Extracto
Antecedentes
BIRC6 es un miembro de los inhibidores de la proteína apoptosis (IAP) de la familia que se piensa para proteger una variedad de células cancerosas de la apoptosis. El principal objetivo del presente estudio fue investigar si BIRC6 juega un papel en el cáncer de próstata y podría ser útil como una nueva diana terapéutica.
Métodos
BIRC6 expresión en líneas celulares se evaluó mediante Western blot y en muestras clínicas mediante inmunohistoquímica de microarrays de tejidos. La importancia biológica de BIRC6 se determinó mediante la reducción de siRNA inducida de
BIRC6
expresión en células LNCaP seguido por ensayos funcionales.
Resultados
elevada expresión de la proteína se encontró en BIRC6 próstata líneas celulares de cáncer y muestras clínicas a diferencia de sus homólogos benigna. El aumento de expresión BIRC6 se asoció con los cánceres de Gleason 6-8 y la resistencia a la castración. Reducción de la expresión en las células LNCaP BIRC6 condujo a una marcada reducción en la proliferación de células que se asoció con un aumento de la apoptosis y una disminución en la formación de autophagosome. se encontró apoptosis inducida por doxorrubicina a ser acoplado a una reducción de la expresión de la proteína BIRC6.
Conclusión
Los datos sugieren un papel para BIRC6 en la progresión del cáncer de próstata y la resistencia al tratamiento, e indican para la primera el tiempo que el
BIRC6
gen y su producto son objetivos potencialmente valiosos para el tratamiento de los cánceres de próstata
Visto:. bajo CG, Luk ISU, Lin D, L Fazli, Yang K, Xu y, et al. (2013) Protein BIRC6, un inhibidor de la apoptosis: Papel en la supervivencia de las células del cáncer de próstata humano. PLoS ONE 8 (2): e55837. doi: 10.1371 /journal.pone.0055837
Editor: Kin Lau Mang, la Universidad China de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 16 Agosto, 2012; Aceptado: 2 Enero 2013; Publicado: 8 Febrero 2013
Derechos de Autor © 2013 Low et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyada por los Institutos canadienses de Investigación en Salud. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Los cánceres de próstata se presentan generalmente como tumores dependientes de andrógenos, susceptible al crecimiento de detención /apoptosis inducida por la terapia de ablación de andrógenos [1]. Aunque inicialmente eficaz, la ablación de andrógenos frecuentemente conduce al desarrollo de cáncer de próstata resistente a la castración (independiente de andrógenos), que generalmente es también resistente a otros tratamientos disponibles. Como tal, la resistencia a la castración comúnmente marca la forma en fase terminal del cáncer de próstata y es el principal obstáculo en la gestión de la enfermedad [1]. El desarrollo del cáncer de próstata resistente a la castración se asocia típicamente con un notable incremento en la resistencia a la apoptosis, un proceso de muerte importante para la acción de los fármacos [1] - [3]. resistencia a la apoptosis como resultado de la sobre regulación de genes anti-apoptóticos y sus productos se cree que es un factor clave en el desarrollo de la resistencia a la castración, así como la resistencia en general a los tratamientos contra el cáncer. Elucidar el papel de anti-apoptóticos genes /proteínas en la progresión del cáncer de próstata es, por tanto, puede dar lugar a mejoras en el tratamiento de la enfermedad refractaria.
Los inhibidores de la apoptosis de proteínas Se ha informado (IAP) de la familia para jugar un papel en la resistencia a la apoptosis en una variedad de líneas celulares de cáncer y se caracteriza por la presencia en las proteínas de una a tres copias de un dominio baculoviral IAP de repetición (BIR). Las IAPs se ha demostrado que se unen a e inhiben una variedad de factores pro-apoptóticos, por lo tanto suprimir eficazmente la apoptosis inducida por una amplia variedad de efectores, incluyendo agentes quimioterapéuticos y la irradiación [4]. El dominio BIR es esencial para la interacción del PAI con factores pro-apoptóticos, incluyendo las caspasas. Las caspasas son una familia de proteasas de cisteína-ácido específico-aspártico, presentes en una pro-forma que, una vez activada por medio de escisión, es responsable de la degradación de sustratos de muerte tales como poli-ADP-ribosa polimerasa (PARP) iniciando así la apoptosis. exfoliados caspasa-3 y PARP escindido se pueden detectar fácilmente por análisis de transferencia de Western y se usan comúnmente como marcadores de apoptosis [5].
La apoptosis se asocia a menudo con la autofagia, un proceso que implica la degradación lisosomal de los componentes propios de una célula [6]. Se trata de envases de proteínas y orgánulos dentro de autofagosomas, seguido de la fusión con lisosomas que conduce a la degradación de las proteínas y orgánulos. El papel de la autofagia en el desarrollo del cáncer y su tratamiento es complejo, ya que no hay evidencia de que la autofagia puede promover y suprimir el crecimiento del cáncer [7]. La inhibición de la autofagia por la ruptura de genes esenciales autofagia se ha demostrado que la promoción de la tumorigénesis y, por tanto, la autofagia puede tener un efecto supresor de tumor [8] - [11]. Sin embargo, existe una creciente evidencia de que la autofagia puede actuar como un mecanismo de supervivencia para las células del cáncer en respuesta a una amplia gama de tensiones, incluyendo el tratamiento con agentes contra el cáncer [7].
Para detectar la actividad de autofagia en células cultivadas , se utiliza a menudo de detección de transferencia de Western de LC3B-II. LC3B-II se asocia específicamente con autofagosomas y niveles de LC3B-II se ha demostrado que se correlaciona con el número de autofagosomas dentro de las células [12] - [15]. Sin embargo, desde LC3B-II se degrada tras la fusión autofagosoma-lisosoma, niveles LC3B-II sólo ofrecen una instantánea del número de autofagosomas en las células en un punto del tiempo y no indican una regulación hacia arriba o hacia abajo-regulación de la autofagia en su totalidad [13], [15]. De acuerdo con ello, una disminución en el número de autofagosomas en una célula se puede producir por una disminución en la formación de autophagosome o un aumento en la degradación autophagosome. La detección de otras proteínas autofagia críticos como Beclin-1 puede ofrecer una mayor comprensión de la activación de la autofagia dentro de estas células. Esta proteína está implicada tanto en la activación de la autofagia vía de señalización y en la etapa inicial de formación autophagosome [12], [16]. Actualmente no hay evidencia que sugiere un papel para las IAP en la regulación de la autofagia en los seres humanos.
La proteína es BIRC6 a 528 kDa, una inusual gran miembro de la familia IAP. Se compone de un solo dominio BIR N-terminal y un dominio de ubiquitina-conjugación C-terminal (UBC); esta última tiene actividad quimérico E2 /E3 ubiquitina ligasa así como la actividad anti-apoptótica [17]. A través de su dominio BIR, BIRC6 es capaz de unirse a y la inhibición de caspasas activos, incluyendo las caspasas 3, 6, 7 y 9 y tales interacciones se ha demostrado que la base de la capacidad de BIRC6 para inhibir la cascada de caspasas y en última instancia la apoptosis [17]. A través de su dominio de la UBC, BIRC6 facilita la degradación proteasomal de las proteínas pro-apoptóticas caspasa-9 [18], SMAC /DIABLO [18], [19] y HtrA2 /OMI [17], [20]. BIRC6 también es un regulador crítico de la citocinesis y por lo tanto juega un papel importante en la proliferación celular [21].
La evidencia reciente apoya un papel extendido para BIRC6 en conferir resistencia a la apoptosis de las células cancerosas, como se indica por
in Los estudios in vitro con células de
gliomas [22], cánceres de pulmón [23], cánceres de cuello uterino [19], [21], [24], [25], fibrosarcomas [18], [24], los osteosarcomas [21] , cánceres de mama [24], [26] y el cáncer de colon [27]. En las células de cáncer de mama y de pulmón, la apoptosis desencadenada por la pérdida de la expresión BIRC6 se ha demostrado implicar la estabilización de p53 [23], [26]. BIRC6 expresión en muestras clínicas de cáncer se ha observado para el cáncer colorrectal [28] y la infancia
de novo
la leucemia mieloide aguda (LMA) [29]. En esta última expresión, elevado de
BIRC6
mRNA se asocia con una respuesta favorable a la quimioterapia y pobres tasas de supervivencia sin recaída [29]. Un papel para BIRC6 en cáncer de próstata, sin embargo, no se ha reportado.
elevaciones En el presente estudio, el análisis de las líneas celulares de cáncer de próstata humano y muestras clínicas mostraron un marcado en la expresión BIRC6 por las células /tejidos malignos como algo distinto de sus contrapartes benignas. En particular, el aumento de expresión BIRC6 se asoció con Gleason 6-8 tipos de cáncer y la resistencia a la castración. Además, caída inducida por ARNsi de BIRC6 condujo a una marcada reducción en la proliferación celular de células de cáncer de próstata LNCaP. Tomados en conjunto, los resultados sugieren que BIRC6 representa una nueva diana terapéutica para el tratamiento de cáncer de próstata refractario.
Materiales y Métodos
Materiales
Químicos, se obtuvieron disolventes y soluciones de Sigma-Aldrich Canadá Ltd., Oakville, ON, Canadá, a menos que se indique lo contrario.
cáncer de próstata clínico tejidos
las muestras se obtuvieron de los pacientes, con su consentimiento informado, siguiendo un protocolo aprobado por el Investigación clínica Junta de Ética de la Universidad de la Columbia británica y la BC Cancer Agency. microarrays de tejidos graduadas-Gleason (TMA) se utilizaron consiste en 35 muestras benignas de la próstata, 6 muestras de neoplasia intraepitelial prostática-y 157 especímenes de cáncer de próstata prostatectomía radical. Los especímenes de cáncer consistieron en 74 Gleason 6, 23 puntuación de Gleason 7, 43 Gleason 8, 2 Gleason 9, y la puntuación de 15 Gleason 10 tejidos que no habían sido sometidos al neo-adyuvante terapia hormonal y 10 tejidos de cáncer de próstata que habían sido sometido a la terapia hormonal neo-adyuvante y había progresado a la enfermedad resistente a la castración. Los últimos 10 tejidos tenían puntuación de Gleason de 8 (n = 6) y 10 (n = 4) antes de la terapia. Las muestras para la construcción TMA habían sido seleccionados al azar a partir de colecciones de próstata en el Centro de Vancouver, Vancouver General Hospital (suministrado por el Departamento de Patología de la Universidad de British Columbia, Vancouver, BC, Canadá). Preparación de tejidos y construcción TMA se realizaron como se describe [30].
Inmunohistoquímica
Se realizaron análisis inmunohistoquímicos como se describe [31] utilizando un anticuerpo policlonal de conejo anti-BIRC6 anticuerpo (Novus Productos Biológicos, Littleton, CO ; NB110-40730) a una dilución 1:100. Todas las secciones utilizados para inmunohistoquímica fueron contrastados con 5% (w /v) hematoxilina de Harris.
BIRC6 proteína que alcanzaron el
tinción BIRC6 de los tejidos fue evaluada por un patólogo y le da una puntuación de 0, 1 , 2 o 3, que representa ninguna tinción BIRC6, débil, moderada y fuerte intensidad de la tinción BIRC6, respectivamente. positividad por ciento (como una medida de la frecuencia de tinción) se calculó para cada grupo en función del número de secciones con intensidades de tinción de '1' o superior.
Líneas Celulares
celular de cáncer de próstata humano Seis líneas (LNCaP; PC3; PC3-M; DU145; C42; VCAP), dos líneas benignos prostáticos celulares (BPH1, RWPE1) y dos líneas celulares conocidas para expresar BIRC6 (OVCAR-8, HeLa) se mantuvieron en medio suplementado con FBS ( 10%), penicilina G (100 UI /ml) y estreptomicina (100 mg /ml) en un incubador humidificado a 37 ° C y 5% de CO
2 [22]. Las células cancerosas se cultivaron utilizando medio RPMI-1640, las células se cultivaron utilizando BPH1 DMEM, y las células de queratinocitos utilizando RWPE1-SFM (Gibco-BRL; Burlington ON, Canadá). Las líneas celulares se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Para determinar el efecto de la apoptosis en la expresión BIRC6 en las células LNCaP, 600.000 células se sembraron en placas de 6 pocillos y se incubaron durante la noche y después se incubaron con doxorrubicina (1 mg /ml).
Western Blotting
Los lisados celulares se prepararon usando tampón de lisis celular (NP-40, 0,5% de ácido desoxicólico de sodio 1%). Para la detección de BIRC6 (528 kDa), conjunto 10 g lisado celular se ejecuta en un de dos partes (5% y 12,5%) en gel de SDS-poliacrilamida. Se cortaron geles y BIRC6 se electrotransfirieron a una membrana de PVDF en tampón Tris (25 mM), glicina (191,5 mM), metanol (10%), SDS (0,05%), usando un aparato de transferencia semi-seco. Las membranas se probaron para BIRC6 con anticuerpo anti-BIRC6 policlonal de conejo (1:500; Novus Biologicals). Para la detección de PARP, caspasa-3, LC3B-I, II y LC3B-Beclin-1 expresión de la proteína, 5-15 g de lisado de células enteras se ejecutó en 10 o 12,5% en geles de poliacrilamida-SDS y, después de la transferencia de proteínas, membranas eran sondeado a través de conejo anti-PARP y anticuerpos anti-caspasa-3 (1:1000; Señalización celular, Beverly, MA), anticuerpos anti-conejo (LC3B 0.85:1000; Abcam, Cambridge, MA) y de conejo anti-Beclin-1 anticuerpos (1:1000; Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA). Actina o vinculina se utilizaron como controles de carga y detectados en las membranas utilizando anticuerpo de conejo policlonal anti-actina (1:2000; Sigma-Aldrich) y anticuerpo de ratón anti-vinculina. (1:3000; Sigma-Aldrich)
ARN interferente pequeño (siRNA) y Cell la transfección
siRNAs sintetizados por encargo Dharmacon (Lafayette, CO) y sabían que interviene
BIRC6
tenía las siguientes secuencias: siRNA-1, sentido, 5'- GUU-UCA-AAG-CAG-GAU-GAU-G-dTdT-3 '[23] y siRNA-2, sentido, 5'-CUC-AGG-AGA-GUA-CUG-CUC-A-dTdT-3' [ ,,,0],21]. No director siRNA (siGENOME no director Smartpool; Dharmacon) se utilizó como control. Para examinar el efecto de los siRNAs en la expresión de proteínas BIRC6, las células LNCaP se sembraron en placas de 6 pocillos en medio RPMI-1640 libre de antibióticos suplementado con suero bovino fetal (10%). Después de 24 h, las células se transfectaron con 100 nM siRNA en el reactivo Lipofectamine 2000 (Invitrogen; Burlington, ON) siguiendo las instrucciones del fabricante. control del vehículo y no la orientación siRNA se aplicaron a replicar cultivos celulares.
Viabilidad Ensayo MTT
Veinte y cinco mil células fueron sembradas por pocillo de una placa de 24 pocillos y se transfectaron con ARNsi-2 . A 0, 24, 48 y 72 h después de la transfección, 50 se añadió l de MTT (5 mg /ml) a cada pocillo y los cultivos se incubaron en un incubador humidificado a 37 ° C y 5% de CO
2 de 4 h . Quinientos l de solución de SDS al 20% y después se añadió a cada pocillo y se incubó durante la noche a temperatura ambiente en ausencia de luz. Las muestras (100 mu l) se transfirieron a placas de 96 pocillos. Se midió la absorbancia a 570 nm.
Ciclo Celular
La distribución del ciclo celular de las células LNCaP se determinó por citometría de flujo de yoduro de propidio (PI) células teñidas. Las células se cultivaron en RPMI-10 medio FBS% y posteriormente tratadas con
BIRC6
siRNA. Cuarenta y ocho horas después del tratamiento con ARNsi, las células se fijaron en un 70% de etanol y luego se almacenaron a 4 ° C durante la noche. Las células fijadas se lavaron una vez con PBS. Después de la centrifugación, las células se tiñeron con 10 ug /ml de yoduro de propidio (PI), 1 mg /ml de ARNasa y 0,1% de Triton X-100 durante 30 minutos en hielo. histogramas de ADN se obtuvieron mediante el análisis de 10.000 células. Se determinó la proporción de células en G1, S, y G2 + M del ciclo celular.
Anexina-V Ensayos
La apoptosis se midió mediante clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS) análisis con anexina -V conjugado con isotiocianato de fluoresceína (anexina-V-FITC) (BD Biosciences Pharmingen) para la apoptosis temprana y yoduro de propidio (PI) para fines de tinción apoptosis siguiendo el protocolo del fabricante. Las células se cultivaron en RPMI-10 medio FBS% y posteriormente tratadas con
BIRC6
siRNA. Cuarenta y ocho horas después del tratamiento con ARNsi, se recogieron las células, se lavaron con PBS frío y después se resuspendieron en 1X tampón de unión (BD PharMingen, San Diego, CA) a una concentración de aproximadamente 1 × 10
6 células /ml. Las suspensiones celulares (100 l; ~ 1 × 10
5 células) se transfirieron a nuevos tubos, y se añadieron alícuotas de PI 5 l Anexina V-FITC y 5 mL. Las células se incubaron en la oscuridad durante 15 min a 21 ° C. fluorescencia Anexina-FITC se midió en el canal FL1 (utilizando un filtro de paso de banda 530/30) y PI en el canal de FL3 (660/20 BP filtro de paso de banda de filtro). Se recogieron diez mil eventos. La apoptosis se evaluó contando el porcentaje de células AnnexinV-positivos. Los datos se muestran como media ± desviación estándar de la cultura triplicado.
Formación LC3-GFP puntos lagrimales Ensayo y cuantificación
células LNCaP fueron sembradas en cubreobjetos en placas de 6 pocillos y se transfectaron con 100 nM no objetivo siRNA o BIRC6 siRNA-2 al día siguiente usando Oligofectamine. Cuarenta y ocho horas después de siRNA transfección, las células fueron transfectadas con 3 g de LC3-GFP por pocillo por XtremeGENE (Roche) y las células se fijaron en 4% de paraformaldehído 27 horas después de la transfección. la formación de puntos lagrimales LC3-GFP se indujo 6 horas antes de la fijación por tratamiento con 10 uM cloroquina en medio libre de suero. Después de la fijación, los cubreobjetos se montaron con una solución de montaje DAPI. Fluorescente imágenes fueron tomadas con un microscopio confocal. La cuantificación de células autofágicos: células por autofagia se conoce como células que contienen más de 15 LC3-GFP puntos lagrimales. El porcentaje de células autofágicos se calculó como el número de células autofágicos dividido por el número de células positivas para GFP-LC3 × 100.
Análisis estadístico
El Student
t
alltests fue utilizado y los resultados con un
P-valor
. & lt; 0,05 se consideró significativo
resultados
elevada BIRC6 niveles de proteína en líneas celulares de cáncer de próstata humano
Western Blot reveló fuerte expresión de la proteína BIRC6 en todas las líneas celulares de cáncer de próstata examinados (Fig. 1). Por el contrario, sólo se detectaron bajos niveles de expresión de la proteína BIRC6 en líneas celulares de próstata benigna BPH1 y RWPE1. Moderado a fuerte expresión BIRC6 se detectó en las células Hela OVCAR8 y según lo informado por otros [17], [22]. Los resultados son representativos de tres experimentos independientes.
expresión de la proteína BIRC6 en las células malignas de próstata (carriles 1-6), control positivo células del cuello uterino y de ovario malignos (carriles 7-8) y células benignas de la próstata (carriles 9-10 ).
elevada BIRC6 niveles de proteína en el cáncer de próstata Gleason Marcados Los tejidos
secciones de tejido de próstata clínicos clínicos, morfológicamente clasificados en los tejidos benignos y los cánceres de Gleason 6-8 y 9-10 , se tiñeron y anotó para la expresión BIRC6. Positivo para la tinción citoplasmática BIRC6 era, en general, baja en el epitelio benigno, sustancialmente más intensa en bien diferenciado grado de Gleason 3 y más fuerte en pobremente diferenciado tejidos de cáncer de próstata Gleason 4 (Fig. 2A-D). Gleason 5 tejidos expresan generalmente niveles más bajos de BIRC6 tinción con respecto a los otros tejidos de cáncer de próstata, similares a los tejidos benignos. Secciones que contienen tanto tejido benigno y tejido de cáncer (Gleason grado 3) mostraron una fuerte tinción positiva BIRC6 en el epitelio maligno y expresión débil o ausente en el epitelio benigno (datos no mostrados). La media de intensidades de tinción de PIN fueron ligeramente elevados en comparación con el epitelio benigno, aunque no significativamente elevados (datos no mostrados). En el Gleason obtuvieron tejidos (Fig. 2E), expresión de BIRC6 fue baja para los tejidos benignos y aumentó de manera constante, alcanzando un máximo en la puntuación de Gleason 7 tipos de cáncer. La expresión en la puntuación de Gleason 8 tipos de cáncer fue menor y un nuevo descenso a niveles similares a los de los tejidos benignos fue visto por puntuación de Gleason de 9-10 ejemplares. Las intensidades de tinción de medias para cada grupo fueron 1,00 ± 0,80 S. D. para epitelio benigno y 1,53 ± 0,92 S.D. (
P = 3,24
× 10
-3) para la puntuación de Gleason 6, 2,22 ± 0,90 S. D. (
P
= 4,45 × 10
-6) para la puntuación de Gleason 7 y 1,60 ± 0,82 S. D. (
P = 1,63
× 10
-3) para la puntuación de Gleason 8 tejidos de cáncer de próstata. La intensidad de la expresión BIRC6 en la puntuación de Gleason de 9-10 tejidos de cáncer de próstata fue similar a la de los tejidos benignos (0,71 ± 0,47 S.D. .;
P
= 0,10). Además, la baja intensidad de la expresión observada en la puntuación de Gleason de 9-10 tejidos de cáncer de próstata era un reflejo de la gran proporción de generalmente débiles BIRC6 que expresan grado de Gleason 5 tipos de cáncer que se encuentran en este grupo.
A, flechas indicando citoplásmica débil tinción BIRC6 en las células luminales prostática benigna (puntuación de "1"). B, flechas que indican la tinción citoplasmática BIRC6 moderada en el grado 3 células de cáncer de próstata Gleason (puntuación de "2"). C, flechas que indican una fuerte tinción citoplasmática BIRC6 en grado de Gleason 4 células de cáncer de próstata (puntuación de "3"). D, flechas que indican debilidad de la tinción citoplasmática BIRC6 en grado de Gleason 5 células de cáncer de próstata (puntuación de "1"). E, barras negras representan la intensidad media de la tinción BIRC6 en el epitelio de próstata benigna (n = 35) y puntuación de Gleason 6 (n = 74), 7 (n = 23), 8 (n = 43) y 9-10 (n = 17) tejidos de pacientes con cáncer de próstata. Las barras grises representan la frecuencia de expresión BIRC6 (puntuación ≥1). Se observaron elevadas intensidades de tinción en la puntuación de Gleason 6 (*
P = 3,24
× 10-3), 7 (*
P
= 4,45 × 10-6) y 8 (*
P = 1,63
× 10-3) tejidos de cáncer de próstata en comparación con el epitelio prostático benigno. Las barras de error representan desviaciones estándar. M, barras negras representan la intensidad media de tinción BIRC6 en alto grado sin tratar (Gleason 8-10) tejidos de cáncer de próstata (n = 60) y el cáncer de próstata resistente a la castración (CRPC) los tejidos que se han desarrollado a partir de Gleason 8-10 cánceres siguientes neo terapia hormonal -adjuvant (n = 10). Las barras grises representan la frecuencia de expresión BIRC6 (puntuación ≥1). tejidos de cáncer de próstata resistente a la castración mostraron una media BIRC6 tinción intensidad significativamente mayor que los tejidos de cáncer de próstata de alto grado sin tratar (*
P = 1,38
× 10-3). Las barras de error representan las desviaciones estándar.
Gleason 6, 7 y 8 epitelio maligno más frecuentemente expresada BIRC6 (tinción puntuación de intensidad ≥1) que el epitelio de próstata benigna (Fig. 2E). Todos los tejidos malignos mostraron una alta frecuencia de expresión BIRC6 acoplado a una alta intensidad de BIRC6, a excepción de Gleason de 9-10 tejidos que mostraron una alta frecuencia de expresión BIRC6 acoplado a una intensidad media baja. Tomados en conjunto, los datos sugieren que la progresión del cáncer de próstata de benigno a una puntuación de Gleason 8 cánceres de próstata se asocia con elevaciones en la expresión de la proteína BIRC6.
elevada BIRC6 niveles de proteína en clínica del cáncer de próstata resistente a la castración tejidos
p
Muestras de tejido de cáncer de próstata de los pacientes (Gleason 8-10), que habían progresado a la resistencia a la castración después de la terapia hormonal neoadyuvante (n = 10) se tiñeron y se calificó para la expresión BIRC6 y se comparan con las secciones de los cánceres de próstata de alto grado (Gleason anotar 8-10) que no había sido sometido a la terapia hormonal neo-adyuvante (n = 60). La media intensidad de la tinción para BIRC6 fue significativamente mayor en los cánceres de próstata resistente a la castración que en los controles no tratados (2,30 ± 0,67 SD y 1,35 ± 0,84 SD respectivamente;
P
= 1,38 × 10
-3) (Fig . 2F). frecuencia de expresión BIRC6 era muy alta en ambos tipos de tejido. Los datos sugieren que el desarrollo de cáncer de próstata resistente a la castración se asocia con elevaciones en la expresión de la proteína BIRC6.
reducción de la expresión BIRC6 la viabilidad celular se cáncer de próstata y la proliferación
Se ha informado de que la reducción de expresión BIRC6 induce la apoptosis (por ejemplo, en células de cáncer de mama). Se utilizó la línea celular LNCaP para estudiar el efecto de reducción de la expresión BIRC6 sobre la viabilidad celular de cáncer de próstata. La incubación de las células LNCaP transfectadas con
BIRC6
-targeting siRNA-1 y -2 (carriles 3, 4, 7, 8, 11, 12) dieron como resultado una pérdida sustancial de proteína BIRC6, en comparación con las células tratadas con lipofectamina solamente (carriles 2, 6, 10), lipofectamina + no director siRNA (carriles 5, 9, 13) o ningún tratamiento (carril 1) (Fig. 3A). El efecto fue evidente después de 30 h de la transfección y se hizo más prominente a las 54 y 78 h. Se puede observar que las células transfectadas con lipofectamina solamente, o con lipofectamina + no director siRNA, mostraron un pequeño aumento en la expresión BIRC6, presumiblemente debido al vehículo. Todos desmontables experimentos posteriores se realizaron utilizando siRNA-2.
A, el tratamiento de cultivos de células LNCaP con siRNAs dirigidos BIRC6 conduce a la reducción de la expresión de la proteína BIRC6. expresión BIRC6 proteína en las células LNCaP no tratadas (carril 1; a 78 h) y en las células LNCaP incubadas con sólo lipofectamina (carriles 2, 6, 10), ARNsi-1 focalización BIRC6 (carriles 3, 7, 11), siRNA-2 focalización BIRC6 (carriles 4, 8, 12) o no la orientación siRNA (carriles 5, 9, 13) para 30, 54 y 78 h después de la transfección. Los resultados son representativos de tres experimentos independientes. B, el tratamiento de cultivos de células LNCaP con siRNA-2 focalización BIRC6 conduce a la proliferación celular reducida como se muestra mediante el ensayo de MTT. Los cultivos se trataron durante 30 h con únicamente o con lipofectamina plus o bien no la orientación siRNA o siRNA-2 focalización BIRC6 y luego lipofectamina se incubó durante 24, 48 y 72 h en medio fresco. El número de células relativas en los siRNA-2 cultivos fueron considerablemente inferiores a los de las culturas no-siRNA dirigidos tratados por el 2,85%, 10,78% y 25,88% a los 54, 78 y 102 horas, respectivamente. Las barras de error representan las desviaciones estándar.
Después de la transfección, el siRNA-2 cultivos transfectados mostraron una marcada reducción de la viabilidad celular en relación con los no destinados a cultivos tratados con siRNA (Fig. 3B). Por lo tanto la viabilidad de las células de siRNA-2 cultivos fue considerablemente menor que la de la respectivamente no director culturas siRNA tratados por 2,85%, 10,78% y 25,88% a las 54, 78 y 102 h,. Hubo una tendencia a que las células siRNA-2-tratada para formar estructuras similares a sincitios en el que grupos de células fueron acompañados por largas proyecciones de huso similares. Los resultados son representativos de dos experimentos independientes. También se examinó el efecto de silenciar BIRC6 en la progresión del ciclo celular. La caída de BIRC6 en las células LNCaP no dio lugar a cambios significativos en el ciclo celular (Fig. S1).
El efecto de la reducción de BIRC6 también se estudió en células PC-3 de cáncer de próstata. transfectadas células PC-3 similares a las células LNCaP, siRNA-2 mostraron una disminución significativa de la viabilidad celular en comparación con las células no objetivo siRNA tratados 72 h después de la transfección (Fig. S2).
reducción de la expresión BIRC6
induce la apoptosis e inhibe la formación autofagosoma
reducción BIRC6 induce la apoptosis en las células LNCaP como se demostró mediante tinción con anexina-V y immmunoblotting. Como se muestra en la Fig. 4A, hubo un aumento significativo de células positivas Anexina-V en las células siRNA-2 transfectadas (12,19% ± 1,9%) en comparación con no objetivo siRNA (3,65% ± 0,60%, p = 0,0104) y Lipofectamine células tratadas (3,55% ± 0,0447%, p = 0,0123). Consistente con los resultados del ensayo de Anexina-V, las células knock-down BIRC6 mostraron cambios marcados en la expresión de marcadores de la apoptosis (Figura 4B). Un aumento de la caspasa-3 escindida, PARP pérdida de longitud completa y un aumento de un PARP escindida se observaron en comparación con las células LNCaP transfectadas con la orientación no-siRNA (carril 3, 4). Curiosamente, se observó una disminución de longitud completa PARP después de la transfección de las células LNCaP con lipofectamina o no la orientación (control) siRNA (carriles 2, 4), que podrían haber sido causados por la degradación no específica de PARP de longitud completa sobre todo en las células LNCaP. La pérdida de PARP de longitud completa en estos controles no se asoció con un aumento correspondiente de PARP escindida y no se acopló a un aumento significativo de la caspasa-3 escinde, lo que indica que estos controles no dieron como resultado la inducción de la apoptosis.
a, la apoptosis de las células LNCaP transfectadas con Lipofectamine (Lipo), de metas de no control de siRNA (NT) o
BIRC6
siRNA2 y posteriormente se incubaron durante 48 h, tal como se evaluó por análisis de citometría de flujo de Anexina V /PI manchada Células. Sobre la base de los valores Q2 + Q3 (poblaciones de células apoptóticas),
BIRC6
siRNA aumentó notablemente la apoptosis de las células LNCaP en comparación con las células Lipo (p = 0,0104) o NT siRNA tratados (p = 0,0123). (Los datos son representativos de 3 experimentos independientes); B, el tratamiento de las células LNCaP con siRNA-2 focalización BIRC6 conduce a la activación de la caspasa-3 (como se muestra por la aparición de la caspasa-3 escindida) y la degradación de su sustrato, PARP (como se muestra por la pérdida de PARP de longitud completa y la apariencia de una producto de PARP escindida). células LNCaP no tratadas (carril 1); células LNCaP incubadas sólo con lipofectamina (carril 2), siRNA-2 BIRC6 focalización (carril 3) o no la orientación siRNA (carril 4) para 96 h después de la transfección. C, el tratamiento de células LNCaP con siRNA-2 focalización BIRC6 conduce a la disminución de Beclin-1 de expresión y la reducción de LC3B-II. células LNCaP no tratadas (carril 1); células LNCaP incubadas sólo con lipofectamina (carril 2), siRNA-2 BIRC6 focalización (carril 3) o no la orientación siRNA (carril 4) de 113 h después de la transfección. D, la formación autophagosome en células silenciadas-BIRC6 fue significativamente menor en comparación con las células tratadas con el control no director siRNA. Las células transfectadas con la orientación no-siRNA control (izquierda) mostraron más puntos lagrimales LC3-GFP que las células transfectadas con siRNA-2 focalización BIRC6 (derecha), que mostró una difusa expresión de GFP-LC3. E, reducido células LNCaP que expresan BIRC6 muestra significativamente menos células autofágicos (33,6%) en comparación con las células control (51%). autofágicos células se cuantificaron contando las células con más de 15 puntos lagrimales LC3-GFP en un microscopio confocal.
La transfección de células LNCaP con siRNA-2 (carril 3) dio lugar a marcados cambios en la expresión de marcadores de autofagia ( Fig. 4C). Una disminución de la proteína LC3B-II (forma lipidada de LC3-I) se observó con ningún efecto sobre los niveles de proteína LC3B-I, así como una disminución en Beclin 1-expresión de la proteína (en comparación con los controles; Lanes 1, 2, 4) . Por otra parte, la formación autofagosoma en las células BIRC6 silenciados fue significativamente menor en comparación con las células tratadas con la segmentación no ARNsi de control (
P = 0,036)
según lo revelado por la acumulación de puntos lagrimales LC3 fluorescente en el citoplasma (Fig. 4D, E) . Tomados en conjunto, los resultados muestran que la reducción de la expresión de la proteína en BIRC6 tratados con siRNA-2 LNCaP células da como resultado un aumento de la apoptosis y una disminución en la formación de autophagosome. Los resultados son representativos de tres experimentos independientes.
La apoptosis inducida por doxorrubicina en células LNCaP se asoció con una reducción en la expresión de la proteína BIRC6
La doxorrubicina, un fármaco utilizado para el tratamiento del cáncer de próstata [32], se ha informado de desencadenar la apoptosis junto con una marcada acumulación de p53 [33]. Para investigar el efecto de la apoptosis inducida por doxorrubicina sobre la expresión BIRC6 en las células de cáncer de próstata, se incubaron células LNCaP durante 24 h con o sin doxorrubicina (1 mg /ml). Como se muestra por análisis de transferencia Western, el tratamiento con doxorrubicina resultó en una reducción sustancial de la expresión BIRC6 (Fig. 5A). Además, hubo una reducción en la expresión de proteína de longitud completa PARP y un aumento de un PARP escindida, indicativo de apoptosis. Además, hubo una reducción de la densidad celular con evidencia de deterioro de las células (Fig. 5B). El tratamiento de células LNCaP con doxorrubicina mostró una reducción de la dosis y dependiente del tiempo de la expresión BIRC6 (Fig. S3). Para entender si la reducción BIRC6 era una causa o una consecuencia de la doxorrubicina inducida por la apoptosis, la expresión temporal de BIRC6 y PARP después se estudió el tratamiento con doxorubicina.