Extracto
La proteína arginina metiltransferasa 5 (PRMT5) desempeña múltiples funciones en un gran número de procesos celulares, y su localización subcelular se regula dinámicamente durante el desarrollo del ratón y la diferenciación celular. Sin embargo, poco se sabe de las diferencias funcionales entre PRMT5 en el citoplasma y en el núcleo PRMT5. Aquí, hemos demostrado que PRMT5 predominantemente localizada en el citoplasma de las células de cáncer de próstata. Los ensayos de localización subcelular diseñados para abarcar todo el marco de lectura abierta de la proteína PRMT5 revelaron la presencia de tres señales de exclusión nucleares (Ness) en la proteína PRMT5. PRMT5 y p44 /MED50 /WD45 /WDR77 co-localizan en el citoplasma, y ambos son necesarios para el crecimiento de células de cáncer de próstata de una manera dependiente de la actividad PRMT5 metiltransferasa. Por el contrario, PRMT5 en el núcleo inhibió el crecimiento celular de una manera independiente de la actividad metiltransferasa. Consistente con estas observaciones, PRMT5 localiza en el núcleo en el epitelio benigno de la próstata, mientras que localiza en el citoplasma en los tejidos premalignos de próstata y cáncer. Encontramos además que PRMT5 sola metilado tanto la histona H4 y proteínas SmD3 pero PRMT5 complejo con p44 y pICln metilados SmD3 pero no histona H4. Estos resultados implican un nuevo mecanismo por el cual PRMT5 controla el crecimiento celular y contribuye a la tumorigénesis de próstata
Visto:. Gu Z, Li Y, Lee P, Liu T, C Wan, Wang Z (2012) de la proteína arginina metiltransferasa 5 funciones de maneras opuestas en el citoplasma y núcleo de las células del cáncer de próstata. PLoS ONE 7 (8): e44033. doi: 10.1371 /journal.pone.0044033
Editor: Hari Koul, Universidad de Colorado, Estados Unidos de América
Recibido: 6 Febrero, 2012; Aceptado: August 1, 2012; Publicado: 27 Agosto 2012
Copyright: © Gu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por la subvención 1R01 DK065156 01 del Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y renales, United States National Institutes of Health (NIH) (a ZW), el Centro de Atención del cáncer (Core) CA16672 subvención del Instituto Nacional del cáncer , NIH para la Universidad de Texas MD Anderson Cancer Center, Centro de Urología por NYUSOM de la financiación de la excelencia de PL, y por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81171922) y Key Fondo de Investigación del Proyecto de Shaanxi Provincial de Ciencia y Tecnología Programa, China. (2008K27G01) a ZP. Sin financiación externa adicional fue recibida para este estudio. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
proteína arginina metiltransferasa 5 (PRMT5) es una arginina metiltransferasa proteína de tipo II que cataliza la dimethylation simétrica de residuos de arginina en las proteínas diana [1]. PRMT5 está altamente conservado entre levaduras, animales y plantas superiores y se ha implicado en diversos procesos celulares y biológicas, incluyendo la regulación transcripcional [2], [3], [4], ARN metabolismo [1], [5], la biogénesis de ribosomas 6], Golgi mantenimiento estructura aparato de [7], y la progresión del ciclo celular [2]. PRMT5 también está implicado en la formación de las células germinales, especificación y mantenimiento [8], [9], [10], [11], [12], [13]. En células de mamíferos, PRMT5 se localiza en el citoplasma y el núcleo, y se metila histona múltiple y proteínas no histónicas [1]. En el núcleo, PRMT5 se ha encontrado en los /SNF y nurd complejos de remodelación de la cromatina SWI [14], [15], donde methylates histonas, así como factores de transcripción /reguladores [2], [3], [4]. En el citoplasma, PRMT5 forma un complejo arginina metiltransferasa proteína 20S, denominado "methylosome", que consiste en proteínas Sm spliceosomal snRNP, PRMT5, pICln, y la proteína WD repetición (MEP50 /WD45) [16], [17], [18] . En este complejo, PRMT5 metilado proteínas Sm [16], [19], y dicha metilación aumento de la afinidad de unión de estas proteínas Sm para la neurona motora de la supervivencia (SMN), el producto del gen de la enfermedad atrofia muscular espinal [20], [21] . Posteriormente, el PRMT5- y SMN complejos cooperan para cargar las proteínas Sm Onto U ARNsn, formando U snRNPs [22]. Aunque
in vitro
evidencia bioquímica indicó que simétrica dimethylation arginina es esencial para la pre-mRNA de empalme [23], en qué medida afecta PRMT5 empalme
in vivo
sigue siendo difícil de alcanzar. PRMT5 es crucial para el desarrollo embrionario del ratón [8].
purificado y clonado un nuevo receptor de andrógenos (AR) -interacting proteínas, p44 designado [24], [25]. La secuencia de la proteína de p44 es idéntica a la de un componente (MEP50) del complejo methylosome [18] y una subunidad (WD45) del complejo SMN [17]. La proteína p44 contiene 342 residuos de aminoácidos y siete putativo WD-40 repeticiones y también se designa WDR77 en el banco de genes (Adhesión: AAH9411.1). Interactúa con AR y regula la expresión de un conjunto de genes diana de andrógenos en la glándula prostática y en el cáncer de próstata [24], [25], [26], [27]. La proteína p44 se localiza en el citoplasma de las células epiteliales de la próstata de los ratones más jóvenes de 28 días; p44 translocación nuclear comienza a la edad de 28 días y se completa a la edad de 45 días [28]. translocación nuclear de p44 se correlaciona con una disminución dramática en la tasa de proliferación de las células epiteliales [28] y con citodiferenciación funcional de las células luminales, que ocurre con la expresión de las proteínas de secreción específico de la próstata [29], [30], [31] , [32]. Por lo tanto, p44 localización citoplasmática se asocia con la proliferación de células epiteliales de la próstata, mientras que su localización nuclear se asocia con la diferenciación de células epiteliales. La tinción inmunohistoquímica de especímenes de próstata mostró que la proteína p44 se localiza en el núcleo de las células epiteliales benignas y en el citoplasma de las células del cáncer de próstata [25]. La translocación de p44 desde el núcleo hasta el citoplasma se produce en la neoplasia intraepitelial prostática y lesiones de cáncer de próstata [25], [26]. Forzado localización nuclear de p44 inhibe el crecimiento de células de cáncer de próstata en cultivo de tejido [25] y completamente abolió el crecimiento de xenoinjertos de tumores de próstata en ratones desnudos [26]. Esta inhibición del crecimiento se asocia con la regulación positiva de
p21
y
expresión de p27
gen; regulación a la baja de
ciclina A
,
ciclina B Opiniones y
CDK2
la expresión génica; y la detención del ciclo celular en el G
1 /G
0 fase [25], [26]. Por lo tanto, la función de p44 está regulada por su localización subcelular.
células PC3 y LNCaP (A) se tiñeron inmunohistoquímicamente con anticuerpo anti-PRMT5 y -p44 anticuerpos (paneles ag) o anti-PRMT5 más anticuerpos -coilin (panel h ). Se observaron las señales de fluorescencia con un microscopio confocal con un filtro rojo (para detectar PRMT5) o un filtro verde (para detectar p44 o coilin). paneles de la derecha muestran las imágenes fusionadas de PRMT5 y p44 o coilin tinción. Blanco y puntas de flecha verdes indican PRMT5 y señales de p44 o coilin en el núcleo, respectivamente. (B) Western blot de las fracciones citoplasmáticas y nucleares de LNCaP y PC3 células con anticuerpos anti-PRMT5, -p44, -HSP90, o anticuerpo anti-Lamin B. C, el citoplasma; N, núcleo.
PRMT5 forma un complejo estequiométrico con p44 /MEP40 /WD45 /WDR77 en diversas células [33], [34], [35], y su localización subcelular se dinámicamente mientras el ratón está regulada desarrollo [8]. El papel funcional de PRMT5 en el citoplasma y el núcleo y la relación de su localización subcelular de cáncer de próstata no se han investigado. En el estudio actual, se encontró que PRMT5 citoplásmica es esencial para el crecimiento de células de cáncer de próstata, mientras que PRMT5 nuclear inhibe el crecimiento de células de cáncer de próstata. Consistente con estas observaciones, PRMT5 localiza en el núcleo en las células epiteliales de próstata benignos y, por el contrario, se localiza en el citoplasma en premalignas y tejidos de la próstata cancerosas. Por lo tanto, la función PRMT5 está regulada por su localización subcelular, y esto nucleocytoplasmic transporte puede desempeñar un papel importante en la tumorigénesis de próstata.
(A) Diagramas de los truncamientos PRMT5 expresadas como proteínas GFP-fusión. Los porcentajes de células con truncamientos GFP-PRMT5 en el citoplasma (C), núcleo (N), o citoplasma más el núcleo (C /N) se muestran a la derecha. (B) la localización subcelular de señales de exportación nuclear aisladas. Las células fueron transfectadas con pcDNA-f: GFP-PRMT5, -PRMT5 (1-90), -PRMT5 (500-560), -PRMT5 (576-637), o pcDNA-GFP y se observaron bajo un microscopio confocal. (C) Análisis de transferencia Western de fracciones citoplasmáticas y nucleares de las células transfectadas con pcDNA-f: GFP-PRMT5, -PRMT5 (1-90), PRMT5 (500-560), o PRMT5 (576-637) con anti-FLAG, -HSP90, o anticuerpo -lamin B.
Materiales y Métodos
Nuestra investigación no involucrar a los participantes humanos y animales, sólo el uso de tejidos de cáncer de próstata humano. Los pacientes no se pueden identificar, directa o indirectamente, a través de identificadores ligados a los sujetos. Por lo tanto, el proyecto de investigación estaba exento de la Excepción 4 (45 CFR Parte 46) y no se requiere una declaración de ética.
(A) Diagramas de los truncamientos PRMT5. Las células fueron transfectadas con pcDNA-GFP-p44 y pcDNA-PRMT5 o truncamientos pcDNA-PRMT5, y los porcentajes de células con GFP-p44 en el citoplasma (C) o más citoplasma núcleo (C /N) se muestran a la derecha. (B) la translocación citoplasmática de GFP-p44 conducido por PRMT5. Las células fueron transfectadas con pcDNA-GFP-p44 solo o junto con pcDNA-f: PRMT5, -f: PRMT5 (91-637), o f: PRMT5 (325-637), y se observó la localización subcelular GFP-p44 bajo una microscopio confocal. (C) Análisis de transferencia Western de fracciones citoplasmáticas y nucleares de células Cos 7 descritos en B con anti-p44, -HSP90, o anticuerpo -lamin B.
Muestras del cáncer de próstata e inmunohistoquímica
tejidos de la próstata benignas y cancerosas se derivaron de piezas de prostatectomía radical de 19 pacientes con cáncer de próstata tratados en New York University Medical Center, y el protocolo de estudio fue aprobado por la junta de revisión institucional. las identidades de los pacientes fueron retirados de todas las muestras y una exención de la necesidad del consentimiento fue otorgado por la junta de revisión institucional de la Facultad de Medicina de la Universidad de Nueva York, por lo que no se necesitó el consentimiento informado. Los tejidos se fijaron en 10% de formalina tamponada neutra y embebidos en parafina. El análisis inmunohistoquímico se realizó en las 19 muestras de cáncer de próstata humano como se describe anteriormente [36], [37]. Los anticuerpos (anticuerpo anti-p44, 1:50; anticuerpo anti-PRMT5, 1:20; de BD Transduction Laboratories) se aplicaron a las secciones de deslizamiento y incubaron durante la noche. Se utilizó un sistema de detección de peroxidasa de estreptavidina-biotina con 3,3'-diaminobencidina como sustrato de acuerdo con las instrucciones del fabricante (DAKO A /S, Grostrup, Dinamarca).
(A) Las mutaciones en p44 abolieron PRMT5 impulsado p44 translocación citoplasmática. Las células fueron transfectadas con pcDNA-GFP-p44 (WT) o pcDNA-GFP-p44 (MT) solo o junto con pcDNA-PRMT5. El núcleo se tiñó con rojo lejano, y se observó la localización subcelular de GFP-p44 con un microscopio confocal. (B) Las mutaciones en p44 abolieron la interacción de p44 con PRMT5. Las células fueron transfectadas con pcDNA-f: p44 (WT) (carril 1) o pcDNA-f: p44 (MT) (carriles 2-5), y de células enteras lisados se prepararon para la inmunoprecipitación con el anticuerpo anti-FLAG (M2 agarosa) . Western blot con anti-PRMT5 se realizó para detectar la PRMT5 precipitado (panel inferior). El panel superior muestra la expresión de tipo salvaje (WT) o mutado p44 (MT) en los lisados utilizados para la inmunoprecipitación.
Las células cultivadas se cultivan en la cámara de diapositivas y se fijaron con metanol frío (-20 ° C) durante 10 min. proteínas no específicas se bloquearon en 4% de gelatina de pescado en PBS durante 20 min. noche de incubación a 4 ° C con anticuerpos primarios se realizó seguido de una 1 h de incubación con anti-ratón o anticuerpo IgG anti-conejo marcado con Alexa 595 (1:500; Invitrogen) a temperatura ambiente. Las muestras se lavaron en PBS y después se contratiñeron con TOPRO 3, Far-rojo o verde Sytox (Molecular Probes) durante 10 min a temperatura ambiente, montados en Histogel (Linaris Histogel), y se analizó directamente mediante microscopía confocal de fluorescencia. Para la doble tinción, anti-PRMT5 y anti-p44 o anti-PRMT5 y anti-coilin (1:100, Proteintech) se incubaron con las células durante la noche a 4 ° C. Se utilizaron
(A) El silenciamiento mediado por shRNA de PRMT5; los anticuerpos secundarios (1.000 IgG anti-conejo marcado con DyLight 488, 1:1,000, y anti-IgG de ratón marcado con DyLight 649, 1). o expresión p44 en células de cáncer de próstata. El análisis de transferencia Western de lisados de células enteras hechas de células LNCaP infectadas con lentivirus que expresa la no diana (NT) shRNA (carriles 1, 5), PRMT5 (carriles 2-4) o p44 (carril 6) shRNAs. El PRMT5 shRNA-resistente (carril 3) o PRMT5 R368A mutante (carril 4) se expresó en las células LNCaP que expresan PRMT5. (B) Curvas de crecimiento de células de cáncer de próstata que expresan shRNA NT, PRMT5 shRNAs, p44 shRNA, PRMT5 shRNAs más PRMT5, p44 shRNA más p44, o PRMT5 shRNAs más PRMT5mt.
Cultivo celular y ensayo de crecimiento
LNCaP, PC3, y células Cos 7 se cultivaron en medio RPMI 1640 (Cellgro) con 10% (v /v) de suero bovino fetal (Hyclone). Para el ensayo de crecimiento celular, las células (5.000 por pocillo) se sembraron en placas de 24 pocillos, y el número de células se contaron cada día durante 7 días.
(A) silenciamiento de la expresión PRMT5 disminución de los niveles de proteína p44 en el citoplasma . LNCaP células fueron infectadas con el NT-shRNA o PRMT5 shRNA y inmunoti~neron con anti-PRMT5 o anticuerpo -p44. El núcleo se counterstained con Sytox verde (paneles intermedios, verde). Las muestras fueron observadas bajo un microscopio confocal. (B) Western blot de citoplasmática (C) y nuclear (N) fracciones de células LNCaP que expresan NT-shRNA, PRMT5 shRNA o p44 shRNA con anticuerpo anti-p44 o anti-PRMT5.
DNA las construcciones y de transfección transitoria
los fragmentos PRMT5 de cDNA se amplificó a partir del pcDNA-PRMT5 construyen [24] y se subclonaron en el pcDNA-f: GFP construir [28] para expresar la N-terminal F: proteínas de fusión GFP- truncamientos de PRMT5. Todas las construcciones se verificaron mediante digestión con enzimas de restricción y por secuenciación de ADN. La señal de localización nuclear fuerte (RKKKRKV) se fusionó en el extremo N-terminal de PRMT5 para expresar la proteína de fusión NLS-PRMT5. Las construcciones de ADN (1 microgramo por cada constructo) fueron transfectadas transitoriamente en LNCaP, PC3, o células Cos 7 (1 × 10
5) usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las células transfectadas se fijaron con (-20 ° C) de metanol frío durante 10 minutos, se tiñeron con TO-PRO 3 (10 microgramos /ml) (Molecular Probes), montado en Histogel (Linaris), y se analizó directamente por microscopía de fluorescencia confocal.
(a) la proteína PRMT5 en las células LNCaP que expresan PRMT5, PRMT5mt, NLS-PRMT5, o NLS-PRMT5mt se immunostained con el anticuerpo anti-PRMT5. Las muestras fueron observadas bajo un microscopio confocal. (B) transferencia de Western de citoplásmico (C) y nuclear (N) fracciones de células LNCaP que expresan PRMT5, f: PRMT5mt, NLS-PRMT5, o NLS-PRMT5mt con anti-PRMT5, -p44, -lamin B, o -HSP90 anticuerpo . (C) Curvas de crecimiento de células de cáncer de próstata LNCaP que expresan PRMT5, f:. PRMT5mt, NLS-PRMT5, o NLS-PRMT5mt
ARN de interferencia
P44 shRNA (p44-shRNA) (secuencia diana: 5'-GGGAACTAGATGAGAATGA-3 '), PRMT5 shRNA (secuencia diana: 5'-GGATAAAGCTGTATGCTGT-3'), y una nontargeting shRNA (NT-shRNA) (secuencia diana: 5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3 ') eran diseñado con una horquilla y extremos pegajosos (CLAI y MluI). Los oligonucleótidos se hibridaron en el vector de transferencia de genes lentiviral, pLVTHM, usando los sitios de enzimas de restricción ClaI y MluI. Las construcciones de ADN se secuenciaron para probar para la inserción y la longitud de los insertos. El lentivirus se produjo a continuación, mediante la transfección de células de riñón embrionario humano (293FT; Invitrogen) con el vector pLVTHM secuencia verificada, el plásmido de empaquetado (MD2G), y el plásmido de la cubierta (PAX2), que son necesarios para la producción viral. Tres días más tarde, se recogió el sobrenadante viral y se filtró para eliminar los desechos celulares. células LNCaP (1 × 10
5) se sembraron en placas de seis pocillos y transducidas con partículas de vector de lentivirus. Después de 16 h, el medio que contiene el virus se eliminó y se reemplazó con medio de crecimiento normal. Tres días después de la infección, las células se dividieron a 1:06 y se cultivaron durante 3 días. lisados de células enteras (5 microgramos de proteína) elaborados a partir de las células infectadas se analizaron por Western blot.
(A) SDS-PAGE de los complejos PRMT5 producidos por co-expresión en
E. coli
. (B) La metilación de SmD3 y sustratos histona H4 por PRMT5 y complejos PRMT5 contienen. Top: autorradiografía del gel. En pocas palabras:. La tinción con azul de Coomassie del gel
Nontargetable PRMT5 y p44 Expresión
Para crear vectores de expresión de p44 y PRMT5 nontargetable, las secuencias de nucleótidos dirigidos por shRNAs fueron mutados usando un oligo kit de mutagénesis directa. El GGATAAAGCTGTATGCTGT secuencia diana de PRMT5 shRNA se mutó a GGATAAAattaTATGCTGT. El GGGAACTAGATGAGAATGA secuencia diana de p44 se mutó a GGGAAtTgGAtGAGAATGA. El PRMT5 o p44 cDNA mutante se subclonó en el vector de expresión lentiviral (dsRed-OG2). El lentivirus recombinante fue producido con 293T como se ha descrito anteriormente. Para rescatar PRMT5 o expresión de p44, LNCaP PRMT5-shRNA o se sembraron células p44-shRNA en placas de seis pocillos y transducidas con el virus que contenía el PRMT5 o expresión p44 vector nontargetable o vector vacío. Después de 48 h, se re-chapada las células, y la expresión PRMT5 o p44 fue confirmada por Western blot.
. La tinción inmunohistoquímica de p44 y en PRMT5 (paneles superiores) benignos humanos, la hiperplasia prostática epitelial (PIN, paneles de media), y maligno de próstata (CaP, Gleason 4, paneles inferiores) tejidos.
citoplasmática y extracto nuclear Preparación
citoplasmática y nuclear fracciones se prepararon a partir de células cultivadas usando el extracto nuclear Kit (nº de catálogo 40010 y 40410, Active Motif) como se ha descrito anteriormente [28].
Análisis de Western Blot
PRMT5 y p44 se detectaron en extractos de células totales (5 microgramos) por 10% SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de transferencia Immobilon-P (Millipore). Las membranas se lavaron en solución salina tamponada con Tris con Tween 20 solución salina (10 mM Tris-HCl, pH 8, NaCl 150 mM, y 0,05% de Tween 20) tamponada con Tris y se bloquearon con 5% de leche sin grasa con Tween 20 durante 1 h . Las transferencias se sondearon entonces durante la noche con anticuerpos primarios a diluciones de 1:2,000 (anti-p44), 1:1,000 (anti-PRMT5), 1:1000 (anti-HSP90, Santa Cruz Biotechnology), 1; 500 (anti-Lamin B, Santa Cruz Biotechnology), y 1:1,000 (anti-β-actina, Sigma-Aldrich). Después de 1,5 h de incubación con anticuerpo secundario de rábano picante conjugada con peróxido, las proteínas inmunorreactivas se detectaron por un aumento de quimioluminiscencia usando el sistema de detección ECL según las instrucciones del fabricante (GE Healthcare). Las concentraciones de proteína se determinaron utilizando el ensayo de proteínas de Bradford (Bio-Rad).
Co-inmunoprecipitación
células PC3 (3,6 × 10
6) fueron transfectadas con 6 microgramos de pcDNA- f: p44, f: p44 (26-27AAA), f: p44 (29-31AAA), f: p44 (35-37AAA), o -f: p44 (42-44AAA) con Lipofectamine 2000. El conjunto los lisados se prepararon de Célula de las células transfectadas 48 h después de la transfección y se incubaron con 15 microlitros de M2 agarosa (Sigma) durante 2 horas a 4 ° C en un volumen final de 0,5 ml que contienen HEPES 20 mM (pH 7,9), EDTA 0,2 mM , 20% de glicerol, DTT 2 mM, KCl 300 mM, y 0,1% de NP40. Las perlas se lavaron cinco veces (1 ml cada una) con el tampón de incubación. Las proteínas unidas se eluyeron con 30 microlitros de péptidos FLAG (0,2 mg /ml) durante 30 min a 4 ° C y se analizaron por Western blot con anticuerpo anti-PRMT5.
Expresión y Purificación de Proteínas
PRMT4, p44, pICln, o SmD3 cDNA fue clonado en pET15d (Novagen) para expresar como un Su
6-tagged amino-terminal. Para PRMT5 co-expresión con la p44 o pICln, PRMT5 se clonó en pACYCDuet (Novagen) con un Su
6 tag amino-terminal, y la p44 o la región de codificación de pICln se clonó en el segundo sitio de clonación múltiple del mismo vector con una etiqueta FLAG-epítopo N-terminal. Para PRMT5 co-expresión con p44 y pICln, PRMT5 se clonó en pACYCDuet con un amino-terminal Su
6 etiqueta, la región de codificación pICln se clonó en el segundo sitio de clonación múltiple del mismo vector, y la región codificante de p44 fue clonado en un vector pET con una etiqueta FLAG-epítopo N-terminal. Las proteínas se expresaron en BL21 (DE3) células a 30 ° C durante 3 h después de la inducción con 0,1 mM de isopropilo 1-tio-β-D-galactopiranósido. Las células se lisaron por sonicación tres veces durante 5 min cada uno en tampón de lisis (HEPES 10 mM, pH 7,9, 0,3 M KCl, 0,1% de NP40, 0,1 mM fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 2 βg /ml de pepstatina A, y 2 microgramos /ml de leupeptina). Las proteínas se purificaron usando Ni-NTA agarosa (Qiagen) de acuerdo con el protocolo del fabricante con elución de imidazol y posteriormente se purificó en la agarosa M2 (Sigma-Aldrich) con elución péptido FLAG para los complejos de PRMT5 contienen. Las histonas se purificaron a partir de células HeLa como se describe anteriormente [24].
se realizaron metiltransferasa Ensayo
reacciones de metilación como se ha descrito previamente con algunas modificaciones [24]. Las reacciones que contienen 6 fmol de PRMT5 o complejos que contienen PRMT5-, 1 microgramo de SmD3 o histonas, y 1 microCi de S- [metil-
3H] adenosymethionine (PerkinElmer) se incubaron en 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 EGTA mM, y EDTA 1 mM a 30 ° C durante 1 h. Las reacciones se hirvieron en tampón de muestra SDS y se separaron en un gel de poliacrilamida al 15%. Los geles se fijaron durante 30 minutos en el 40% de ácido acético en metanol al 10%, se incubaron en 20 ml de Amplify (Amersham Life Science) durante 10 minutos, se secaron y se expusieron a una película de rayos X a -80 ° C.
resultados
PRMT5 y p44 co-localizados en el citoplasma de las células del cáncer de próstata
la localización subcelular de PRMT5 se regula dinámicamente durante el desarrollo del ratón [8]. Se localiza al núcleo durante el desarrollo temprano y se encuentra en el citoplasma de las células epiblasto pluripotenciales de la masa celular interna por día embrionario 6.5. PRMT5 localiza principalmente en el citoplasma de las células somáticas como 293T, Cos-1, U2OS, y las células B normales [35], [38], [39]. En nuestro estudio, la inmunotinción con el anticuerpo anti-PRMT5 indicó que PRMT5 es predominantemente citoplasmática en PC3 cáncer de próstata y las células LNCaP (Fig. 1A, paneles A y D).
Western blot de las fracciones citoplasmáticas y nucleares confirmó su localización subcelular (Fig. 1B, panel superior). PRMT5 También se detectó en los núcleos de las células PC3 y LNCaP como cuerpos separados nucleares (Fig. 1A, paneles C, F, y G, indicadas por las flechas blancas).
El núcleo contiene muchas estructuras nucleares dinámicos, incluyendo Cajal órganos [40]. A pesar de que la función del cuerpo Cajal sigue siendo desconocida, existe considerable evidencia que sugiere que puede estar implicada en la maduración snRNA /biogénesis, histona procesamiento de pre-ARNm, y el conjunto de los transcriptosomes [41], [42]. El cuerpo Cajal contiene muchos elementos, como coilin (el marcador de los órganos Cajal), snRNPs y SMN. proteínas PRMT5, MEP50, pICln, y Sm forman el complejo methylosome que media en el conjunto de spliceosomal snRNP [18], [20]. SMN complejo, que contiene las proteínas Sm y PRMT5, es necesario y suficiente para el montaje de UsnRNA [21], [43]. Nos immunostained células LNCaP usando un conejo anti-coilin y un anticuerpo anti-PRMT5 ratón. La imagen combinada demostró que PRMT5 no es co-localizada con los órganos Cajal en el núcleo (Fig. 1A, el panel h).
De acuerdo con nuestros datos de informes anteriores [25], la proteína p44 localizada predominantemente en el citoplasma de PC3 cáncer de próstata y las células LNCaP (Fig 1A, paneles B y e;. la Fig. 1B, segundo panel). Las imágenes fusionadas demostraron una buena co-localización de PRMT5 con p44 en el citoplasma, mientras que este co-localización no se observó en el núcleo de las células PC3 y LNCaP (Fig. 1A, paneles C, F, y G).
PRMT5 contiene tres señales nucleares de exclusión
la N-terminal de aumento de proteína verde fluorescente (GFP)-etiquetados PRMT5 (GFP-PRMT5) se expresó transitoriamente en PC3, LNCaP y células Cos 7, y la resultante proteína de fusión GFP-PRMT5 tenía una localización citoplasmática predominante (figura 2B, paneles a y e;. datos no mostrados por las células PC3) en esas células, similar a la de la proteína endógena PRMT5 (Fig 1A, el panel d.). La proteína GFP se localiza tanto en citoplasma y núcleo en estas células (Fig. 2B, paneles I y J). Para identificar el determinante molecular para la localización subcelular de PRMT5, fragmentos que abarcan todo el marco de lectura abierto de PRMT5 (Fig. 2A) que se superpone fueron clonados en el marco de generar pcDNA-f: construcciones de fusión GFP-PRMT5. Estas construcciones fueron transfectadas en células Cos 7 para determinar las regiones críticas de PRMT5 necesaria para la exportación o importación nuclear.
Dos fragmentos de proteínas, PRMT5 (1-324) y PRMT5 (325-637), se encuentran dentro de la citoplasma en 100% de las células transfectadas (Fig. 2A), lo que sugiere que estos fragmentos contienen señales necesarias para la localización citoplasmática. La deleción de 144 o 234 residuos de aminoácidos desde el extremo C-terminal de la (1-324) fragmento PRMT5 no afectó a su localización citoplasmática. Otras deleciones de seis o siete residuos de aminoácidos de la N-terminal o C-terminal dado lugar a la pérdida completa de localización citoplasmática, lo que indica que estos residuos de aminoácidos son críticos para la localización citoplasmática de este fragmento. El PRMT5 región (1-90) se encontró en el citoplasma en 100% de las células transfectadas (Fig 2A;. 2B, panel B) y es una novela NES, designado NES1. NES1 no se parece a la NES ricos en leucina convencionales [44].
Un análisis más detallado eliminación identificó los otros dos secuencias de NES en la parte C-terminal de PRMT5. El aminoácidos de la región que abarca los residuos 500 a 560 localizado en el citoplasma en 100% de las células transfectadas (Fig 2A;. 2B, panel C). Por lo tanto, la (500-560) fragmento PRMT5 es también un NES funcionales, designados NES2. El aminoácidos de la región que abarca los residuos 576 a 637 localiza en el citoplasma en el 98% de las células transfectadas (Figura 2A;. 2B, panel D) y es otro NES funcionales, designados NES3. El análisis de secuencias indicó que estas dos secuencias de NES son nuevos y también no se parecen a los ricos en leucina NES clásicos [44]. Western blot de las fracciones nucleares y citoplasmáticas de las células transfectadas confirmó la localización citoplasmática de las proteínas PRMT5 de larga duración e identificó Ness (Fig. 3C, panel superior). No hay señales de localización nuclear (NLSs) se detectaron en la proteína PRMT5 por este análisis. El Ness identificado funcionó de manera similar en células LNCaP (Fig. 2B, paneles de media) y células PC3 (datos no mostrados).
PRMT5 promueve la translocación citoplasmática de p44
PRMT5 interacciona físicamente y forma un complejo con p44 /MEP40 /WD45 /WDR77 en diversas células, incluyendo las células de cáncer de próstata [33], [34], [35], y co-localizada con p44 en el citoplasma de las células de cáncer de próstata (Fig. 1A). Luego investigó si la expresión PRMT5 influye en la localización subcelular de p44. Cos 7 células fueron transfectadas con pcDNA-GFP-p44 solo o junto con pcDNA-PRMT5. En consonancia con los resultados previos publicados [28], fuertes señales de GFP-p44 fueron evidentes en el núcleo de las células Cos transfectadas 7 (Fig. 3B, panel a). Sin embargo, la co-expresión de PRMT5 resultó en exclusiva localización citoplasmática de GFP-p44 en el 100% de las células transfectadas (Fig 3A;. 3B, panel B). Supresión análisis indicó que la parte C-terminal (residuos de aminoácidos 325 a 637) es esencial y suficiente para promover la GFP-p44 translocación citoplasmática (Fig 3A;. 3B, el panel d). La translocación citoplasmática PRMT5 impulsada de p44 fue confirmada por Western blot de las fracciones nucleares y citoplasmáticas de las células transfectadas (Fig. 3C, panel superior). Observaciones similares se obtuvieron con LNCaP y PC3 células (Fig. 3b, dos paneles inferiores). El residuo de arginina conservado (R368) es esencial para la actividad de metiltransferasa de PRMT5 [45]. La mutación de R368A en PRMT5 abolió su actividad metiltransferasa [24], pero no afectó a su capacidad para promover p44 citoplásmica translocación (Fig. S1). Por lo tanto, PRMT5 es la fuerza principal en la determinación de la localización citoplasmática de la proteína compleja PRMT5-p44.
El Interacción PRMT5-p44 es necesaria para la PRMT5 impulsada por translocación citoplasmática de p44
El análisis de deleción indicaron que los residuos de aminoácidos 26 a 45 en la proteína p44 fueron críticos para la translocación citoplasmática PRMT5 guiado de p44 (Fig. S2). Hemos mutado los residuos de aminoácidos (
26CME
28
29RQL
31
35RYR
37 o
42LLL
44) a alaninas en la proteína p44 y se examinó la consecuencia de estas mutaciones sobre PRMT5 impulsada translocación citoplasmática de GFP-p44 (Fig. 4A). Estas mutaciones no cambiaron la localización subcelular de GFP-p44 en células Cos 7 (Fig. 4A, paneles g, m, s, y en función de a). Sin embargo, las mutaciones (
35RYR
37 a
35AAA
37 y
42LLL
44 a
42AAA
44) abolió PRMT5-driven translocación citoplasmática de GFP-p44 (Fig. 4A, paneles de v, b 'frente a d).
Estas mutaciones se expresaron como proteínas etiquetadas con epítopo FLAG en células PC3. Las mutaciones disminución de los niveles de expresión de la proteína p44 (Fig. 4B, panel superior, carriles 2-5 frente a carril 1). La inmunoprecipitación con el anticuerpo anti-FLAG inmovilizados sobre perlas de agarosa (M2-agarosa) indicó que las mutaciones (
35RYR
37 a
35AAA
37 y
42LLL
45 a
42AAA
44) en p44 abolió su interacción con PRMT5 (Fig. 4B, panel inferior, carriles 4 y 5 frente a los carriles 1-3). Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que la interacción entre p44 y PRMT5 es esencial para la localización citoplasmática PRMT5 impulsada de p44.
Tanto PRMT5 y p44 son necesarios para el crecimiento de las células del cáncer de próstata
Para determinar si PRMT5 juega un papel en el cáncer de próstata, hemos probado si silenciamiento de la expresión en las células LNCaP PRMT5 afectaría su crecimiento. Para ello, hemos diseñado una corta horquilla de ARN interferente (shRNA) dirigidos contra la secuencia PRMT5. Para probar si el shRNA podría suprimir la expresión PRMT5, se infectaron células LNCaP con el vector lentiviral transducción de un segmento de ADN que especifica dicha secuencia shRNA. Como se muestra en la Fig. 5A, el shRNA reducido drásticamente la expresión de la proteína PRMT5 en las células LNCaP 4 días después de la infección por lentivirus (carril 2, panel superior) en comparación con la expresión de un no-objetivo (NT) shRNA (carril 1, panel superior), cuya secuencia hizo no encontró ningún gen humano conocido.