Extracto
La difusión de las células de cáncer de próstata (CaP) a la médula ósea es un evento temprano en el proceso de la enfermedad. En algunos pacientes, las células tumorales diseminadas (DTC) proliferan para formar metástasis activas después de un período prolongado de enfermedad indetectable conocido como latencia del tumor. La identificación de los mecanismos de CaP latencia y reactivación siguen siendo un desafío debido en parte a la falta de
in vitro y modelos. Aquí, que caracteriza
in vitro
CaP latencia-reactivación por las células que inducen a partir de tres líneas de xenoinjerto derivado del paciente (PDX) a proliferar a través del contacto de las células tumorales entre sí y con estroma de la médula ósea. Las células en crecimiento CaP demostraron contacto célula-célula tumoral y la agrupación de integrinas por inmunofluorescencia. la expresión génica global análisis sobre la proliferación de células cultivadas sobre estroma de médula ósea reveló una regulación a la baja de TGFB2 en todas las tres líneas en proliferación CaP PDX en comparación con sus contrapartes no-proliferación. Además, la activación constitutiva de la cadena ligera de la miosina kinasa (MLCK), un efector aguas abajo de la integrina-beta1 y TGF-beta2, en células no proliferantes promovió la proliferación celular. Esta proliferación celular se asocia con una regulación al alza de CDK6 y una regulación a la baja de E2F4. Tomados en conjunto, nuestros datos proporcionan la primera
in vitro
modelo clínicamente relevante para apoyar la adhesión celular y la regulación a la baja de TGFB2 como un posible mecanismo por el cual las células de CaP pueden escapar de la latencia. La orientación del mecanismo TGF-beta2-asociado podría proporcionar nuevas oportunidades para prevenir la metástasis letal CaP
Visto:. Ruppender N, S Larson, lakely B, Kollath L, marrón L, I Coleman, et al. (2015) de adhesión celular Promueve las células del cáncer de próstata: Fuga de latencia. PLoS ONE 10 (6): e0130565. doi: 10.1371 /journal.pone.0130565
Editor: Lucía R. Languino, Thomas Jefferson University, Estados Unidos |
Recibido: 11 Febrero, 2015; Aceptado: 21 de mayo de 2015; Publicado: 19 Junio 2015
Derechos de Autor © 2015 Ruppender et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Toda la expresión génica archivos están disponibles en la base de datos GEO (número de acceso GSE64262)
Financiación: Este trabajo fue apoyado por Janssen Investigación y Desarrollo LLC (http://www.janssenrnd.com), y PO1 CA85859 de los Institutos nacionales de salud (http://grants.nih.gov/grants/funding/ac_search_results.htm?text_curr=p01)
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la difusión de las células de cáncer de próstata (CaP) a la médula ósea es un evento temprano en el proceso de la enfermedad CaP [1, 2]. En muchos casos, estas células tumorales diseminadas (DTC) proliferan para formar metástasis activas después de un período prolongado de enfermedad indetectable después de la prostatectomía. Este período de latencia se refiere a menudo como la latencia del tumor. Hasta la fecha, la latencia sigue siendo un reto clínico importante, ya que los pacientes con CaP presentados con metástasis óseas en última instancia, dejan de responder a las terapias de segunda línea y, finalmente sucumben a la enfermedad. Por lo tanto, se ha vuelto de suma importancia para determinar los mecanismos de la latencia del tumor en un esfuerzo para prevenir la recurrencia CaP
.
A de células tumorales inactivas no proliferan activamente, sin embargo, tiene el potencial para multiplicar dadas las señales externas adecuadas. Según esta definición, múltiples escenarios podrían inducir potencialmente la latencia, incluyendo microambiente tumoral desfavorable, el hambre de nutrientes, la naturaleza inherente de la DTC, o cambios epigenéticos causados por el microambiente [2, 3]. Sin embargo, no todos los casos de CaP indolente constituyen necesariamente latencia. Un paciente puede tener simplemente las células tumorales de crecimiento lento que residen en el lugar de la metástasis en el momento del tratamiento inicial y la experiencia recurrencia poco después. Otros pueden no experimentar recurrencia, mientras que un subconjunto de los pacientes experimentan recurrencia sólo después de períodos prolongados. Hasta la fecha, los mecanismos de latencia siguen siendo en gran parte desconocido. Sin embargo, el activador uroquinasa de plasminógeno (uPA) y su receptor asociado (uPAR) se han implicado en la regulación de la latencia en varios tipos de cáncer. Específicamente, los niveles altos de uPA y uPAR inducen la latencia de escape upregulating relación de ERK /p38 en células de cáncer [4, 5]. Esta alta expresión uPAR se asoció con la activación de α
vβ
1 integrina, lo que resulta en el crecimiento tumoral [4-7]. En un estudio separado, la migración de uPA regulada de células tumorales fue activado por la cadena ligera de la miosina kinasa (MLCK) [8], que la fosforilación de ERK fue inducida por [9]. MLCK es un regulador conocido de la contractilidad, la motilidad y la adhesión [10, 11], sin embargo, el papel de MLCK en el CaP de escape latencia sigue siendo desconocido.
Matrix y adherencias intercelulares ha sido implicado en la regulación de la latencia del tumor. Los estudios demostraron que la integrina mediada por la adhesión celular a la matriz extracelular activa MAPKs [12-14], que regula el crecimiento del tumor [15 a 19]. En PCa, la regulación positiva de β
1 integrina promueve el crecimiento y la invasión de las células [3, 20], y las interacciones entre el tumor y el estroma puede ser atribuible a la fuga de células latentes de la radioterapia [21]. Estudios recientes que analizan las líneas celulares de CaP humanos en el estroma de la médula ósea de ratón han identificado factores importantes en el nicho hematopoyético del ratón que regulan la latencia [22, 23].
Estamos aquí, caracteriza la latencia y crecimiento de tres xenoinjertos derivados de pacientes con CaP (PDXs) que se establezcan desde metástasis obtenidas en la autopsia rápida o cirugía en microambiente de la médula ósea humana
in vitro
. Estos PDXs (Lucap 86.2, 92 y 93) muestran
in vitro quiescencia Hoteles en condiciones típicas de cultivo celular que puede representar la latencia y que tuvo como objetivo identificar el papel de la adhesión célula-célula en la liberación de CP a partir de la latencia en las un contexto de médula ósea humana. Se determinó que el contacto célula-célula tumoral en el estroma de la médula ósea es necesaria para que las células proliferen LuCaP PDX
in vitro Opiniones y se asoció con una regulación a la baja universal de TGFB2. Por otra parte, LuCaP PDXs reactivación de latencia podría ser recapitulado mediante la activación constitutiva y MLCK quinasa dependiente de ciclina 6 (CDK6).
Materiales y Métodos
disociación, el aislamiento y la cultura de LuCaP PDX
in vitro
la médula ósea células del estroma (BMSC) que fueron aisladas de un paciente con metástasis óseas PCA (BM2508) se sembraron a 50.000 células /cm
2 durante la noche. El día siguiente, las células BM2508 fueron tratados con 10 mg /ml de mitomicina C (Sigma, St Louis, MO) durante 1 hora. LuCaP PDXs que se pasaron
in vivo
como se describe anteriormente [21] fueron extirpados y se disociaron usando el kit de tumor humano disociación Miltenyi (Miltenyi Biotec Inc., San Diego, CA;#130-95-929) y rutinariamente enriquecida por selección positiva utilizando microperlas magnéticas contra EpCAM antígeno epitelial humano /CD326 (Miltenyi Biotec Inc .;#130-061-101) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. células LuCaP PDX se siembran a continuación en la parte superior de las células BM2508 en cualquiera de 50.000 células /cm
2 (G; creciente /proliferación) o 50 células /cm
2 (NG; no creciente /inactivo). En el día 8, las células fueron diferencialmente LuCaP PDX tripsina y se enriquecen con la selección positiva y negativa con perlas magnéticas, etiqueta fluorescente para EpCAM /CD326 y arrancó de forma individual con un micromanipulador como se describe anteriormente [24]. Además, para garantizar que las células NG eran inactivos en lugar de senescente, un ensayo de β-galactosidasa (Pierce Biotechnology, Inc., Waltham, MA;#75707) se realizó en todas las células GN LuCaP PDX de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todos los procedimientos que involucran seres humanos fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Washington Medical Center y todos los sujetos firmaron el consentimiento informado. El estudio en animales fue aprobada específicamente por la Universidad de Cuidado de Animales Institucional y Uso Washington y todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices del NIH.
tinción de inmunofluorescencia
se disociaron las células LuCaP PDX , seleccionado y se sembraron como se describió anteriormente en cubreobjetos de vidrio conjugadas con lisina. En el día 8, las células se fijaron con metanol enfriado con hielo, se bloquearon con suero de caballo-cabra-pollo 5% y se tiñeron para EpCAM y Ki67 o
1 integrina usando un anticuerpo Ber-EP4 anti-humano monoclonal de ratón conjugado con FITC ( DAKO, Carpinteria, CA; F086001), y un anticuerpo policlonal de conejo anti-humana Ki-67 anticuerpo (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX; SC-15402) o un anticuerpo ITGB1 anti-humano policlonal de conejo (Santa Cruz Biotechnology; SC-