Extracto
Cytoglobin es un globina intracelular de función desconocida que se expresa principalmente en las células de un linaje de miofibroblastos. Las posibles funciones de cytoglobin incluyen almacenamiento en búfer de oxígeno intracelular y la desintoxicación de especies reactivas del oxígeno. Trabajo previo en nuestro laboratorio ha demostrado que cytoglobin protege contra el daño oxidante del ADN inducida cuando se sobreexpresa
in vitro
, pero la importancia de esto en los modelos más fisiológicamente relevantes de la enfermedad es desconocida. Cytoglobin es un candidato para el tylosis con el gen del cáncer de esófago, y su expresión es fuertemente reducido regulado en biopsias esofágicas no cancerosas de pacientes con TOC en comparación con las biopsias normales. Por lo tanto, las células esofágicas proporcionan un modelo experimental ideal para probar nuestra hipótesis de que la regulación negativa de la expresión cytoglobin sensibiliza las células a los efectos dañinos de las especies de oxígeno reactivo, daño en el ADN en particular oxidativo, y que esto podría contribuir al fenotipo TOC. En el presente estudio, hemos probado esta hipótesis mediante la manipulación de cytoglobin expresión en ambas líneas celulares de cáncer de esófago y normales, que tienen fisiológica normal y sin expresión de cytoglobin respectivamente. Nuestros resultados muestran que, de acuerdo con los resultados anteriores, más de expresión de cytoglobin en líneas celulares de cáncer de la protección que ofrece contra el estrés oxidativo inducido químicamente, pero esto sólo se observó a concentraciones no fisiológicas de cytoglobin. Además, en la regulación de cytoglobin en las células esofágicas normales no tuvo efecto en su sensibilidad al estrés oxidativo tal como se evaluó por un número de puntos finales. Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que las concentraciones fisiológicas normales de cytoglobin no ofrecen citoprotección de especies reactivas del oxígeno, al menos en el modelo experimental actual
Visto:. McRonald FE, Riesgo JM, NJ Hodges (2012) Protección contra el estrés oxidativo intracelular por Cytoglobin en normales y células cancerosas del esófago. PLoS ONE 7 (2): e30587. doi: 10.1371 /journal.pone.0030587
Editor: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 11 de noviembre de 2011; Aceptado 22 de diciembre de 2011; Publicado: 16 de febrero 2012
Derechos de Autor © 2012 McRonald et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Cancer Research UK proyecto de subvención C7738 /A10476. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Cytoglobin es un miembro de la familia de globina de hemoproteínas que incluyen la hemoglobina y la mioglobina, así como la neuroglobina identificado más recientemente que se expresa principalmente en las células del sistema nervioso central [1]. La estructura cristalina de cytoglobin ha sido resuelto y estudiado en detalle [2], [3], [4] que muestra que cytoglobin tiene muchas similitudes con otros globinas, incluyendo los tres más de tres alfa pliegue globina helicoidal clásico y un P
O2 (afinidad por el oxígeno) de aproximadamente 0,2 Torr, similar a la de la mioglobina [por ejemplo, 5], [6]. La alta afinidad de cytoglobin para el oxígeno ha llevado a la sugerencia de que cytoglobin puede servir como un sistema de transporte de oxígeno "intracelular". En este escenario, se propone cytoglobin para suministrar oxígeno a la mitocondria para sostener la fosforilación oxidativa, de una manera similar a la función de la mioglobina en las células musculares. Curiosamente, afinidad por el oxígeno parece ser-redox sensible, y regulado por la formación de un puente disulfuro entre dos residuos de cisteína (Cys externos B2 y Cys E9). La naturaleza sensible a redox de la afinidad de oxígeno cytoglobin sugiere un posible papel de cytoglobin como un oxígeno "sumidero /reserva", mediante el cual el oxígeno sólo se libera cuando las células se vuelven hipóxica. Aunque estos son hipótesis atractivas, cytoglobin expresión parece estar limitado en gran parte a las células de un origen de fibroblastos con ninguna correlación aparente entre la actividad metabólica de los tejidos y niveles de expresión cytoglobin que, en cualquier caso, es más bien baja en la mayoría de tipos de células investigadas [7] , [8]. Estos hallazgos han llevado a la búsqueda de la función fisiológica alternativa (s) para cytoglobin.
Cytoglobin fue identificado por primera vez en 2001 [9] en una pantalla proteómico de las células estrelladas hepáticas aisladas de tejido fibrótico de hígado de rata y de hecho fue originalmente llamada proteína de la asociación de activación de las células estrelladas (STAP) en reconocimiento de este hecho [9]. Los trabajos posteriores - tanto
in vitro
y
in vivo
[10] - [13], y más recientemente el uso de animales transgénicos que sobreexpresan cytoglobin [14], [15] parecen confirmar que cytoglobin desempeña un papel en la respuesta fibrótica en un número de órganos, incluyendo el hígado y el riñón. Aunque la función precisa de cytoglobin en la fibrosis queda por establecer, pertubation de la homeostasis redox es una característica bien caracterizado de la fibrosis y existe una buena evidencia (en particular con respecto pulmón y riñón) que la progresión de las lesiones fibróticas implica ciclos de la lesión por reperfusión oxidativo posterior a hipoxia tisular. Además, se ha demostrado que la expresión cytoglobin puede upregulated por hipoxia [16] - [19]. Por lo tanto, parece probable que cytoglobin está implicado en la respuesta adaptativa asociada a esta lesión.
En cuanto a los resultados en la enfermedad fibrótica, también hay un cuerpo de evidencia emergente mecanicista para sugerir que cytoglobin puede ofrecer una protección de oxidativo celular lesión en otras circunstancias, posiblemente como resultado de su capacidad para eliminar las especies reactivas de oxígeno [20] - [23]. De hecho, el trabajo en nuestro laboratorio ha demostrado que la sobreexpresión de cytoglobin reduce los niveles de especies reactivas de oxígeno químicamente inducida (ROS) y ofrece protección contra lesiones inducidas pro-oxidante (peroxidación lipídica y oxidativos roturas de la cadena de ADN) [24]. En apoyo adicional para un papel en la destoxificación de ROS, se ha informado que tiene actividad peroxidasa cytoglobin [9]. Curiosamente, más recientemente se ha informado de que cytoglobin férrico tiene actividad pseudo-peroxidasa contra los lípidos, lo que sugiere que, en condiciones de estrés oxidativo, la rotación de las moléculas de señalización celular basado en lípidos también pueden ser parte de una respuesta antioxidante cytoglobin dependiente de [25]. Además, otro globina vertebrado, globina X, se ha encontrado para ser asociado a la membrana y, posiblemente implicados en la protección de los lípidos de la oxidación [26].
Curiosamente, además de las posibles funciones descritas anteriormente, el gen cytoglobin (
CYGB
) es también un candidato gen supresor tumoral [27], [28], [29] y hemos identificado
CYGB
como tylosis candidato con cáncer de esófago (
TOC
) de genes [30] - [33]. Aunque
CYGB
no está mutado en individuos tylotic [31], o en una serie de carcinomas de células escamosas del esófago esporádicos [34], hemos demostrado que su expresión está fuertemente downregulated en biopsias esofágicas no cancerosas de pacientes con TOC en comparación con biopsias normales [33].
CYGB
también es metilado y regulados a la baja en esófago esporádica, pulmón y cánceres de cabeza y cuello [27], [28], [33]. Recientemente, regulación a la baja de cytoglobin también se ha demostrado para promover la carcinogénesis inducida químicamente en el hígado de los roedores [35].
Hay pruebas convincentes de que el daño oxidativo al ADN (por ejemplo, desoxiguanosina 8-oxo), si no se repara, contribuye a la formación de mutaciones que se sabe que son importantes en la etiología de la carcinogénesis humana [36], [37]. Por lo tanto, la hipótesis de que la pérdida de expresión cytoglobin haría que las células esofágicas más susceptibles a los efectos dañinos de los ROS, y que esto contribuye al fenotipo observado de
TOC
. En el presente estudio se prueba esta hipótesis mediante la manipulación de cytoglobin expresión tanto en las células normales y las células epiteliales del esófago carcinoma de células escamosas del esófago, que tienen la normalidad fisiológica y sin expresión endógena de cytoglobin, respectivamente.
Resultados
Manipulación de expresión cytoglobin
en tiempo real RT-PCR mostró que el de células escamosas línea celular de cáncer de esófago TE-8 tiene muy bajos niveles endógenos de expresión CYGB (inferior al 10
-5 con respecto a la beta actina (ACTB)), mientras que los queratinocitos NE1 esofágicas normales expresan CYGB en aproximadamente 0,1 × ACTB. Este nivel natural de expresión en las células CYGB NE1 se consideró que el nivel fisiológico normal, ya que está dentro del mismo orden de magnitud que la observada en un panel de tejidos normales (datos no mostrados). expresión CYGB fue modulada en estas dos líneas celulares ya sea por transfección transitoria del gen (TE-8 células) o transitoria caída utilizando la interferencia de ARN (células NE1). Cytoglobin expresión es inducida artificialmente por aproximadamente 4 o 7 órdenes de magnitud en las células TE-8, y se redujo en aproximadamente cinco veces por siRNA desmontables en las células NE1 (Figura 1).
Los niveles de expresión CYGB, comparados a la expresión ACTB, fueron determinados por el tiempo real de RT-PCR en una muestra paralelo para cada ensayo cometa realizado. Por lo tanto, estos niveles de expresión se relacionan directamente con los datos del ensayo del cometa que se presentan en la Figura 3. Se muestra la media geométrica de todos los experimentos para ambas células TE-8 células (barras de color naranja) y NE1 (barras de color rosa).
Caracterización de las células
epitelio esofágico normal se ensayaron (TE-8) células (NE-1) y el cáncer del esófago para los niveles de estrés oxidativo utilizando el compuesto sensible a redox 2 ', 7'-diacetato dichlorodihydrofluorescein (H2DCF DA) en presencia y ausencia de butionina sulfoxamine (BSO).
los resultados indicaron que BSO fue capaz de inducir el estrés oxidativo en ambas líneas celulares TE-8 y NE1, con una respuesta dependiente de la concentración siendo evidente (Figura 2). En las células TE-8, esto alcanzó significación estadística en las células no manipulados (p = 0,0134) y CYGB células transfectadas (p = 0,0034), pero no en células transfectadas de manera simulada (p = 0,092). Sin embargo, se observó una tendencia similar en las células transfectadas simuladas. En la línea celular del esófago normal, NE1, se obtuvieron resultados similares: en este caso la respuesta al estrés oxidativo dependiente de la concentración BSO fue estadísticamente significativa en los tres grupos de células. BSO fue capaz de inducir el estrés oxidativo en células de control (p = 0,0032), las células tratadas con ARNsi de control negativo (p = 0,0283), y las células sometidas a siRNA desmontables de CYGB (p = 0,0077). Aunque una tendencia se observó en TE-8 células hacia la sobreexpresión de CYGB estando asociado con menores niveles de ROS en comparación con las células transfectadas de manera simulada, esto no fue estadísticamente significativa. No se observó efecto de CYGB caída en células NE1. Sin embargo, como nuestra pregunta principal era mirar el daño del DNA asociada a ROS, y no con el estrés oxidativo
per se
, A continuación realizó el ensayo cometa en las dos líneas celulares: esto tiene el beneficio adicional de ser un tanto indicador más sensible del daño oxidativo celular
el estrés oxidativo se midió en un:. TE-8 y B: células NE1. La mediana de la fluorescencia DCF es la media de 5 repeticiones. Todos los valores se normalizaron al nivel observado en las células de control sin BSO. Las barras de error representan SEM + 2020:. reactivo de transfección única; + CYGB: células transfectadas con CYGB larga duración; siRNA -ve: revuelto de control; CYGB k /d: CYGB siRNA. * La respuesta estadísticamente significativa dependiente de la concentración (p & lt; 0,05) ** respuesta estadísticamente significativa dependiente de la concentración (p & lt; 0,01) guía empresas
Relación entre el daño oxidativo del ADN y la expresión cytoglobin
Comet. ensayo.
TE-8 células, expresión CYGB fue restaurada artificialmente mediante transfección transitoria (Figura 1). daño oxidativo del ADN se midió por el ensayo cometa en las células con dos diferentes niveles de expresión CYGB, además de los controles de línea de base: artificialmente alta sobreexpresión (aproximadamente 10
2 veces con respecto a la expresión ACTB) y baja (más o menos fisiológica) expresión (aproximadamente 10
-1 veces con respecto a la expresión ACTB). En artificialmente altos niveles de expresión CYGB, se observó una reducción significativa en el daño oxidativo del ADN en condiciones de estrés oxidativo exógeno (1,000 M BSO) (p = 0,014) en comparación con las células falsamente transfectadas (Figura 3a) Hubo también una diferencia significativa en el daño oxidativo del ADN entre las células con CYGB bajos niveles de expresión /fisiológicos y alta (p = 0,035). Sin embargo, no hubo diferencias significativas entre las células transfectadas de manera simulada y aquellos con niveles de expresión fisiológicos /CYGB bajas (p = 0.074); Del mismo modo no se observó ninguna diferencia entre el control y las células transfectadas de manera simulada (p = 0,455). Estos datos sugieren que CYGB ejerce un efecto protector contra el daño oxidativo celular sólo a artificialmente alto - niveles no fisiológicos de expresión. A pesar de que, intuitivamente, hubo una tendencia hacia el aumento de daño oxidativo del ADN cuando CYGB se expresó en niveles bajos /fisiológicas, esta tendencia no alcanzó significación estadística. En NE1 células, reducción de la expresión CYGB en un 90% por ARN de interferencia no dio lugar a ninguna diferencia en el daño oxidativo del ADN: esto apoya el argumento de que CYGB sólo se ejerce sus efectos citoprotectores en artificialmente altos (no fisiológica) los niveles de expresión (figura 3b)
hebra de ADN-breaks (línea de base y de oxidación-daño inducido) se midieron mediante el ensayo cometa modificada-FPG en una:. TE-8 y B: células NE-1 con diferentes niveles de expresión CYGB (como se muestra en la Figura 1). Media de mediana intensidad ciento cola del cometa se muestra. Las barras de error representan SEM. * Significativamente diferente el uno del otro (p & lt; 0,05).#Significativamente diferente entre sí (p & lt; 0,05).
citoglobina y las llamativas motilidad celular
Estudios anteriores han demostrado que las influencias cytoglobin la motilidad celular y la capacidad de colonias [29] formando, sin embargo, en el estudio actual no se detectó ningún efecto de la caída cytoglobin sobre el crecimiento celular, ya sea en los queratinocitos esofágicas NE1 o CCD-18Co miofibroblastos de colon, en cualquiera de 25 o 50 horas después de la herida (datos no mostrados).
Discusión
el trabajo previo en nuestros laboratorios y otros ha demostrado que cytoglobin tiene el potencial para desintoxicar especies reactivas del oxígeno (ROS)
in vitro
cuando se sobreexpresa en diversos sistemas de cultivo de células [20], [21], [22 ], [24]. Además, la regulación por disminución de cytoglobin por RNAi también ha sido recientemente demostrado que sensibilizar a las células de glioma con el estrés oxidativo, inducido por tanto la inhibición de la cadena de transporte de electrones con antimicina A, y la radiación [23] ionizante. Más apoyo para un papel para cytoglobin en la desintoxicación de ROS es la evidencia bioquímica de que la proteína cytoglobin posee actividad peroxidasa intrínseca, así como propiedades antioxidantes y hay evidencia de que otros globinas incluyendo neuroglobina y globina X también pueden tener propiedades similares [20], [ ,,,0],26], [38], [39]. Sin embargo, en el caso de cytoglobin, sigue siendo incierto si este es una verdadera función fisiológica de cytoglobin o un artefacto de los modelos experimentales utilizados. Hasta la fecha, no "cytoglobin reductasa" se ha identificado que podría reducir la Fe
3+ nuevo a Fe
2 +, por lo que no está claro cómo cytoglobin oxidados se recicla dentro de las células. También hay evidencia de que cytoglobin tiene actividad catalítica contra las especies reactivas de nitrógeno óxido nítrico, catalizando su conversión a nitrato, donde el ascorbato y el citocromo b (5) han sido identificadas como fuentes potenciales de reducción de la potencia [40]. Esta actividad putativa se correlaciona bien con la observación de niveles elevados de expresión cytoglobin en los fibroblastos y las células musculares lisas de la vasculatura, en donde el óxido nítrico es un conocido de señalización molecular que media el tono vascular [41]. Sin embargo, otros estudios han cuestionado si dioxigenasa óxido nítrico es una actividad enzimática fisiológicamente relevante de cytoglobin [42]. Además, también está emergiendo
in vivo
evidencia de un papel protector de cytoglobin (y neuroglobina) contra el estrés oxidativo, especialmente en modelos de fibrosis que implican reperfusión hipóxica y el daño oxidativo posterior [10] - [15] .
la mayor parte de estos datos se han generado en modelos experimentales en los que se expresa cytoglobin exceso de, por lo que aunque se trata de conclusiones interesantes, su relevancia fisiológica sigue siendo poco clara. En el presente estudio, se investigó si cytoglobin expresión podría ofrecer una protección de químicamente inducida por el daño oxidativo del ADN en las células cultivadas esofágicas. Esto es particularmente pertinente porque
CYGB
es el regulado en tanto tylosis con cáncer de esófago y cáncer esofágico esporádicos [33] y por lo tanto la hipótesis de que la pérdida de expresión cytoglobin sería sensibilizar a estas células al daño del ADN y que esto puede estar implicado en la etiología del cáncer de esófago. Cuando cytoglobin se sobreexpresa en TE-8 líneas celulares de cáncer de esófago, que tienen poca o ninguna expresión endógena cytoglobin, en consonancia con los estudios anteriores se observó una protección estadísticamente significativa del daño oxidativo del ADN inducida por la BSO como se evaluó por el ensayo cometa modificada-FPG. Este efecto, sin embargo era dependiente de la concentración: a niveles inferiores de sobreexpresión cytoglobin se perdió el efecto protector. En consonancia con esto, desmontables de los niveles fisiológicos de cytoglobin en cultivos de células esofágicas NE1 primarios no sensibilizarlos a daño oxidativo del ADN inducida por la BSO tal como se evaluó por el mismo punto final. Curiosamente, se ha informado recientemente que desmontables de expresión cytoglobin en células de glioma por RNAi eleva los niveles de antimicina inducida por peróxido de hidrógeno [23]. En el presente estudio, se observó ninguna diferencia significativa en los niveles de estrés oxidativo inducido por la BSO como se evaluó mediante la oxidación de diclorofluoresceína. La razón de esta diferencia no está clara, pero puede estar relacionado con cualquiera de los diferentes línea celular o un método para inducir el estrés oxidativo.
Nuestros hallazgos sugieren que aunque la inducción de la expresión cytoglobin, por ejemplo como resultado de la hipoxia o en respuesta a la lesión oxidativa, tiene el potencial de ser de protección, en nuestro estudio, esto sólo fue observado en los niveles CYGB probable que se logre
in vivo
. Además, no hubo evidencia de un aumento de la sensibilidad a ROS siguiente desmontables de RNAi en células que expresan cytoglobin a niveles fisiológicos. Por lo tanto, un papel citoprotector contra el daño del ADN inducido por oxidación no parece ser una función de cytoglobin en las células esofágicas y otras explicaciones de la función cytoglobin y la pérdida de expresión en este modelo de enfermedad son obligatorios.
Materiales y Métodos
cultivo de células
normal células epiteliales del esófago (NE-1, un regalo del profesor GSW Tsao, Departamento de Anatomía de la Universidad de Hong Kong (ver [43]) se mantuvieron en T
75 frascos de cultivo de queratinocitos utilizando suero medios de comunicación libres (Gibco) suplementado con extracto de pituitaria bovina (25 mg ml
-1) y el factor de crecimiento epidérmico recombinante (0,15 ng ml
-1). Los cultivos se dividieron de manera rutinaria 01:03 aproximadamente cada 3-4 días usando tripsina-EDTA y el inhibidor de tripsina de soja (Gibco) según el protocolo recomendado para el medio libre de suero de queratinocitos. la línea celular de cáncer de esófago TE-8 (un regalo del profesor Toshio Kudo, célula Centro de recursos para la Investigación Biomédica , Tohoku University, Japón, [44]) se hizo crecer en T
75 frascos de cultivo con medio RPMI suplementado con 10% de FBS y 2% de L-glutamina. se dividieron según sea necesario TE-8 células usando un protocolo de tripsina-EDTA estándar. CCD-18Co miofibroblastos de colon (adquirido de ATCC producto no: CRL-1459; [45]) fueron cultivadas en DMEM supplememented con 10% de FBS, 1% de L-glutamina y aminoácidos no esenciales al 1% (NEAAs). Se derramaron como sea necesario estas células utilizando un protocolo estándar de tripsina-EDTA.
Cytoglobin caída
NE-1 células o células CCD-18Co se subcultivaron en seis pocillos (para ensayo cometa) o placas de doce pocillos (para el ensayo de ROS y el ensayo de curación de heridas), y se dejó llegar a 60 a 70% de confluencia antes de la transfección. Las células fueron transfectadas con 25 nM concentración final de un control negativo revueltos siRNA (Ambion; AM4611) o CYGB siRNA (Qiagen; SI03228323 o Ambion; s41571) usando 15 mg ml
-1 reactivo TransIT siQuest (Mirus Bio) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de RNAi desmontables, las células fueron incubadas durante 42 horas antes de la realización de experimentos (24 horas en el experimento de curación de heridas). Expresión de CYGB fue ensayada por RT-PCR (véase más adelante).
sobreexpresión de cytoglobin
TE-8 células de carcinoma de células escamosas esofágicas se subcultivaron en placas de seis o doce pocillos como anteriormente. La transfección transitoria de
CYGB
se logró con Tránsito 2020 reactivo de transfección (Mirus Bio) (2 l ó 5 l por pocillo de 12 pocillos o placas de 6 pocillos, respectivamente), y la longitud total
CYGB
clon de ADNc en un vector pCMV6-AC (Origene) (0,6 mg o 1,5 mg de 12 pocillos o placas de 6 pocillos, respectivamente), según el protocolo estándar para el reactivo de transfección. Después de la transfección, las células se incubaron durante 42 horas antes de la realización de experimentos. Expresión de CYGB fue ensayada por RT-PCR (véase más adelante).
extracción de RNA, síntesis de la primera cadena de ADNc y el análisis de RT-PCR
Aislamiento de RNA total se realizó utilizando un Minikit RNeasy ( Qiagen) con la lisis directa de las células en la placa de cultivo, y la homogeneización utilizando tubos QIAshredder. La transcripción inversa se realizó utilizando un Kit RETROscript (Ambion) con, oligo dT y 1 g de ARN total, según las instrucciones del fabricante. Para RT-PCR se preparó una mezcla maestra que contiene TaqMan 2 × mezcla maestra (Applied Biosystems), sonda VIC /MGB β-actina para el control endógeno (Applied Biosystems 4326315E), CYGB imprimación y la mezcla de sondas (sentido 5'-CTC TAT GCC AAC TGC GAG GAC-3 ', anti-sentido 5'-AAC CTG TGG TTG AAG TAC TGC-3' y la sonda FAM-5'-TGG CCA TCC TGG TGA GGT TCT TTG agujero TG-3'-negro extintor) en RNasa agua exento. Un protocolo estándar de dos pasos se empleó para análisis en tiempo real de RT-PCR (50 ° C durante 2 minutos, seguido de 50 ciclos de 95 ° C durante 15 minutos y 60 ° C durante 1 minuto). Los valores de ciclo umbral (Ct) obtenidos se utilizaron para calcular el valor de cuantificación en tiempo real (RQ) utilizando el método ΔΔCt, con valores de Ct ACTB y las células no tratadas /untransfected utilizados como los factores de normalización.
FPG modificado cometa ensayo
El método se basa en el de Singh et al [46], con modificaciones menores [47]. Después del tratamiento, las células se lavaron en PBS frío y suavemente raspó en 1 ml de PBS fresco (TE-8 células) o (células NE1) tripsinizadas. Después de la centrifugación (8000 rpm, 5 minutos) sedimentos se resuspendieron en PBS (150 l). Una alícuota de células resuspendidas (30 l) se colocó en un tubo estéril que contiene agarosa de bajo punto de fusión (300 l) y esta suspensión de células se transfirió a dos portaobjetos de microscopio de vidrio (150 mu l por portaobjetos), pre-recubierto con 0,5% agarosa normal de punto de fusión. se añadieron cubreobjetos de vidrio y se desliza colocan en una bandeja de metal sobre hielo durante 10 minutos. Los cubreobjetos se retiraron y las diapositivas se incubaron durante 1 h a 4 ° C en tampón de lisis (2,5 M NaCl, 0,1 M Na
2EDTA, la base de Tris 10 mM, 1% N sodio - lauril sarcosinato, 10% de DMSO y 1% de Triton X -100). Los portaobjetos se lavaron (3 x 5 minutos) con FPG Buffer (HEPES 40 mM, 0,1 M KCl, 0,5 mM de EDTA 0,2 mg /ml de seroalbúmina bovina pH 8,0) y se incubaron con 1 unidad de enzima FPG (Trevigen) en 50 l de tampón de FPG a 37 ° C durante 1 hora (portaobjetos de control se incubaron con tampón solamente FPG). Los portaobjetos se transfiere a un tampón de electroforesis que contiene tanque de electroforesis horizontal (NaOH 300 mM y mM Na 1
2EDTA, pH 13,0) y el ADN se dejó descansar durante 20 minutos. ADN se sometió a electroforesis (25 V, 0,8 V cm
-1, 20 minutos) y se desliza neutralizados por lavado (3 x 5 minutos) con tampón de neutralización (0,4 M Tris, ajustado a pH 7,5). Los portaobjetos se tiñeron posteriormente con SYBR Gold 50 l (Invitrogen, 10 × solución en tampón de neutralización).
Los portaobjetos se examinaron a 320 × magnificación utilizando un microscopio de fluorescencia (Zeiss Axiovert 10, Alemania), equipado con un 515 -560 nm de excitación de filtro y un filtro de barrera de 590 nm. Una cámara digital USB (Merlin, Allied Vision Technologies) recibió las imágenes, que fueron analizados utilizando un sistema de análisis de imágenes por ordenador Comet Assay IV personal (instrumentos perceptivos). Imágenes de cien núcleos seleccionados al azar fueron analizados por diapositiva. La medición de ADN por ciento cola (TD%) fue elegido para evaluar el grado de daño en el ADN ya que se ha demostrado que sufren mucho menos de la variación inter-ejecutar que otros parámetros de cometas, ya que es en gran medida independiente de la tensión de la electroforesis y tiempo de ejecución [48] . valores medios de tres experimentos independientes se analizaron mediante ANOVA y post-hoc de la prueba t de Student, según lo recomendado por Duez et al [49].
ROS ensayo
Especies reactivas del oxígeno se evaluaron midiendo la oxidación del colorante sensible al redox 2 ', 7'-diacetato dichlorodihydrofluorescein (H2DCF-DA). Después de la hidrólisis por esterasas intracelulares, la H2DCF resultante es incapaz de salir de la celda y luego se oxida por ROS para formar la molécula fluorescente DCF. El nivel de fluorescencia es proporcional al grado de estrés oxidativo en las células. Con el fin de inducir estrés oxidativo artificialmente, butionina sulfoximina (BSO), que inhibe el paso limitante de la velocidad en la síntesis de glutatión, se añadió a las células cultivadas durante 24 horas antes del experimento a 100 o 1000 M.
brevemente, tratamientos siguientes 2 ', 7'-diacetato dichlorodihydrofluorescein; se añadió (concentración final 10 mM de TE-8 células 1 M o 0,1 M para las células NE1) y las células se incubaron a 37 ° C durante 30 minutos en la oscuridad. Las células se separaron por tripsinización, se sedimentaron por centrifugación y se resuspendieron en PBS. la intensidad de fluorescencia de la muestra se analizó (canal FITC) utilizando una citometría de flujo FACScalibur ™ (Becton Dickinson) y el software Pro CellQuestTM (Becton Dickinson). Las células sin colorante fluorescente se utilizaron como un control negativo para corregir para el fondo de autofluorescencia.
Curación de Heridas Ensayo
NE1 células de queratinocitos esofágicas y CCD-18Co miofibroblastos de colon se cultivaron en placas de doce pocillos, y sometido a RNAi desmontables de CYGB como se describió anteriormente, utilizando tanto Ambion y Qiagen siRNAs a CYGB, y un control mezclado siRNA. Cada condición se repitió seis veces para cada línea celular. La capa de células se raspó en forma de cruz con una punta de pipeta estéril a las 24 horas post-desmontables. Las células se fotografiaron a las 1, 25 y 50 horas después de la herida usando una cámara digital USB. Las imágenes fueron analizados utilizando el software TScratch [50], que analiza las alteraciones en el porcentaje de área de la herida abierta (OWA).