmón carcinoma de células escamosas (B) y el adenocarcinoma de pulmón (C). Barra de escala = 20 micras. (D) los resultados cuantitativos de metilación de q-MSP. Los datos representan la media ± SD. Se utilizó la prueba U de Mann-Whitney para determinar la significación estadística. **
P Hotel & lt; 0,001. curvas (E) de supervivencia de los pacientes con o sin β-catenina metilación del promotor. Se utilizó la prueba de log-rank de Mantel para determinar la significación estadística.
La correlación entre el promotor β-catenina metilación y los factores clínico-patológicos
Las características clínicas y patológicas de los pacientes con CPNM se analizaron de acuerdo con su estado de metilación. Como se muestra en la Tabla 2, la hipermetilación β-catenina correlacionó positivamente con metástasis en los ganglios linfáticos y el estadio TNM en los 143 casos de CPNM (
P = 0,001
y
P = 0,046
, respectivamente). No se encontró asociación significativa entre la metilación del β-catenina y el sexo, edad, tipo histológico, o la diferenciación en el CPNM. La prueba de Kaplan-Meier reveló que el tiempo de supervivencia global de los pacientes con CPNM fue menor en los pacientes con tumores β-catenina-metilado que en aquellos con los tumores β-catenina-metilado (
P Hotel & lt; 0,001, Fig. 4E).
Discusión
β-catenina, como un componente importante de ambas uniones adherentes y vía de señalización Wnt, se creía que ser trasladadas en el núcleo de su mutación del exón y /o APC mutación en varios tipos de tumores, excepto cáncer de pulmón [4], [7], [8]. Sin embargo, las evidencias acumuladas indican que, en el cáncer de pulmón, β-catenina se pierde y es downregulated actividad de señalización Wnt. El mecanismo subyacente permanece unelucidated [5], [9] - [11]. Nuestro estudio más reciente encontró que el promotor del gen de la β-catenina siempre fue metilado en líneas celulares de cáncer de pulmón [16]. Con el fin de aclarar las funciones de β-catenina en el CPNM, hemos ampliado nuestra investigación del estado de metilación en siete líneas celulares de cáncer de pulmón. Se encontró que el agente de desmetilación 5-aza-DC restauró los niveles de proteína β-catenina en cinco de las siete líneas celulares que habían sido confirmados a ser metilado en el presente estudio. Entre estos, el estado de metilación de SPC y A549 se confirmó adicionalmente mediante secuenciación genómica con bisulfito. Es bien reconocido que la entrada de β-catenina en el núcleo podría mejorar la actividad de señalización Wnt, promoviendo así la invasividad de múltiples cánceres humanos. Sin embargo, la expresión de β-catenina se perdió en las metástasis distantes de carcinoma gástrico y la pérdida de expresión de β-catenina puede ser debido a la hipermetilación del promotor de la β-catenina, a pesar de que la expresión de β-catenina se upregulated y la vía de señalización Wnt se activó en la mayor parte del cáncer gástrico primario [15]. Especulamos que la pérdida de β-catenina puede desencadenar otra cascada (s) de señalización más fuerte que la señalización Wnt en el control de la activación de la invasividad de las células cancerosas. Dado que el cáncer de pulmón muestra inferior de línea de base de la actividad de señalización de Wnt que el cáncer gástrico, el mecanismo principal en la regulación de la invasividad puede ser independiente de la vía de señalización Wnt. la activación de la vía de señalización Wnt, la capacidad de invasión, y la distribución subcelular de β-catenina en líneas de células de pulmón. Los resultados indicaron que la desmetilación mediante la 5-aza-dC podría restaurado expresión β-catenina y la invasividad de células de cáncer de pulmón inhibida a través de re-establecimiento de la expresión de β-catenina membranosa, más que por la activación de la vía de señalización Wnt. El presente estudio ofrece una nueva explicación de por qué la expresión de β-catenina se downregulated en el CPNM e indicó que la metilación del promotor de la β-catenina puede regular la capacidad de invasión a través de una vía independiente de la señalización de Wnt en las células de cáncer de pulmón. Como catenina junto con cadherinas y uniones adherentes formados, nuestros resultados indican que la pérdida de la expresión de β-catenina podría destruir uniones adherentes por su reducción de la expresión membranosa.
E-cadherina juega un papel crucial en las uniones adherentes. A través de su dominio intracelular, E-cadherina se conectó con β-catenina. Aunque la metilación de E-cadherina metilación de genes se encontró en varios tipos de cáncer, sigue siendo controvertida como en el cáncer de pulmón [23] - [25]. Russo
et al
.