Extracto
El ácido úsnico compuesto líquenes (UA) es un ácido débil lipofílico que actúa como un servicio de transporte de protones y causa la pérdida de del potencial de membrana mitocondrial interna. En el presente estudio se muestra que el tratamiento UA inducida por la formación de autofagosomas en células cancerosas humanas, pero tuvo efectos mínimos sobre los fibroblastos humanos normales. Sin embargo, el flujo de autofagia era incompleta, la degradación de los contenidos autophagosomal no se produjo y la acidificación era defectuoso. células tratadas con UA demostraron una reducción de los niveles de ATP y la activación de la quinasa AMP, así como señales de estrés celular. UA es por lo tanto probable que desencadenar la formación autofagosoma tanto por las condiciones de agotamiento de la energía y el estrés. Nuestros resultados indican que la H
+ - efecto de la UA y venir no sólo opera en las mitocondrias como se muestra anteriormente, sino también en los lisosomas, y tienen implicaciones para la manipulación terapéutica de la autofagia y la distribución de drogas se ha determinado pH-
. cita: Bessadottir M, M Egilsson, Einarsdottir E, Magnusdottir IH, Ogmundsdottir MH, Ómarsdóttir S, et al. (2012) Protón-Shuttling Liquen compuesto de ácido de Usnic afecta mitocondrial y la función lisosomal en las células cancerosas. PLoS ONE 7 (12): e51296. doi: 10.1371 /journal.pone.0051296
Editor: Gabriele Multhoff, Universidad Técnica de Munich, Alemania |
Recibido: 18 Junio, 2012; Aceptado: 31 Octubre 2012; Publicado: 5 de diciembre 2012
Derechos de Autor © 2012 Bessadottir et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Fondo de Doctorado Eimskip y la Universidad de Islandia Research Fund (www.hi.is). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
los líquenes, la simbiosis entre un socio de hongos y un microorganismo photobiotic, se encuentran en todo el mundo y dar lugar a un gran número de metabolitos secundarios únicos [1]. El derivado dibenzofuran, ácido úsnico (UA) es un metabolito secundario conocido y ha sido estudiado hasta cierto punto [2]. Una amplia gama de actividades biológicas se ha informado de ácido úsnico, por ejemplo antimicrobiano, antipiréticas, efectos anti-virales, anti-inflamatorias y analgésicas [2]. La actividad antitumoral de la UA fue reportado por primera vez hace tres décadas en el carcinoma de pulmón en ratones y en la leucemia P388 [3], [4]. Además, se ha demostrado que el ácido úsnico tiene efectos anti-mitótico en las líneas celulares de cáncer humano [5] y causa una pérdida de células viables en la leucemia, cáncer de pulmón y de mama células [6], [7]. Sin embargo, la exposición a la UA no se activa p53 y no se ha propuesto estar implicado en el daño del ADN [8].
UA es un ácido débil lipofílica (p
K
un 4.4) que puede causar fugas de protones por difusión a través de membranas mitocondriales [9]. En las células de hígado de ratón ácido úsnico altera los procesos metabólicos normales de células desacoplando la fosforilación oxidativa en las mitocondrias y mediante la activación de estrés oxidativo [10]. Las mitocondrias juegan un papel importante en la regulación de las vías de muerte celular y los cambios mitocondriales se han descrito en las células de cáncer, incluyendo una mayor estabilidad, lo que inhibe la liberación de citocromo
c
y la prevención de la inducción de la apoptosis [11]. Nuestro estudio anterior mostró que el tratamiento UA causa la pérdida de potencial de membrana mitocondrial en dos líneas celulares de cáncer diferentes [12]. Curiosamente, se ha demostrado que los cambios en el potencial de membrana mitocondrial pueden conducir a la aparición de la autofagia [13].
autofagia es un proceso que puede tanto la supervivencia de células de cáncer de ayuda durante la escasez de nutrientes, pero también puede promover la muerte de células de cáncer . Las vías moleculares que determinan esta doble función permanecen en la oscuridad, y es probable que la función de la autofagia en el cáncer depende de la etapa del tumor, contexto celular y el tejido de origen [14], [15]. Más de 30 genes de codificación de proteínas diferentes, conocidos como genes relacionados con la autofagia (ATG), se han identificado y los estudios en modelos de ratón han mostrado que macroautofagia es esencial para el mantenimiento de la homeostasis celular en muchos tejidos [16], [17]. La autofagia puede ser activado por el agotamiento de la nutrición o el estrés metabólico y puede variar dependiendo de la demanda de degradación del sustrato y de estímulo. Los sensores de energía señales AMP quinasa al mamíferos objetivo de rapamicina complejo 1 (mTORC1), un importante regulador de la autofagia, que controla directamente la síntesis de proteínas y procesos anabólicos en forma de nutrientes sensibles. vesículas hambre inducida autofágicos están formados, que son susceptibles de contener citosol libre [18], [19]. Además, otras condiciones de estrés tales como orgánulos dañados, patógenos intracelulares o estrés en el retículo endoplasmático pueden inducir la autofagia través de diferentes vías de los activados por inanición [19]. El proceso de maduración, el paso final de la autofagia, implica la entrega y la degradación de la carga de autofagia. La fusión ocurre con los lisosomas y vesículas se fusionan y autofágicos contenidos están degradadas. El ambiente ácido de los lisosomas es esencial para los pasos finales de la autofagia, y mediante la interrupción de la vacuolar H
+ ATPasa, que está implicado en los lisosomas acidificantes, la finalización de la autofagia puede ser inhibida [15], [19].
El objetivo del presente estudio fue explorar aún más las consecuencias de la pérdida de potencial de membrana mitocondrial inducida por la UA. Nos preguntamos si esto provocó la liberación del citocromo
c
y desencadena la apoptosis. se esperaría que la pérdida de potencial de membrana y la propiedad de la AU a los protones de transporte a través de membranas para dar lugar a una disminución en la producción de ATP por las mitocondrias [9]. Hemos encontrado que las células cancerosas tratadas UA habían disminuido los niveles de ATP y aumento de la fosforilación de la quinasa AMP. Curiosamente, UA provocó la autofagia, pero sin degradación de los contenidos autophagosomal, lo que sugiere un efecto perjudicial sobre la acidificación autophagolysosomal. Nuestros resultados indican que la inducción de la autofagia estaba mediada por una combinación de la respuesta a la escasez de nutrientes, así como el estrés celular
.
(A) Los niveles de ATP, medida en un luminómetro, se redujeron en células T47D después del tratamiento con UA (10 mg /ml; DMSO 0,2%) durante 24 horas. Los datos se presentan como la luminiscencia /célula de cada grupo en comparación con el control de DMSO. Las barras de error indican el error estándar de la media, * p & lt; 0,05. (B) La fosforilación de la quinasa AMP, verificado por transferencia de Western, se detectó en las células T47D después del tratamiento con UA (10 mg /ml; DMSO 0,2%) durante 24 y 48 horas
Materiales y Métodos.
material vegetal, cultivo celular y exposición al ensayo de sustancias
(+) - ácido de Usnic (97%) se aisló de
Cladonia arbuscula gratis (Wallr.) Rabenh. (Cladoniaceae) recogidos en campo abierto en Islandia, no de propiedad privada. Aislamiento e identificación se realizaron como se describe [12]. La sustancia se disolvió en dimetilsulfóxido (DMSO; Merck, 2951) y se diluyó para su uso en un medio de cultivo de tejidos. Todas las pruebas incluyeron controles que se utilizó la concentración equivalente más alta de DMSO. Las líneas celulares de cáncer de mama T47D y MCF7 y la línea celular de cáncer pancreático Capan-2 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATTC) a través de LGC Promochem. T47D contiene una sola copia mutada de p53 [20], pero Capan-2 y MCF7 son homocigotos para p53 de tipo salvaje [21]. MCF7 es receptor de estrógeno positivo [22]. fibroblastos humanos primarios se cultivaron a partir de biopsias de piel normal y se utilizaron en el paso 6-13 (permiso Comité Nacional de Bioética VSNb2006020001 /03-16; obtuvo el consentimiento informado). Todas las líneas celulares se mantuvieron en RPMI-1640 medio de cultivo tisular (GIBCO ™, 52400), que contiene 0,5% de penicilina y estreptomicina (GIBCO ™, 15140-148) y suero bovino fetal inactivado por calor al 10% (FBS; GIBCO ™, 10270) con T47D recibir adicionalmente 0,01 mg /ml de insulina (Sigma, I1882) y se subcultivaron después de desprendimiento por la tripsina (0,25% de tripsina /EDTA, Difco ™, 215240) según sea apropiado. Las células se sembraron en un número adecuado para exceder 70 a 80% de confluencia después de 24 horas de cultivo. se añadieron; (Sigma, D150959 10 mM) y disolvente de control y las células se incubaron bajo condiciones estándar, por diferentes períodos de tiempo ácido úsnico (5 o 10 mg /ml), la metformina - (+). Para la inducción de la autofagia con la privación de nutrientes, las células se incubaron con solución de Hank (Sigma, H9394) durante los últimos 40 minutos del tiempo de incubación.
La inducción de vacuolas autofágicos, con membranas dobles característicos de autofagosomas, se detectó por microscopía electrónica en las células T47D después del tratamiento con UA (2,5 y 5,0 g /ml; DMSO 0,1%) durante 24 horas. Las flechas negras indican vacuolas autofágicos, flechas blancas indican la formación de doble membrana.
(A) Se ha detectado un aumento en LC3 puntos lagrimales, por inmunofluorescencia en células T47D y MCF7 después del tratamiento con UA (10 mg /ml) durante 24 horas. No se observó efecto alguno en los fibroblastos normales. La barra de escala que se muestra representa a 20 micras y se aplica a todos los paneles. (B) puntos lagrimales LC3 por célula se contaron y se cuantificó mediante ImageJ y datos representados como puntos lagrimales LC3 /célula de cada grupo en comparación con el control de DMSO. Las barras de error indican el error estándar de la media, * p & lt; 0,05, ** p & lt; 0,001. (C) Aumento de LC3 I y LC3 II, verificado por transferencia de Western, se detectó en las células T47D después del tratamiento con UA (10 mg /ml; DMSO 0,2%) durante 24 horas
Estimación de. Los niveles de ATP
células se separaron mediante tripsinización, una pequeña alícuota retira para el recuento y se cosecha usando 0,5 M de ácido perclórico (Merck, 1.00519) durante 10 min a 4 ° C. Después de la centrifugación 10 l del sobrenadante se mezclaron con 1 ml de agua destilada. La bioluminiscencia se ensayó utilizando 75 l de reactivo de luciferasa (Promega, FF2021) que lisan las células y siempre que el sustrato luciferina. La luminiscencia se midió en un luminómetro (Turner TD 20/20) y se expresó como luminiscencia /célula.
(A) No se detectó la degradación de p62, mediante transferencia Western, en células T47D y MCF7 después del tratamiento con UA ( 5.0 y 10 g /ml, 24 h; DMSO 0,1%). (B) Lysotracker, detectado por microscopía de fluorescencia, muestra la tinción difusa en las células T47D después del tratamiento con UA (10 mg /ml; DMSO 0,2%) durante 24 h y 72 h. (C) Lysotracker intensidad por célula se cuantificó mediante ImageJ y los datos se presentan como media de fluorescencia valor de cada grupo en comparación con el control de DMSO. Las barras de error indican el error estándar de la media, ** p & lt; 0,001. La barra de escala que se muestra representa 100 micras y se aplica a todos los paneles. (D) No se detectaron efectos sobre la inmunotinción Lámpara2, después del tratamiento con UA
(
10 mg /ml; DMSO al 0,2%) durante 24 horas. La barra de escala que se muestra representa 100 micras y se aplica a todos los paneles. (E) Un plásmido que expresa mRFP-GFP-LC3 se transfectó en células T47D. La falta de la acidificación autophagolysosomal se observó después del tratamiento con UA (10 mg /ml; DMSO 0,2%) durante 24 horas por detección de distintos puntos lagrimales GFP. La barra de escala que se muestra representa 20 micras y se aplica a todos los paneles.
Microscopía Electrónica de
Después de un tiempo de incubación de 24 horas en condiciones estándar células se cosecharon por tripsinización y se fija en 1 ml de glutaraldehído (Ted Pella Inc, 18426) solución durante 60 minutos a temperatura ambiente, luego se centrifuga y se almacenó a 0-5 ° C durante 24 horas. Después de retirar el glutaraldehído, se añadieron dos gotas de una solución gelatinizada 2% (Ted Pella Inc., 19225) de agua destilada al sedimento celular, se mezcla cuidadosamente y se almacenó a 0-5 ° C durante 24 horas. A continuación, las muestras se lavaron dos veces con PBS y tetróxido de osmio (Ted Pella Inc, 18463) añadido a cada muestra durante una hora y se lavaron de nuevo con PBS. Las muestras fueron cortadas en pedazos de 2-5 mm bajo una macrosco- usando hojas de afeitar. Las piezas se deshidrataron usando etanol (Merck, 64271D) a concentraciones crecientes, bajo rotación. Se añadió resina epoxi (Ted Pella Inc, 18300), primero a 1:01 (vol: vol) con% de etanol 99 (Merck, 64271) durante una hora, a continuación resina dos veces sólo por una hora cada vez. Los moldes se colocan entonces en un horno a 70 ° C durante 24 horas. Después, la resina se cortó con un cuchillo de vidrio (espesor de aproximadamente 0,5 micras) y se tiñeron con azul de toluidina para la selección de muestras para el corte con un cuchillo de diamante (70 a 100 nm de espesor). Las muestras se colocaron en un marco de cobre antes de la tinción con una solución de citrato de plomo 0,06 g /ml (Ted Pella Inc, 19314) y se visualizaron utilizando un microscopio electrónico Philips EM300. Las imágenes proyectadas se desarrollaron utilizando procedimientos estándar para fotografiar. La película revelada se escanea en un ordenador con un Nikon Coolscan V ED
(A) Se ha detectado una disminución de p-p70s6k, mediante tinción con inmunoperoxidasa, después del tratamiento con UA (10 mg /ml;. DMSO 0,2% ) durante 24 horas. La barra de escala que se muestra representa 100 micras y se aplica tanto a los paneles. Se detectó (B) Un aumento de p-eIF2α, después del tratamiento con UA (10 mg /ml; DMSO 0,2%). durante 6 horas
inmunocitoquímica
Para la tinción de inmunofluorescencia, se recogieron las células y se fijaron en paraformaldehído al 4% (Sigma, P6148) y se tiñeron con anti-citocromo
c, el anticuerpo monoclonal IgG2a
ratón (Abcam, ab110325), exfoliados caspasa-3, anticuerpo policlonal de conejo (Señalización celular, 9661) o LAMP2, anticuerpo monoclonal de ratón IgG1 (H4b4, obtenido de Escuela Universitaria de Medicina, Baltimore), seguido de Alexa Fluor rojo 546 de cabra anti-anticuerpo de conejo IgG (Invitrogen, A11010), anticuerpo IgG Alexa Fluor verde 488 de cabra anti-conejo (Invitrogen, A11070) o Alexa Fluor rojo anti-IgG de ratón
546 se utilizó anticuerpo de cabra 2a (Molecular Probes, A11018) Para la tinción nuclear A-PRO-3 yoduro (Invitrogen, T3605). Para la detección LC3 las células se fijaron con metanol (Sigma, 34860) durante 10 min a -20 ° C y se tiñeron con anti-LC3B (D11), anticuerpo de conejo IgG monoclonal (Sigma, L7543) seguido de Alexa Fluor 488 cabra contra verde -rabbit IgG anticuerpo (Invitrogen, A11070). Las células teñidas se visualizaron y se fotografiaron con un microscopio confocal (Zeiss, LSM 5 Pascal). Para la tinción de las células con inmunoperoxidasa se fijaron con metanol (Sigma, 34860) durante 5 min a -20 ° C y se tiñeron con anti-fosfo-p70S6 quinasa (Thr389; 108D2), IgG de conejo, anticuerpo monoclonal (Cell Signaling, 9234), anti -LC3B (D11), anticuerpo de conejo IgG monoclonal (Sigma, L7543) y anti-p62 (SQSTM1), anticuerpo policlonal de conejo (Enzo, PW9860) seguido de incubación con inmunoglobulinas anti-conejo de ratón monoclonal IgG1k (Dako, M0737), policlonal de conejo inmunoglobulinas anti-ratón IgG (Dako, Z0259), PAP, peroxidasa de rábano picante y monoclonales de ratón anti-inmunocomplejos rábano picante, IgG1 (Dako, P850) y las tabletas DAB, cromógeno (Dako, S3000). Las células teñidas se visualizaron y fotografiaron con un microscopio óptico bajo (Leica DMI 3000B).
Análisis de Western Blot
Las células se recogieron y se lisaron con tampón RIPA. El contenido de proteína se cuantificó espectrofotométricamente usando el reactivo de Bradford (Sigma, B6916). Las proteínas se separaron en NuPAGE 10% Bis-Tris Mini geles y transferidos a una membrana de 0,2 M de difluoruro de polivinilideno (PVDF) mediante electrotransferencia. Las membranas se sondaron con anti-fosfo-AMPKα (Thr172) (Cell Signaling, 4188) de conejo IgG anticuerpos monoclonales, anti-p62 (SQSTM1), anticuerpo policlonal de conejo (Enzo, PW9860), anti-LC3B (D11), el anticuerpo monoclonal IgG de conejo (Sigma, L7543), anti-fosfo-eIF2α (Ser51) (Cell Signaling, 9721) anticuerpo policlonal de conejo o anticuerpo policlonal de conejo anti-G3PDH anti-humano (amp I +; D Systems, 2275-PC-1). El anticuerpo secundario utilizado fue IgG de cabra anti-conejo /HRPlinked (Cell Signaling, 7074S) y el anticuerpo secundario conjugado con IRDye-680 o 800 (Metabion, 68021). Las proteínas se visualizaron mediante el kit de detección de quimioluminiscencia potenciada (ECL) (GE Healthcare, RPN2132) y se detectó la señal usando una película de alto rendimiento de quimioluminiscencia (GE Healthcare, 91415) o detectados por el sistema óptico de infrarrojos Odyssey.
Visualización de los lisosomas por LysoTracker Sondas
El medio de cultivo de tejidos fue reemplazado por pre-calentado (37 ° C) 75 nM Lysotracker Red DND-99 (Invitrogen, L7528) y las células se incubaron a 37 ° C durante 1 h. a continuación, solución de carga se lavó de y se sustituye por medio fresco y las células teñidas se visualizaron y se fotografiaron bajo el microscopio de fluorescencia (Leica DMI 3000B). LysoTracker es una sonda fluorescente acidotropic para el etiquetado y rastreo de orgánulos en las células ácidas. La forma protonada de esta sonda se acumula en los compartimientos ácidos, donde forma agregados que presentan fluorescencia de color rojo brillante.
La transfección con tfLC3 Construct
El plásmido mRFP-GFP tándem LC3-etiquetado fluorescente (tfLC3) construir fue proporcionado amablemente por el Prof. Kevin Ryan, Instituto Beatson, como Universidad de Glasgow, con el permiso del Prof. Tamotsu Yoshimori, Universidad de Osaka [23], [24]. Se utilizó basada (CCMB) la transformación de calcio /manganeso de las cepas de E. coli DH10B de lo descrito previamente [25]. La transfección se realizó utilizando TransPass D2 (BioLabs, M2554S) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después de la transfección las células se expusieron a las sustancias de prueba o de privación de nutrientes como se describe anteriormente. Las células se recogieron y se fijaron en paraformaldehído al 4% (Sigma, P6148), y se visualizaron y fotografiaron con un microscopio confocal (Zeiss, LSM 5 Pascal).
Análisis estadísticos
Las comparaciones estadísticas de los valores medios se realizaron utilizando dos análisis unilateral de la varianza (ANOVA), incluyendo el tratamiento y el número de ejecución como factores, seguido de un poste. hoc mediante la comparación de Tukey HSD. valores de p se describen en el texto en los puntos apropiados. En todas las figuras, * y ** indican p & lt; 0,05 y p & lt; 0,001, respectivamente. Las imágenes y los datos mostrados son representativos de lo que se observó en al menos tres experimentos separados.
Resultados y Discusión
La vía intrínseca de la apoptosis se activa con la apertura de los poros en la membrana mitocondrial externa que conduce a liberación de citocromo
c
en el citosol y la activación de la cascada de caspasas [26]. Para dar seguimiento a nuestro trabajo anterior sobre los efectos de la UA en potencial de membrana mitocondrial [12] investigamos citocromo
c
fugas y la escisión de la caspasa-3 por inmunotinción en la línea celular de cáncer de mama T47D y la línea de células de páncreas Capan-2. Sin citocromo
c
liberación o exfoliados caspasa-3 productos fueron detectables después del tratamiento con ácido úsnico (10 mg /ml) después de 24, 48 y 72 horas (datos mostrados durante 72 horas;. Fig. S1A y S1B Fig ). Estos resultados apoyan nuestros datos anteriores que la AU provoca necrosis tarde, pero no apoptosis [12], e indican que, aunque se interrumpe el gradiente de pH mitocondrial, las propias mitocondrias están intactos.
Se ha informado de que las causas de ácido úsnico desacoplamiento de la mitocondria [27], inhibe la respiración mitocondrial y provoca una caída en los niveles de ATP en los hepatocitos murinos [10]. los datos de expresión génica de análisis de microarrays se ha fortalecido la sugerencia de que lanzaderas de ácido úsnico protones contra el gradiente creado por el transporte electrónico mitocondrial, ya que conduce a la inducción de genes asociados con los complejos I-IV de la cadena de transporte de electrones [9]. Para investigar más a fondo, se evaluaron los niveles de ATP y la fosforilación de la quinasa AMP analizado en células T47D. Los resultados indican que el tratamiento UA lleva a la disminución de los niveles celulares de ATP después del tratamiento de 24 horas (5,0 mg /ml p = 0,0523, 10 mg /ml p = 0,010). Como era de esperar, los niveles disminuidos de ATP se asociaron con un aumento de la fosforilación de la quinasa AMP después de que ambos 24 y 48 horas de tratamiento (10 mg /ml) (Fig. 1A y B).
Esta disminución en los niveles de energía celular y disparo del mecanismo de detección sería de esperar para inducir la autofagia. análisis de microscopía electrónica de las células T47D tratados con UA (2,5 y 5,0 mg /ml) durante 24 horas indicadas más marcada presencia de vacuolas autofágicas, con membranas dobles característicos de autofagosomas, en comparación con el control (Fig. 2). Estos resultados fueron seguidos por análisis para LC3 puntos lagrimales por inmunofluorescencia, y una estimación de la abundancia de autofagosomas, en diferentes puntos temporales y los tratamientos de tres tipos de células (Fig. 3A, Fig. 3B y Fig. S2A-C). No hay efectos se observaron después del tratamiento con UA (10 mg /ml) durante 2 horas en cualquiera de las tres líneas de células, pero se observó un aumento después del tratamiento con el fármaco metformina antidiabético en la línea celular de cáncer de mama T47D, que no era ya presente después del tratamiento prolongado. La metformina ha sido previamente demostrado para estimular AMP quinasa ya después de una hora [28]. Después de 24 horas de tratamiento con UA (10 mg /ml) un aumento significativo en LC3 puntos lagrimales fue evidente en comparación con los controles en las líneas celulares de cáncer de mama dos. La tinción de inmunoperoxidasa de las células T47D también mostró una mayor presencia de LC3 puntos lagrimales después del tratamiento UA (Fig. S2D). Estos resultados fueron confirmados mediante la observación de un aumento en LC3 LC3 I y II por Western Blot (Fig. 3C). Los efectos sobre los fibroblastos de la piel normal no fueron marcados. Por comparación, las células se mueren de inanición por 40 min de incubación en solución equilibrada de nutrientes, libre de Hank. A pesar de que la inspección visual sugiere la presencia de la formación autofagosoma en las células de hambre (Fig. 3A), puntos lagrimales LC3 eran difíciles de contar y este tratamiento dura no fue bien tolerado por las células.
Después de haber observado un aumento en LC3 puntos lagrimales después del tratamiento con AI, se investigó si la formación de vacuolas autofágicos fue seguido por un flujo de autofagia. Los niveles de p62 de carga autophagosomal fueron evaluados después de la exposición a la AU. La concentración de p62 se ha demostrado que disminuir si se aumenta el flujo de autofagia, ya que se degrada en el proceso [29]. Formación de autofagosomas como resultado del tratamiento con UA después de 24 horas (5,0 y 10 mg /ml) en células T47D y MCF7 (Fig. 4A y la Fig. S3) no fue seguido por la degradación de la proteína internalizada. La ausencia de degradación de p62 a las 24 horas sugiere una interrupción de la acidificación lisosómica y autophagolysosome maduración que podría ser causada por el protón shuttling propiedades del ácido úsnico través de la membrana lisosomal, como se ve en la despolarización de la mitocondria [9], [10].
a fin de evaluar los efectos de la UA en los lisosomas se utilizó el LysoTracker marcador lisosomal en las células T47D que las etiquetas y seguimiento de los orgánulos en las células ácidas. Los resultados revelaron muy marcadas aumento difuso de tinción LysoTracker en células T47D después del tratamiento UA durante 24 y 72 horas (Fig. 4B y Fig. 4C). Este patrón de tinción se ha interpretado como la dilatación lisosomal como causada por el tratamiento con cloroquina, que se acumula dentro de los lisosomas. En las células tratadas con cloroquina, la inmunotinción para la proteína de la membrana lisosomal Lamp1 copió el patrón obtenido con LysoTracker, confirmando así lisosomal dilatación [30]. Por el contrario, en nuestros experimentos, la tinción de inmunofluorescencia para la Lamp2 proteína lisosómica no mostró cambios morfológicos y no se observó diferencia entre las células tratadas y no tratadas (Fig. 4D). Esto indica que el LysoTracker manchaba fuera del lisosoma y podría explicarse por el hecho de que la retención del colorante en el interior de los lisosomas depende de pH ácido [31]. La tinción difusa LysoTracker después del tratamiento UA podría por lo tanto ser debido a los protones de ser transportados fuera de los lisosomas, en forma similar a como ocurre a través de la membrana mitocondrial.
Para explorar la maduración autophagosome después del tratamiento UA, se utilizó una construcción de plásmido , tfLC3 (mRFP-GFP-LC3 tándem proteína fluorescente de etiquetado), con la que transfectaron las células T47D. Este método se ha utilizado anteriormente para seguir el proceso de maduración de la autofagia. El GFP-LC3 pierde fluorescencia debido a la acidez lisosomal, mientras que la fluorescencia mRFP es estable [23], [24]. Los resultados mostraron que en las células de hambre fluorescencia de GFP fue atenuada que implica condiciones ácidas y la degradación por hidrolasas lisosomales, mientras que mRFP fluorescencia se mantuvo estable. Después del tratamiento con UA durante 24 horas, se observó GFP, así como la fluorescencia mRFP que indica la interrupción de la acidificación autophagolysosomal y las condiciones de degradación alterado tras el tratamiento con UA (Fig. 4E). El fracaso de estas células para completar la autofagia podría contribuir a la acumulación de vacuolas autofágicos y retención de p62 no degradado.
Una de las características adaptativas de la mayoría de los cánceres es pH mal regulada. En las células normales pH intracelular es más bajo que el pH extracelular. En las células cancerosas el gradiente se invierte la creación de un entorno favorable para la progresión metastásica. pH intracelular superior se mantiene debido al aumento de H
+ de flujo de salida debido a cambios en la expresión y /o actividad de bombas de membrana de plasma y transportistas [32]. El gradiente de pH en las células tumorales es beneficiosa para la acumulación celular de ácidos débiles, tales como el ácido úsnico, causando ácidos débiles sean principalmente neutral a pH bajo y facilitar su transferencia a través de la membrana. El tratamiento con UA muestra la inducción significativa de los genes que están conectados a los complejos I al IV de la cadena de transporte de electrones, que podrían ser un mecanismo de compensación para preservar el gradiente de protones a través de la membrana mitocondrial interna [9], [32].
Estudios de varios síndromes heredados que predisponen a diversos tipos de tumores y carcinomas han conducido a la identificación de la vía de mTOR como un regulador de la autofagia. Entre los objetivos intermedios de mTORC1 son p70S6K y 4EBP1, que tienen un papel esencial en el control del ciclo celular y la proliferación [33], [34]. En la Fig. 1B que muestran que la AU-quinasa activa AMP, lo que indica que el complejo mTORC1. Para explorar objetivos de abajo mTORC1 se analizaron los efectos en las células tratadas con el acceso universal en p70S6K fosforilada por tinción con inmunoperoxidasa. Los resultados mostraron una marcada disminución en la tinción después del tratamiento durante 24 horas (Fig. 5A). Las células responden a la escasez de nutrientes mediante la inducción de la autofagia, pero este proceso también pueden ser provocados por el estrés celular [19]. Para explorar si UA podría desencadenando la autofagia por otro mecanismo que hemos probado para la evidencia de estrés celular en células T47D después del tratamiento con UA (10 mg /ml) durante 6 horas. El aumento de la fosforilación de eIF2α, que es uno de los signos reconocidos de estrés ER, fue detectado (Fig. 5B).
Los efectos del ácido úsnico en la autofagia pueden ser comparados con los descritos para la cloroquina medicamento contra la malaria que se encuentra actualmente en ensayos clínicos en combinación con regímenes anticancerosos [19]. La cloroquina es una base débil (p
K
un 8,5) y se acumula en el interior de los lisosomas, que se distienden y disfuncional, bloqueando el flujo de autofagia [19]. En cambio, el ácido úsnico es un ácido débil que transporta protones a través de las membranas, lo que aumenta pH lisosomal, como se muestra por la retención de la señal de GFP, pero la forma lisosomal no se vio afectada (tinción LAMP2). estrés ER es inducida por la inhibición del proteasoma y la autofagia asociado-ER, por tanto, es particularmente relevante para la terapia del cáncer con inhibidores del proteasoma. Se ha demostrado que la combinación de cloroquina con el inhibidor del proteasoma bortezomib aumenta la muerte de células tumorales
in vitro
y
in vivo
[35]. La captación celular y la distribución intracelular de fármacos se ve afectada por el pH [32], [36]. La cloroquina puede, por ejemplo, evitar el secuestro intracelular en los lisosomas [36] pero no tiene efecto sobre la acumulación mitocondrial de daunorrubicina, lo que sugiere que el compuesto no afecta a pH mitocondrial [37]. Dado que el ácido úsnico afecta pH en los lisosomas y mitocondrias se predice para influir en la distribución intracelular de los fármacos.
En conclusión, nuestro estudio previo ha demostrado que la AU causa la pérdida de potencial de membrana mitocondrial. En el presente estudio, hemos demostrado que esto no conduce a la liberación de citocromo
c
y desencadenar la apoptosis. El H
+ shuttling efecto de UA opera en dos orgánulos, mitocondrias y lisosomas y su efecto sobre la formación autophagosome es probable que ser activado tanto por las condiciones de agotamiento de la nutrición y de estrés. flujo autofagia es sin embargo incompleta y la degradación del contenido autophagosomal no se produce. Nuestros resultados tienen implicaciones para la manipulación terapéutica de la autofagia y la distribución de drogas determinado pH.
Apoyo a la Información
Figura S1.
UA no causa la apoptosis. (A) El citocromo c de fuga no era detectable, por inmunofluorescencia en T47D y Capan-2 células después del tratamiento con UA (10 mg /ml; DMSO 0,2%) durante 24, 48 y 72 horas. (B) No hay productos de escisión de la caspasa-3 fueron detectables después del tratamiento con UA (10 mg /ml; DMSO 0,2%) después de 24, 48 y 72 horas. La barra de escala que se muestra representa 20 micras y se aplica a todos los paneles
doi:. 10.1371 /journal.pone.0051296.s001 gratis (TIF)
figura S2.
UA induce la formación de vacuolas autofagosoma. LC3 puntos lagrimales por célula se contaron y se cuantificó mediante ImageJ y los datos se presentan como el nivel de confianza de la familia sabia 95%. células (A) T47D tratadas con UA para las 2 y 24 horas. células (B) MCF7 tratados con UA para 2 y 24 horas. (C) los fibroblastos humanos normales tratados con UA durante 2 y 24 horas. se detectó (D) Un aumento en LC3 tinción con inmunoperoxidasa, en células T47D después del tratamiento con UA (10 mg /ml; DMSO 0,2%) durante 24 horas. La barra de escala que se muestra representa el 100 micras y se aplica tanto a los paneles
doi:. 10.1371 /journal.pone.0051296.s002 gratis (TIF)
Figura S3.
UA no conduce a la degradación de p62. No se detectó ninguna disminución de la p62 tinción con inmunoperoxidasa, en T47D células después del tratamiento con UA (10 mg /ml; DMSO 0,2%) durante 24 horas. La barra de escala que se muestra representa el 100 micras y se aplica tanto a los paneles
doi:. 10.1371 /journal.pone.0051296.s003 gratis (TIF)
Reconocimientos
Estamos muy agradecidos a miembros del Centro Biomédica de la Universidad de Islandia, Johann Arnfinnsson para ayuda con la microscopía electrónica y Jenny Björk Thorsteinsdottir para la asistencia técnica. Agradecemos a Anna Helga Jónsdóttir para obtener ayuda con las estadísticas.