Extracto
El receptor de andrógenos restos afroamericanas (AR) un importante contribuyente a la evolución neoplásica del cáncer de próstata (CaP). la progresión del CaP está vinculada a varios cambios mutacionales AR somáticas que dotan a las propiedades AR dramáticos con ganancia de función. Una de las mutaciones somáticas más comunes identificadas es Thr877 a Ala (T877A), situado en el dominio de unión a ligando, que resulta en un receptor capaz de la unión promiscua y la activación por una variedad de hormonas esteroides y ligandos, incluyendo estrógenos, progestinas, glucocorticoides, y varios anti-andrógenos. En un intento de definir con más precisión somáticas mutado AR propiedades con ganancia de función, como consecuencia de la unión de su ligando promiscuo, llevamos a cabo un enfoque de análisis proteómico /red para caracterizar la interactoma proteína del mutante T877A-AR en las células LNCaP menores de ocho diferentes tratamientos-ligando específico (dihidrotestosterona, mibolerona, R1881, testosterona, estradiol, progesterona, dexametasona y acetato de ciproterona). Al extender el análisis de nuestros complejos multi-ligando de la mutante T877A-AR se observó enriquecimiento significativo de complejos específicos entre los tumores prostáticos normales y primarias, que además están correlacionados con los resultados clínicos conocidos. Un análisis más detallado de ciertos complejos T877A-AR mutante mostró preferencias de población específicos que distinguen la enfermedad prostática primaria entre blancos (no hispanos) frente a los hombres afroamericanos. Por otra parte, estos complejos AR-proteínas relacionadas con el cáncer demostró que la supervivencia de predicción de los resultados específicos de CaP, y no para el de mama, pulmón, linfoma o cáncer de meduloblastoma. Nuestro estudio, por los datos de acoplamiento generados por nuestros proteómica para el análisis de la red de muestras clínicas, ha contribuido a definir las vías biológicas reales y novedosos en sistemas complejos AR complicados con ganancia de función
Visto:. Zaman N, Giannopoulos PN , Chowdhury S, Bonneil E, Thibault P, Wang E, et al. -Coupled proteómico de la red (2014) Análisis de T877A-receptor de andrógenos interactomes puede predecir clínica del cáncer de próstata los resultados entre los blancos (no hispanos) y los grupos afroamericanos. PLoS ONE 9 (11): e113190. doi: 10.1371 /journal.pone.0113190
Editor: Mohammad Saleem, Hormel Institute, Universidad de Minnesota, Estados Unidos de América
Recibido: 10 de mayo de 2014; Aceptado: 4 Septiembre 2014; Publicado: 19 Noviembre 2014
Derechos de Autor © 2014 Zaman et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos proteómicos presentados en el manuscrito, se cargarán en nuestra base de datos del receptor de AR (http://androgendb.mcgill.ca/) como un archivo de Excel, junto con las cifras suplementario /Tablas asociadas con este manuscrito.
Financiación: Este estudio fue apoyado por los Institutos canadienses de Investigación en Salud (http://www.cihr-irsc.gc.ca) subvención de funcionamiento RP-106477 (MT, MP, EW). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
los avances significativos en la metodología de secuenciación genómica han permitido una mejor evaluación de la extensión de las mutaciones somáticas acumulados en las neoplasias comunes [1], [2]. Más importante es la realización de que los tumores significativamente varían genéticamente de un paciente a otro y dentro de un paciente singular existe extensa heterogeneidad inter-tumoral y la heterogeneidad intra-tumoral [3], [4], [5]. Un número importante de estas alteraciones genéticas son mutaciones sin sentido que provocan nuevas propiedades con ganancia de función que hacen que un gen particular proactivo a la evolución tumoral y se conocen como mutaciones del conductor. Una mejor comprensión de estas nuevas propiedades conduciría a una mejor interpretación de la oncogénesis, pero esto es difícil debido a un gran número de mutaciones diferentes, la naturaleza impredecible de propiedades de ganancia de función asociada a mutaciones somáticas, la posible extensa interacción de diferentes mutantes somáticos y los consiguientes procesos de selección iniciados por el microambiente o por la terapia en sí. Este tipo de "sistemas" complejos requieren un enfoque más global "ómicas" y más análisis de la red, en lugar del enfoque clásico de un solo gen, garner la información más crítica en relación con la evolución neoplásica.
De acuerdo con el paisaje mutacional que acaba de definir de los tumores, el cáncer de próstata (CaP) también tiene una amplia alteraciones genéticas que van desde las mutaciones de sentido erróneo individuales, copia la variación del número, variantes de empalme, reordenamientos genéticos y alteraciones del ADN cortos en un gran número de genes [1], [2], [6] , [7], incluyendo el receptor de andrógenos (
AR)
gen. No es inesperado que las mutaciones AR pueden añadir al repertorio de la proteína de nuevas y potentes funciones [8], [9] y estos atributos de ganancia de función pueden permitir que el AR funcione de una manera aberrante. Un número de somáticas mutantes CaP de AR, en especial el que ocurre más frecuentemente mutación CaP AR, Thr877Ala (T877A), tiene propiedades únicas con ganancia de función: pueden unir varias clases de esteroides promiscuamente (por ejemplo, estrógenos, progestinas, glucocorticoides) con la transactivación posterior o ser hiperactivado por ligandos normales [10]. tratamientos anti-andrógenos clásicos [por ejemplo, flutamida, acetato de ciproterona (CPA) o bicalutamida] han generado, a través de la presión de selección, las mutaciones somáticas AR específicos, por ejemplo, Trp741Cys (W741C) y His874Tyr, lo que resulta en ARS subversivas que están en plena actividad con estos fármacos [11]. Incluso la nueva generación de fármacos anti-andrógenos ejemplificados por Enzalutamida (MDV-3100) ha provocado mutaciones específicas AR [12], [13]. Esta observación también se correlaciona con una caída dramática en los niveles de PSA posteriores a la retirada del antiandrógeno [11]. Las mutaciones T877A-AR, que también está presente en la línea celular de cáncer de próstata LNCaP, ha sido reportado por varios individuos se presentaron en 25 a 33% de los tumores resistentes a la castración independientes de andrógenos o [11], [14], [15] , [16].
Recientemente, nuestro propio trabajo sugiere fuertemente que la función de AR se extiende más allá de su función clásica como un factor de transcripción e incluye las nuevas propiedades de corte y empalme de ARN, la metilación del ADN, la interacción proteasomal y traducción de proteínas en el polirribosomas sí mismos [17]. Además, la gran diversidad funcional de los componentes de complejos AR ejemplifica la naturaleza compleja de las interacciones proteína-proteína asociada con la generación de la salida biológica AR adecuado. Estas funciones novela AR pueden mediar procesos celulares y ofrecer nuevas áreas en las que los mutantes somática AR CaP pueden "complacer" y promover la oncogénesis CaP.
En un intento por describir propiedades novedosas con ganancia de función asociados con CaP mutante DA , se realizó un análisis proteómico red acoplada. Múltiples investigaciones espectroscopia proteómica de masa se llevaron a cabo con el fin de caracterizar completamente la composición de proteína de T877A-AR "complejos" (interactome) bajo distintas clases de hormona /condiciones de ligando que reflejan la promiscuidad de la unión del ligando asociados con T877A. Críticamente, ARS CaP mutantes pueden tener su propia capacidad única para someterse y definir nuevas interacciones. El acoplamiento de los datos generados por nuestros proteómica pantalla para el análisis de la biología del sistema ha sido de gran ayuda en la definición de criterios de valoración biológicos reales y novedosos en sistemas complejos AR, dentro de una perspectiva de la enfermedad clínica.
Materiales y Métodos
las líneas celulares
las líneas celulares de cáncer de próstata LNCaP se obtuvo de la American Type Culture Collection (ATCC), Rockville MD.
cultivo de células, hormonas esteroideas, ligandos y los experimentos de estimulación
línea celular LNCaP se cultivó en medio RPMI 1640 suplementado con FBS (10%), a 37 ° C, 5% de CO
2 en la T-75 frascos de cultivo de plástico. Una vez confluentes, el medio se cambió a RMPI suplementado con 10% de carbón-dextrano despojado FBS y se incubaron durante 24 h adicionales. El día siguiente, el medio se cambió a RMPI fresco /carbón-dextrano despojado FBS para los estudios de la hormona durante la noche /estimulación ligando para un período de 18 horas. Esteroides hormonas se utilizaron a las siguientes concentraciones finales, 10 nM dihidrotestosterona (DHT), 10 nM mibolerona (MB), 10 nM de R1881, 10 nM testosterona + 10 M finasteride, 10 nM 17β-estradiol, 10 nM de progesterona, 10 nM de dexametasona, y 100 nm acetato de ciproterona (CPA).
la purificación por afinidad y Western Blot
LNCaP lisados de células enteras se prepararon por el método de congelación-descongelación con tampón 1X PDG que contiene la hormona apropiada /ligando [18] . Los lisados se realizaron después sobre de α-AR co-inmunoprecipitaciones [AR (N20), Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA] durante la noche a 4 ° C. Un 50% de proteína A Sepharose suspensión se añadió a cada muestra y se incubó a temperatura ambiente durante 90 min. Las perlas se lavaron tres veces con tampón de lavado (50 mM Tris-HCl pH 8,0, NaCl 150 mM, 1% de Tween 20) y se resuspendieron en 100 l de 1X tampón de carga de SDS gel. Las muestras se desnaturalizaron por ebullición, y se resolvieron en un gel de 10% SDS-poliacrilamida antes de la tinción de plata de acuerdo con las directrices del fabricante (BioRad) o transferencia a una membrana de nitrocelulosa para el análisis de transferencia Western utilizando AR anticuerpo monoclonal (441) (NeoMarkers, Fremont, CA) .
espectrometría de masas y péptido comparación
TCEP (tris (2-carboxietil) fosfina) se añadió a las muestras de proteínas para alcanzar la concentración de 5 mM. Las muestras se incubaron a 37 ° C durante 30 min. Se añadió un mg de tripsina y las muestras digerido durante la noche a 37 ° C, después se secó en un SpeedVac y resolubilizada en 50 l de ácido ACN 5% /ácido fórmico (FA) 0,2%.
Todos los análisis de MS eran realizó utilizando un espectrómetro de masas híbrido LTQ-Orbitrap con una fuente de iones de nanoelectropulverización (ThermoFisher, San Jose, CA) acoplado con una bomba de 2D nano-LC Eksigent (Dublin, CA) equipado con un Finnigan AS inyector automático (Thermo Fisher, San Jose, CA ). Twenty l de cada muestra se inyectó en una precolumna C18 (0,3 mm de diámetro interno x 5 mm) y las muestras se separaron en una columna analítica C18 (150 micras de diámetro interno x 100 mm) utilizando un sistema de Eksigent nanoLC-2D. Un gradiente de 76 min a partir de (A /B) 10 a 60% (A: ácido fórmico 0,2%, B: acetonitrilo /0,2% de ácido fórmico) se utilizó para eluir los péptidos con un caudal fijado en 600 nL /min. Los espectros de MS convencional (encuesta de exploración) se adquirieron en modo de perfil con una resolución de 60.000 a m /z 400. Cada espectro completo de MS fue seguido por tres espectros MS /MS (cuatro eventos de análisis), donde los tres más abundantes iones cargados múltiplemente fueron seleccionados para la secuenciación MS /MS. experimentos tándem MS se realizaron utilizando la disociación inducida por colisión en la trampa de iones lineal.
Las comparaciones de la abundancia de péptidos a través de los diferentes paradigmas experimentales fueron obtenidos utilizando etiqueta libre de la proteómica cuantitativa [19], [20]. En pocas palabras, los archivos de datos brutos de software Xcalibur se convierten en archivos de mapas de péptidos que representan a todos los iones de acuerdo a sus correspondientes valores de m /z, tiempo de retención, la intensidad y estado de carga. abundancia péptido fue entonces evaluada utilizando el "top pico" valores de intensidad. Las intensidades de los péptidos liberadores de la mayoría de las fracciones se suman entre sí, y sólo un coeficiente de varianza (CV) que permite la transmisión de iones máxima se considera para calcular la intensidad de péptidos. La agrupación de los mapas de péptidos a través de diferentes conjuntos de muestras se realizó en la entrada de la mascota del péptido asociado utilizando la agrupación jerárquica con tolerancias específicas (+/- 15 ppm de masa de péptidos y +/- 1 min de tiempo de retención del péptido). La normalización de tiempo de retención se realizó en el clúster de péptido inicial usando una corrección dinámica y no lineal que limita la distribución del tiempo de retención a menos de 0,1 min en promedio. cambios en la abundancia de reproducibilidad a través de condiciones se determinó usando un homoscedastic de dos colas
t-test
en la muestra se replica para identificar grupos de péptidos con
p
-valores & lt; 0,1 con cambios veces mayores que 7 estándar desviaciones. agrupaciones de péptidos que cumplan estos criterios de selección fue inspeccionado manualmente para validar la identificación y los cambios en la abundancia. análisis de expresión se llevaron a cabo en las proteínas identificadas por al menos dos secuencias de péptidos diferentes. los valores de expresión y la desviación estándar relativa se ganaron un promedio de las diferencias de intensidad y las desviaciones estándar de los cuatro tripletes de péptidos más intensos después de la eliminación de las agrupaciones de péptidos periféricas. datos proteómicos normalizados se pueden encontrar en la Tabla S1.
Conjuntos de datos para la construcción de la red y de identificación de genes NCBI análisis de la expresión génica
Se dio a todas interactores AR. información de la interacción proteína humana fue compilada de diversas fuentes de datos y bases de datos de anotación como Interacción Biomolecular base de datos de red (BIND), la base de datos de Interactuando Proteínas (DIP), proteína humana base de datos de referencia (HPRD), intacto, y la base de datos de interacción molecular (CECA), la mayoría de los cuales contienen datos de interacción y alto rendimiento de datos curada. Hemos generado un metadatos de las interacciones proteína mediante la fusión de estos datos con nuestra propia red de señalización humano mano curada que contiene proteínas 4.000 y 22.000 relaciones de señalización [21], [22], [23].
Una red de interacción de proteínas se construyó para cada hormona usando nuestra red de interacción manual comisariada red de señalización humana y proteína-proteína. Sólo nosotros proteínas consideradas que eran ≥2.5 veces la abundancia condición hormonal (señal) frente a la abundancia de control del vehículo a partir del conjunto de datos de MS, que deben considerarse una presencia significativa. En la red, un nodo y enlace representan la interacción de proteínas y, respectivamente. Para encontrar las regiones altamente interconectadas de la red, para cada hormona, marcamos cada par de interacción basado en el número de nodos vecinos que tienen en común. Esto nos dio una matriz con todas las puntuaciones entre todos los pares de interacción. La agrupación jerárquica se aplicó a la matriz y una puntuación umbral calculado en base a la densidad de partición que nos permite identificar las regiones altamente interconectadas (clusters) para cada una de las redes de hormonas.
A continuación, utiliza estos grupos de proteínas e identificado GO-términos (http://www.geneontology.org/) que se asocian significativamente con cada uno de los grupos de proteínas (p-value & lt; 0,05, hiper-geométricos). También utilizamos conjunto de genes de enriquecimiento de análisis (GSEA) caminos definidos y se realizó GSEA si el 25% de los genes de la agrupación de proteínas estaban en la vía. Para las vías y GO-términos que fueron significativos a partir de los resultados GSEA (p-value & lt; 0,05), también hicimos el análisis de supervivencia. Utilizamos genes asociados con estos GO-términos y realizamos GSEA usando GSE21034 [24].
extracciones de ARN y el análisis de microarrays
células LNCaP se estimularon con el panel de ligandos como se describió anteriormente, y el ARN total se extrajo usando TRIZOL (Invitrogen, Carlsbad, CA). RNA de muestras fueron procesadas por Quebec Centro de Innovación del Genoma (McGill University, Montreal, Canadá), para el análisis de microarrays con Illumina humano HT-12 Expresión BeadChip v4 (Illumina, San Diego, CA). Los datos en bruto se procesó utilizando R [22], [25]
.
Se hicieron dos mapas de calor globales. La primera heatmap incluye el gen expresado diferencialmente más para cada hormona usando la prueba t (valor de p & lt; 0,05), donde cada hormona se compara con todos los demás. El segundo mapa de calor incluye los mejores 10, 20, 50 y 100 genes con la más alta varianza. La prueba t encuentra los genes más expresados diferencialmente que son específicos para cada hormona, mientras que la varianza ayuda Observemos genes que son expresados diferencialmente a través de múltiples hormonas. GSEA análisis se realizó utilizando GSE21034 [24], de los 10, 20, 50 y 100 genes que mostraron la mayor variación.
Progresión y Análisis de supervivencia
Perfiles de expresión génica, datos de supervivencia de los pacientes, y la información demográfica para las 267 muestras de próstata clínicos (29 normales, 181 primaria y 37 tumores metastásicos) se obtuvieron de GSE21034 [24]. Mama, pulmón, linfoma y meduloblastoma conjuntos de datos se obtuvieron del Instituto Broad (http://www.broadinstitute.org/cgi-bin/cancer/datasets.cgi) [26]. Examinamos los valores de pronóstico prostatectomía radical de una subred a base de perfiles de expresión génica de los tumores primarios, y se realizó un análisis de Kaplan-Meier mediante la aplicación de la prueba de Cox-Mantel log-rank usando R como se describe anteriormente [22], [25]. Si el valor p es menor que 0,05, la subred se trató como estadísticamente significativa para clasificar los tumores en tumores no metastáticos y metastásicos. Se estratificó contra el cáncer recurrente no recurrente límite basado en los siguientes criterios: PSA (≥4 ng /ml), Gleason (≥7), estadio tumoral (≥3) y combinado (PSA + + Gleason tumor)
.
Preparación estructura para la simulación MD
La estructura cristalina de DHT (1I38) y CPA (2OZ7) unido al mutante T877A-AR LBD y la testosterona (2AM9) y R1881 (1E3K) unido a su forma natural AR- LBD están disponibles en el Protein Data Bank (PDB). Los complejos de diferentes ligandos unidos a la mutante T877A AR-LBD eran más preparado para simulaciones MD utilizando Xleap [27] en AMBER10 [28]. El campo de fuerza de AMBER generalizada (Gaff) y ff99SB [29] se utilizaron parámetros durante ocho ligandos diferentes. El complejo fue solvatado en un octaedro truncado caja de agua TIP3P [30]. La distancia entre la pared de la caja y el átomo más cercano del soluto era 12,0 Å, y la distancia más cercana entre los átomos de soluto y del disolvente fue de 0,8 Å. se añadieron a mantener la neutralidad eléctrica del sistema - contraiones (Cl
). Cada sistema se redujo al mínimo, en primer lugar mediante la aplicación de restricciones armónicas con constantes de fuerza de 10 kcal /mol /a
2 a todos los átomos de soluto; segundo, por calentamiento de 100 a 300 K durante 25 ps en el conjunto canónico (NVT); y, por último, equilibrando para ajustar la densidad del disolvente a presión 1 atm durante 25 ps en la simulación isotérmica-isobárica conjunto (TNP). Las restricciones armónicas A continuación, se reduce gradualmente a cero con cuatro rondas de 25 ps simulaciones NPT. Después de simulación adicional de 25 ps, un ciclo de producción de 15 ns se obtuvo con instantáneas recogidas cada 1 ps. Para todas las simulaciones, se utilizaron 2 fs tiempo de paso y 9 Å no trabada de corte. La partícula de malla Ewald método [31] fue utilizado para el tratamiento de la electrostática de largo alcance y longitudes de enlace intervienen enlaces a los átomos de hidrógeno se vieron limitados por el movimiento [32].
Resultados
red comparativo caracterización de T877A complejos -AR: interactome y los estudios de expresión génica
Nuestra capacidad para captar tanto el ligando unido y sin ligando de longitud completa de tipo salvaje AR mediante cromatografía de afinidad en condiciones fisiológicas ha permitido previamente tenemos que perseguir un enfoque de la proteómica con el fin de caracterizar los componentes de complejos AR de tipo salvaje. Esto se hizo sometiendo dichos complejos a la digestión tríptica seguida por espectrometría de masas (MS) para asignar la identificación de proteínas, en efecto crear interactomes AR iniciadas por la unión del ligando [33]. Para nuestros datos MS, un método cuantitativo sin etiqueta se ha aplicado a través de los diferentes paradigmas experimentales (ver Materiales y Métodos) [19], [20], lo que nos ha permitido obtener datos relacionados con la identificación de proteínas, junto con la abundancia, por lo tanto lo que permite la comparación directa entre las condiciones de estimulación.
el objetivo de las condiciones diferenciales de estimulación hormonal nos permitirá determinar si etiología de la enfermedad de la mutación T877A-AR depende de ligando y co-factor de estado. Por lo tanto, hemos utilizado células LNCaP que expresan endógenamente la mutación T877A-AR para caracterizar los complejos interactome proteína ligando promiscuo bajo diferentes condiciones hormonales, con el fin de poner de relieve los posibles complejos distintos que pueden estar vinculados a la progresión de la enfermedad. células LNCaP se estimularon con las siguientes hormonas, cuatro andrógenos: DHT, mibolerona (MB), R1881, o de testosterona (en la presencia de finasteride (para evitar la conversión de testosterona a DHT), o 17β-estradiol, progesterona, dexametasona o la actetate anti-andrógenos de ciproterona (CPA), solo o con control sin ligando /alcohol-vehículo. Hormone estimulada complejos T877A-AR se inmunopurificaron con un anticuerpo AR específico N-terminal, que no interfiera con la hormona de la unión al ligando de AR unión a dominio. eluidos de todas las condiciones experimentales se analizaron por LC-MS /MS. con el fin de aumentar nuestra frecuencia de muestreo para la detección de péptido en nuestro análisis MS, cada condición experimental se llevó a cabo cuatro veces. nuestros datos proteómica es una compilación de sólo totalmente proteínas caracterizadas, con la ontología de genes y la función completa.
los datos cuantitativos MS, para cada una de las ocho condiciones de estimulación hormonal, se utilizó para crear un mapa de interacción de proteínas (Figura 1). El mapa de la red de interacción de proteínas, permite un análisis visual de la relación de la interacción de cada proteína con la AR mutante. Lo más probable es que no todas las proteínas interactúan directamente con la AR mutante, pero pueden a través de proteínas intermedios. Una clasificación adicional función ontológica (ver Materiales y Métodos) se basa en este mapa red de interacción, por discernir agrupaciones significativas de las proteínas que interactúan con base en el número de conexiones de interacción proteína-proteína. De las listas de proteínas T877A-AR ocho estimulación de la hormona, que luego se aplica sistémicamente análisis de agrupamiento jerárquico de las condiciones experimentales. térmicos mapas de agrupamiento jerárquico en representación de la agrupación de entre toda agonista T877A-AR y tratamientos experimentales antagonistas fueron generados (Figura 1B). Entre las diferentes condiciones experimentales (tratamientos hormonales), se aplicó un análisis de redes comparativo [21], [22], [23], y aunque se utilizaron cuatro andrógenos diferentes (DHT, la testosterona, MB y R1881), los perfiles proteómicos de estos ligandos de andrógenos no se segregan juntos, y se observó que los complejos de progesterona y dexametasona AR tienen perfiles proteómicos que se parecen a R1881 y MB, respectivamente. Por otra parte, la compleja interacción de proteínas para los complejos estimulados-AR-estradiol fue más similar a la respuesta interactoma AR-DHT.
A. Cuantificada red de interacción de proteínas de DHT estimula las células LNCaP. El valor de cada proteína, que se define por nuestros etiqueta libre de MS cuantitativos, se distingue por el color y el tamaño, y las interacciones proteína-proteína sub-Sist. La AR es designado por el círculo negro. Para determinar la relación entre la interacción de proteínas y patrones de expresión génica, la agrupación jerárquica de las células LNCaP estimuladas con hormonas de paneles múltiples se llevó a cabo. B. Interacción proteínas identificadas por espectrometría de masas. C. La mayoría expresó de forma variable genes tras la estimulación de ligando. Aunque se ha sugerido que todas las hormonas utilizadas son capaces de activar la transcripción dependiente de andrógenos gen con el receptor mutante T877A-AR, hay diferencias entre los complejos de proteínas de AR y patrones de expresión génica AR. Este análisis de conglomerados ilustra que incluso los andrógenos sintéticos como mibolerona (MB) y R1881, tienen perfiles de expresión génica similares, sus complejos de proteínas de interacción son más similares a la dexametasona (DEX) y progesterona (PGR), respectivamente, que a cualquiera de los andrógenos naturales testosterona y DHT. Además, incluso los andrógenos naturales (DHT y testosterona) pueden ser separados por sus complejos de proteínas. Esto sugeriría que hay funciones para la AR más allá de la transactivación de genes. Los valores de proteína y la expresión génica se dan como una proporción de proteína cuantificada de cada estimulación estimulación vs control del vehículo.
También se procedió a caracterizar los patrones de expresión de genes de la hormona de múltiples paneles estimula las células LNCaP. El análisis de los genes expresados de forma variable entre la mayoría de las condiciones hormonales dio un patrón de agrupamiento jerárquico que era muy diferente a la T877A-AR-perfil de proteínas de interacción (Figura 1C). Es evidente que, una vez más observamos que los diferentes andrógenos usados en estos perfiles de estimulación no segregar juntos, y que los andrógenos sintéticos, como R1881 y MB, no tienen los mismos perfiles de transactivación de AR-estimulado como los ligandos naturales como la testosterona y DHT. Por otra parte, las propiedades ontológicas funcionales entre la interacción proteína-vs perfiles de expresión génica de nuestra ligando diferencial también aparecen las células estimuladas a ser muy diferente. Discernir el impacto en la progresión de la enfermedad a partir de estos perfiles es de particular interés.
Para establecer las funciones biológicas estadísticamente significativas, se implementó la incorporación de genes Ontológico (GO) /vías términos usando DAVID (base de datos para anotación, y Visualización Integrada descubrimiento, http://david.abcc.ncifcrf.gov/). Utilizando los datos de interacción de proteínas de todas las condiciones de estimulación de ligando, las principales funciones ontológicas son: la transcripción de ARN pol II-dependiente, la biosíntesis de proteínas, con componentes de la maquinaria de traducción (iniciación de la traducción, factores de elongación, proteínas ribosomales y otras proteínas reguladoras), RNA metabolismo (específicamente empalme de ARN), la reparación del ADN (a través de una interacción con miembros del complejo de la reparación del ADN), y las vías de proteasoma /ubiquitinación (ver Tabla S2). En contraste, las clases ontológicas patrón de expresión génica dependiente de ligando incluyen rutas implicadas en la replicación del ADN, la biosíntesis de esteroides /esterol, y la apoptosis (véase la Tabla S3). Por lo tanto, aunque la AR se describe clásicamente como un factor de transcripción, su perfil proteoma sugeriría que el AR es capaz de funciones más allá de lo que inicialmente ha sido descrito como un activador del gen.
El análisis estructural de la hormona de la unión a la T877A -AR
para explorar los posibles mecanismos por los que los ligandos que se unen a la AR mutante crear diferentes conjuntos de AR proteínas que interactúan, se obtuvo la conformación detallada del receptor, utilizando 15 ns dinámica molecular (MD) estudios de simulación (ver Materiales y Métodos) de los ocho ligandos diferentes que se utilizan. Usando el programa de acoplamiento WILMA (Figura 2), se obtuvieron datos estructurales de la mutante AR unidos con progesterona, estrógeno, dexametasona y MB. Los datos estructurales de la AR mutante con la testosterona, DHT, R1881 y acetato de ciproterona ya están disponibles y, como tal, estas estructuras sirven como puntos de partida para los estudios de simulación de MD.
programa de acoplamiento se utilizó para examinar WILMA estructural cambios en el dominio de unión a ligando de la mutación T877A, tras la unión a ligando de unión. Illustrated es la estructura promedio de T877A-AR ligando mutación dominio de unión con ocho ligandos diferentes. A. testosterona, DHT B., C. R1881, D. MB, E. estrógeno (EST), F. progesterona (PGR), G. CPA, H. dexametasona (DEX). Un cuadro rojo se destacan los cambios en la hélice α 11 de bucle tras la unión a cada ligando hormonal.
simulaciones MD mutante AR se realizaron más de 15 ns series de producción. Para inspeccionar la flexibilidad local de cada complejo proteína /hormona, se calcularon las fluctuaciones desviación raíz media cuadrada (RSMD) de átomos del esqueleto de cada residuo de aminoácido para cada complejo AR mutante. En el estudio de conformaciones de las proteínas globulares, se mide habitualmente la similitud en la estructura tridimensional por el RMSD de los átomos de carbono centrales en aminoácidos, después de óptima superposición cuerpo rígido. Las fluctuaciones más significativas corresponden a regiones de bucle entre α3 /α4, α9, α10 /α11 y α11 /α12 y α11 las hélices y α12 a sí mismos de la LBD de AR (Figura 3). Se puede ver que el bucle entre α9, α10 y α11 es la región más flexible en todos los complejos (Figura 3B). Entre los ocho complejos unidos a ligandos AR diferentes, la testosterone- y complejos de estradiol unido demuestran la más alta flexibilidad, con algunos residuos de bucle que tiene fluctuaciones RMSD de hasta 2,4 Å. Aunque estos bucles son distante de la bolsa de unión de la hormona, que están expuestos a la superficie y pueden servir un papel como posibles sitios de unión a otras proteínas asociadas.
A. estructuras promedio superpuestas de todos los complejos de receptor unido ocho ligando. B. Las regiones de bucle T877A AR-LBD entre Helixα9 y Helixα10 mostraron una máxima flexibilidad. C. vista ampliada de la hélice α11 y α12 hélice regiones de T877A AR-LBD obligado a ocho diferentes ligandos estudiados en este estudio. Residuos de α11 y α12 y el lazo entre ellos mostraron una mayor flexibilidad en comparación con otras regiones del receptor donde se encuentra T877A. Color corresponde a los siguientes ligandos:. Verde - testosterona, DHT cian, amarillo-R1881, Pink-MB, Rose-EST, Grey- PGR, Naranja-CPA, púrpura-DEX
El otro principales diferencias observadas entre los complejos AR mutantes son las posiciones de α11 y 12, que son conocidos por ser crítico para dictar la unión de la hormona y co-activador interacciones. Los residuos de α11 y α12 y el lazo entre ellos mostraron una mayor flexibilidad (Figura 3C). La mutación T877A-AR se encuentra en α11 permite un más amplio bolsillo de unión a hormonas y se adaptará a los esteroides con diferentes extensiones dentro del anillo D
.
El examen de la naturaleza y el tamaño del área superficial accesible al disolvente (SASA ) de las proteínas es una herramienta importante para medir el potencial propensión interacción con las proteínas vecinas. Se calculó el promedio de SASA cada complejo AR del 15 ns trayectoria MD. No se observaron grandes diferencias entre los sasas calculados de diferentes complejos mutantes AR, que oscilaban entre 12.124 a 12.390 Å
2. Estos resultados muestran que las diferencias se asocian sobre todo con las regiones α11-α12 de la AR-LBD, donde se encuentra la mutación T877A. Por lo tanto, decidimos comparar la dinámica entre los ocho complejos diferentes, específicamente en esta región, mediante el uso de matrices de RMSD (Tabla 1). Las matrices, que esencialmente capturar los movimientos extremos, revelan regiones de alta flexibilidad, especialmente para CPA y dexametasona, en comparación con otros complejos de AR-ligando.
modelado computacional también se ha llevado a cabo para un número de otro mutaciones AR somáticas en el dominio de unión a ligando (LBD), y mostrar sensibilidad a una amplia gama de ligandos de hormonas, incluyendo, AR-W741L [34], -L701H [35], [36], [37], [38] , -H874Y [39], [40], [41] y -F876L [13]. Determinación de la estructura de LBD entre AR-WT y -H874Y (presente en 22Rv1 células), cuando se une a testosterona en presencia del péptido FXXLF motivo N-terminal o el péptido coactivador TIF2, que se encuentra que todas las estructuras conformadas al receptor nuclear canónica LBD veces [41]. Por otra parte, las estructuras de DHT y R1881 -H874Y ajustaban a -T877A y -W741L LBD unido a ligandos esteroides y nosteroid [34], [42]. Las líneas celulares AR-mutante doble MDA-PCa-2a y MDA-PCa-2b, poseen la L701H y T877A mutaciones somáticas, estas células muestran la transactivación similares AR y las propiedades estructurales LBD con el único mutante AR-T877A células LNCaP a un espectro más amplio de ligandos esteroides y anti-andrógenos, pero también muestran una mayor sensibilidad a los esteroides de cortisol [35], [36].