Extracto
Las neuronas sensoriales proporcionan información importante para los sistemas de motor de generación de patrones. En el sistema nervioso crustáceo stomatogastric (STNS), la retroalimentación del receptor anterior gástrico (AGR), una neurona receptor muscular, da forma a la actividad de los circuitos de motor en el ganglio stomatogastric (STG) a través de vías polisinápticas implican ganglios anterior. La soma AGR se encuentra en la parte posterior del nervio dorsal del ventrículo a la STG y se ha pensado que su axón pasa a través del STG sin hacer contactos. El uso de alta resolución de la microscopía confocal con las neuronas de tinte llena, se muestra aquí que AGR del cangrejo
Cancer borealis
también tiene proyecciones locales dentro de la STG y que estas proyecciones forman sitios de contacto con las neuronas motoras candidatos STG o con descendente fibras de entrada de otros ganglios. Desarrollamos y explotación de un nuevo método de enmascaramiento que nos permite tinción presináptica y postsináptica potencialmente separada de marcadores sinápticos. Los procesos de AGR en el STG muestran la diversidad en la forma, el número de ramas y la estructura de ramificación. El número de proyecciones AGR de la STG varía de uno a tres sencillo multiplicar procesos ramificados. Las proyecciones vienen en estrecho contacto con las neuronas motoras y las neuronas gástricos descendente y también pueden acoplarse eléctricamente a otras neuronas de la STNS. Por lo tanto, además de las vías de bucle largo bien descritos, es posible que AGR participa en la regulación de integración y el patrón directamente en el STG.
Visto: Goeritz ML, MR Bowers, Slepian B, E Marder (2013) Proyecciones Neuropilar de la anterior gástrica receptor de neurona en el ganglio Stomatogastric del cangrejo Jonás,
Cáncer Borealis
. PLoS ONE 8 (12): e79306. doi: 10.1371 /journal.pone.0079306
Editor: Melissa J. Coleman, universidades de Claremont, Estados Unidos de América
Recibido: Marzo 4, 2013; Aceptado: September 20, 2013; Publicado: Diciembre 3, 2013
Derechos de Autor © 2013 Goeritz y col. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Con el apoyo de Institutos nacionales de Salud de subvención NS 17813-32 a Eva Marder. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
retroalimentación sensorial de los receptores musculares da forma a la actividad de las neuronas motoras en ( "circuito corto") mono- y disynaptic de estiramiento o de resistencia reflejos. Además, la mayoría de las vías reflejas tienen polisináptico ( "loop-larga") componentes que son cruciales para adaptarse a los reflejos diferentes estados de comportamiento. De hecho, la retroalimentación sensorial de la fase específica para las neuronas de vertebrados e invertebrados de motor durante la actividad motora rítmica puede causar reflejos para revertir o se convierten en un componente de las redes de la generación del ritmo-a sí mismos [1-7].
Los mecanismos subyacentes de la integración sensorial durante la modificación del reflejo no se entienden completamente. Sin embargo, muchos de los aspectos funcionales de la integración de retroalimentación, tales como la inhibición presináptica y spiking antidrómica, se pueden vincular a las estructuras del motor o las neuronas sensoriales [8]. El examen de la morfología de una neurona con detalle abre la puerta a preguntas interesantes. Como variables son las estructuras de las neuronas identificadas a través de los animales individuales? Los parámetros que deben ser preservados para mantener la función consistente dentro de una red? Estas preguntas son particularmente difíciles de tratar en grandes redes en las que la identificación del tipo de células es ambigua y exacerbado por estructuras ramificadas complicados.
Hay una gran cantidad de pruebas para distintas reglas que rigen los aspectos de la morfología de las células durante el desarrollo de la red. La distribución de las moléculas atrayentes y repelentes y los respectivos receptores en la médula espinal en desarrollo puede determinar la posición del soma, la orientación del cono de crecimiento axonal, y el cruce de la línea media del axón [9-13]. La forma y la posición de la misma neurona sin embargo a menudo varían de un animal a otro, como se ve en el ganglio crustáceo stomatogastric (STG), donde sólo algunas de las características de la morfología de las neuronas se comparten entre los animales [14-16]. Para entender mejor estos aspectos de la morfología neuronal, aquí examinamos una neurona sensorial en las DTR que está involucrado en un amplio conjunto de vías reflejas, pero tiene una estructura ramificada relativamente simple.
rítmicamente redes activas en el sistema nervioso stomatogastric movimiento de control (STNS) de los músculos del estómago de los crustáceos. Durante la actividad molino gástrico, la protracción y retracción de los dientes estómago es controlado por la coordinación de la red de molino gástrico [17]. Al igual que en las langostas y cangrejos de río, el receptor gástrica anterior (AGR) en
C. borealis
tiene un soma bipolar que se encuentra en el en el nervio dorsal del ventrículo (DVN) o, con menos frecuencia, en la parte posterior de la STG y proyectos en el nervio dorsal gástrica (DGN) [18]. proyecto dendritas bilaterales en el molino de dos gástrica músculos 1 (
gm1
), donde se inician los picos cerca de los
gm1
músculos [19]. Los proyectos de los axones AGR en una vía de bucle largo a través de la STG y hace excitadoras e inhibidoras conexiones en los ganglios de la comisura anterior emparejado (engranajes) con las neuronas de proyección que se alimentan de nuevo a los circuitos de motores STG [17,20-24].
El único AGR es un receptor de la fuerza muscular en los
gm1
músculos. La neurona AGR integra la información propioceptiva de ambos lados del animal, sino también funciona de manera similar a un interneuron influyendo gástrico y actividad de la red pilórica, independiente de sus propiedades de receptor [25]. Múltiples zonas de iniciación de la espiga dendríticas y axonales responden a diferentes neuromoduladores [21,24-27]. Además, los neuropéptidos interruptor de disparo AGR entre el modo de tónico spiking o el modo de ruptura, que cada activar un patrón motor gástrico diferente [28]. Trabajos recientes han demostrado que las acciones de AGR están influenciadas por otras neuronas sensoriales (Barriere et al., 2008) y que los efectos de AGR cocción dependen del momento en que se activa durante ritmos molino gástrico (Smarandache et al., 2008).
Hasta el momento, todas estas acciones fisiológicas de la actividad de red y el píloro gástrico se han atribuido a la vía refleja polisináptica bucle largo a través de las portadas de los dientes anteriores. Ningún estudio detallado de la morfología AGR dentro del STG existe y, hasta ahora, no han sido neurópila descrito proyecciones en el STG. Ahora proporcionamos descripciones anatómicas de las proyecciones de AGR en el neurópila STG.
> Animales y disecciones
cangrejos adultos Jonás (
Cancer borealis
) se obtuvieron a partir de locales de langosta (Boston, MA). Todos los animales se mantuvieron en tanques de agua de mar artificial a 10-13 ° C en un 12 horas de luz /12 horas de oscuridad sin alimentos. Cangrejos se anestesiaron en hielo durante 30 minutos. Se realizaron disecciones como se describe anteriormente [29] en solución salina fisiológica fría que consiste en: NaCl 440 mM, KCl 11 mM, MgCl 26 mM
2, CaCl 13 mM
2, 11 base de Trizma mM, 5 mM de ácido maleico, pH 7,45.
Electrofisiología
El STNS fue inmovilizado en una placa recubierta con Sylgard. El STG se desheathed y registros intracelulares de la somata y neuropil se hicieron con microelectrodos de vidrio 12-40 mO llenas de 0,6 M KSO
4 y KCl 20 mM, amplificado con cabezales 1x del SA y Axoclamp 2A y 2B amplificadores (Molecular Devices) . la actividad extracelular se registró con electrodos pasador de acero inoxidable que se colocaron en los pocillos de vaselina en los nervios motores y amplificada y filtrada con un amplificador diferencial (sistemas AM). Para la identificación de las neuronas motoras, grabaciones soma intracelulares fueron comparados con registros extracelulares del nervio motor apropiado. Durante la grabación, el STNS se superfused continuamente con enfriada (9-13 ° C) solución salina
llena la célula
Somata o axones se llenaron ya sea con:.
a. 2% Amarillo Lucifer CH dipotásico sal (LY; Sigma, número de catálogo L0144) en agua filtrada, España
b. 4% tetrametilrodamina-dextrano 3KDa, lisina corregible (TMR; Molecular Probes, número de catálogo D3308) en 0,2% KAc, España
c. 4% neurobiotin trazador (Vector Laboratories) en Tris 50 mM de tampón y 0,5 M KCl, o
d. 10 mM Alexa Fluor 568 o sal 594-hidrazida de sodio en 200 mM KCl (Molecular Probes, números de catálogo A10441 y A10442).
Para todos los marcadores, las puntas de los electrodos de vidrio de baja resistencia (3-16) mO fueron rellenadas por la acción capilar durante 10 minutos. Para TMR, la parte posterior de los electrodos se llenó de 2M KAc, dejando un pequeño espacio entre la KAc y la TMR en la punta. Amarillo lucifer y Alexa Fluor-hidrazidas se inyectaron por 20-50 minutos con impulsos negativos entre -3 y -11 nA de 0,5 s de duración a 0,1-1 Hz hasta los procesos de neuropilo finos de la célula eran visibles con un microscopio de fluorescencia (Leica MF165 FC). TMR y Neurobiotin se inyectaron durante al menos 50 minutos con 3 impulsos positivos nA de corriente (4-13) o Neurobiotin nA impulsos positivos actuales (TMR) de 0,5 s de duración a 1 Hz. A menos que se indique lo contrario, las preparaciones se fijaron con 3,5% de paraformaldehído en solución salina tamponada con fosfato (PBS; mM NaCl 440, 11 mM KCl, Na 10 mM
2HPO
4, KH 2 mM
2 PO
4 , pH 7,4) durante 40 a 90 minutos a temperatura ambiente dentro de 3 horas después del llenado con LY, neurobiotin y TMR y dentro de 30 minutos después de llenar con Alexa Fluor-hidrazidas. Las preparaciones se lavaron con 0,01 M PBS-T (0,1 a 0,3% de Triton X-100 en PBS) y se almacenaron durante 0-7 días a 4 ° C antes del procesamiento.
amplificación tinte
La señal LY se amplificó mediante la adición de un anticuerpo anti-LY policlonal de conejo (1: 500; Molecular Probes) y el anticuerpo secundario anti-conejo Alexa Fluor conjugado apropiado ( 1: 500; Molecular Probes) durante el procesamiento inmunohistoquímico. Neurobiotin se visualizó por adición de colorantes estreptavidina conjugada con Alexa Fluor. (1: 500; Molecular Probes) a la mezcla de anticuerpo secundario (véase la siguiente sección)
La inmunohistoquímica
Se utilizó un anticuerpo monoclonal de rata anticuerpo contra la sustancia P a la etiqueta
Cancer borealis
péptido relacionado taquiquinina (CabTRP; química precisa y científica, Westbury, NY,#NC1 /34HL, dilución 1: 300) [30,31], un anticuerpo monoclonal de ratón contra la proteína Drosophila sinapsina de fusión con GST (SYNORF1, [32]; Estudios del desarrollo Hybridom Bank (Univ Iowa),#5F10, 1:. dilución 500), y un anticuerpo policlonal de conejo contra Lucifer Yellow (Molecular Probes, número de catálogo a-5750 , 1: 1000 dilución). La especificidad del anticuerpo para sinapsina similar y CabTRP-como immunolabeling en
C. borealis
ha demostrado anteriormente [30,31,33]. Los antisueros se diluyeron en 0,01 M PBS-T a la concentración apropiada y se aplica durante la noche a temperatura ambiente, seguido de 6x10 minutos lavados con PBS-T
Para la detección secundaria, Alexa Fluor -. Anticuerpos policlonales de cabra conjugados contra ratón o IgG de conejo (cadenas H + L, altamente absorbida transversal; Molecular Probes) se utiliza para visualizar la inmunorreactividad. Los anticuerpos se utilizaron a una concentración de 1: 500 en PBS-T durante 2-3 horas a temperatura ambiente. a continuación, las preparaciones se lavaron 4x15 minutos en PBS. DTN se montaron en portaobjetos pre-limpiado (25x75x1mm, SuperFrost, VWR) en Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA), con un diámetro de 9 mm, 0,12 mm espaciadores de silicona profundidad de sellado (Microscopía Electrónica de Ciencias, Hatfield, PA) bajo#1.5 cubreobjetos (Fisher Scientific).
Estadísticas
AGR longitudes de proceso se analizaron en Excel (Microsoft). Importancia fue probado con pruebas t de SigmaPlot. Los errores son la desviación estándar.
adquisición y procesamiento de imágenes
pilas de baldosas de imágenes confocal se recogieron con un microscopio Leica SP5 CLEM utilizando Application Suite avanzado software de fluorescencia (LAS AF). Para múltiples etiquetas, imágenes secuenciales y la configuración de emisión estrechas fueron utilizados para evitar la diafonía. Confocal imágenes fueron adquiridas como baldosas con un objetivo de 63x de glicerol (Leica HCX PL APO 63x /1.3 GLI CORR CS (21 ° C) a 2048x2048 o 1024x1024 resolución de 0,12 a 1,01 micras pasos y posteriormente alineados y se cosen con una herramienta MATLAB basado en GUI , escrita por Ted Brookings. pilas de imágenes se convirtieron a .ims archivos con Imaris 7,0-7,4 (Bitplane), se filtró y hacia abajo en la muestra a un tercio de la resolución en las dimensiones X e y. el Imaris Slice y superar los módulos se utilizaron para ajustar el contraste y el brillo y para visualizar las pilas como proyecciones de máxima intensidad o como proyecciones modo de mezcla. subconjuntos de los z-pilas fueron exhibidos en las proyecciones de modos de mezcla opacidad reducida para mejorar la visualización de los rellenos de células y distribución de las proteínas a la vez. el filamento y el volumen reconstrucciones de los rellenos de células se hicieron con el módulo Imaris Filamento en modo manual para determinar la rama longitudes y volúmenes de rama.
Separación de etiquetado Synapsin similar dentro y alrededor de los procesos llenos
etiquetado inmunorreactiva
Synapsin similar dentro de los procesos llenos fue aislado de la señal global sinapsina como mediante el uso de reconstrucciones de superficie de la célula llena como una máscara. Las reconstrucciones de superficie se realizaron con el módulo de superficie Imaris utilizando un umbral establecido manualmente para la intensidad de distinguir entre el fondo y de relleno de la célula. La superposición de la máscara de la superficie celular y la señal reconstruida inmunorreactiva sinapsina como se guarda como un nuevo canal de señal ( "sinapsina dentro"). Para capturar sinapsina como etiquetado adyacente a la celda llena, este proceso se repitió con una nueva máscara de superficie de la célula llena, esta vez generado mediante el uso de un umbral más bajo de la intensidad, la captura de la "resplandor" alrededor de la superficie celular. Esto dio lugar a una máscara que más estima el volumen de la celda y nos permitió aislar etiquetado sinapsina-como en el entorno de la celda llena restando el "sinapsina dentro" señal de este nuevo canal de señal, utilizando el "Channel Aritmética "función en Imaris.
es importante señalar que una alta velocidad de muestreo durante la adquisición de imagen, idealmente el doble de la resolución del objetivo utilizado (tasa de Nyquist), es crítica para evitar la pérdida durante la filtración posterior y para permitir reconstrucciones de superficie suficientemente precisa.
Resultados
proyectos AGR en el sináptica neurópila
usa un colorante llena de rastrear el axón AGR y sus proyecciones en el STG. La posición de la línea media AGR bipolar en el STNS se ha descrito previamente (Combes et al., 1995) (Figura 1). La posición de la soma en diferentes preparaciones es algo variable, como el soma se puede encontrar tanto como 500 micras posterior a la STG en el nervio dorsal ventricular (DVN) o se puede ver ventralmente a continuación los cuerpos celulares en la región posterior de la STG, bastante cerca de la neurópila STG.
Nos encontramos proyecciones AGR desde el axón principal en el neurópila de cada STG que examinamos (N = 29) (Figura 2). imagen confocal reveló proyecciones AGR con diversa duración y patrón de ramificación en el STG. El número de proyecciones AGR en el neuropilo STG varió de uno a tres y su morfología era extraordinariamente diversa, que van desde mínimamente a complejamente (Figura 2) ramificado. De las 29 neuronas AGR tinte lleno, 17 tenía un proceso de ramificación de la axón principal en el neuropilo STG, 10 tenían dos procesos, y en dos preparaciones, se observaron tres proyecciones en el STG. Las características comunes que se han visto a lo largo de muchos rellenos de células AGR fueron en forma de gancho ramas en la parte anterior del ganglio (Figura 2 A) (N = 13 de 23 AGR), ramas que terminaron en procesos similares a garras (Figura 2 B) (N = 8 de cada 23 AGR) e inflamación bulbosa de los procesos de AGR (Figura 2B) (N = 18 de los 23 AGR).
Las líneas de puntos describen el área neurópila del ganglio en todas las partes de la figura. A1. vista renderizada de LY tinte de llenado AGR con proyección única, ramificación su vez en cuatro sub-sucursales en el neurópila STG. El soma AGR se encuentra en el
STN
fuera de la esquina inferior izquierda de la imagen. Mezcla de proyección modo de 8 fusionó pilas de imágenes confocal, cada uno consistente en 84 rebanadas ópticos (adquiridos a la resolución de 0.067μm x x 0.067μm 0.378μm). La barra de escala es 30 micras. A2 muestra una ampliación del área de caja en A1, que muestra el extremo ensanchado de la proyección AGR dentro del STG. La barra de escala es 5μm. B1. vista renderizada de LY tinte de llenado AGR con proyección única, ramificación en dos sub-ramas cortas en el neurópila STG. El soma AGR se encuentra en el
STN
fuera de la esquina inferior izquierda de la imagen. Mezcla de proyección de modo fusionó 4 pilas de imágenes confocal, cada uno compuesto de 226 rebanadas ópticos (adquiridos a la resolución de 0.174μm x x 0.174μm 0.294μm). La barra de escala es 30 micras. B2 muestra una proyección superficial volumétrica del área de caja de B1 desde un ángulo diferente, haciendo hincapié en la gran ensanchamiento en forma de globo (no el soma) de la proyección axonal AGR. La barra de escala es 10μm. vista renderizada-Volumen de C. LY tinte de llenado AGR con proyección única, ramificación en dos sub-ramas de la neurópila STG. El soma AGR se encuentra en el
STN
fuera de la esquina inferior izquierda de la imagen. Mezcla de proyección de modo 5 fusionó pilas de imágenes confocal, cada uno compuesto de 169 rebanadas ópticos (adquiridos a la resolución de 0.068μm x x 0.068μm 0.462μm). La barra de escala es 30 micras. vista renderizada-Volumen de D. LY tinte de llenado AGR con dos proyecciones simples en el neurópila STG. El soma AGR se encuentra en el
STN
fuera de la esquina inferior izquierda de la imagen. Mezcla de proyección de modo 18 se fusionó pilas de imágenes confocal, cada uno compuesto de 115 rebanadas ópticos (adquiridos a la resolución de 0.183μm x x 0.183μm 0.504μm). La barra de escala es 30 micras. vista renderizada-Volumen de E. LY tinte de llenado AGR con dos proyecciones, cada una ramificación su vez en dos o tres sub-sucursales en el neurópila STG. El soma AGR se encuentra en el
STN
fuera de la esquina inferior izquierda de la imagen. Mezcla de proyección de modo 10 se fusionó pilas de imágenes confocal, cada uno compuesto de 264 rebanadas ópticos (adquiridos a la resolución de 0.179μm x 0.179μm x 0.38μm), vista ventral de la misma preparación que la figura 3. La barra de escala es 30 micras. vista renderizada-Volumen de F. LY tinte de llenado AGR con tres proyecciones, uno de ellos de ramificación en dos sub-ramas de la neurópila. El soma AGR se encuentra en el
STN
fuera de la esquina inferior izquierda de la imagen. Mezcla de proyección modo de 9 fusionó pilas de imágenes confocal, cada uno compuesto de 229 rebanadas ópticos (adquiridos a la resolución de 0.168μm x x 0.168μm 0.252μm). La barra de escala es 50 micras.
Hemos medido las características de ramificación en 17 AGR que fueron incluidas en la imagen en alta resolución (Tabla 1). En las preparaciones con sólo una única rama AGR del axón principal, el proceso ramificado en promedio 3 veces. Su longitud varía a través de las preparaciones y un promedio de 240 ± 136 m (desviación estándar) (Figura 2A-C). El número de segmentos terminales fue de 1,7 ± 0,8. procesos AGR con dos proyecciones en la neuropil tendían a ser más corto en promedio (176 ± 95,4 micras para la primera, p = 0,014, y 109 ± 94,41 m para la segunda rama), con ligeramente más sub-ramas individuales (2.5 ± 1.3 terminales segmentos), pero debido a la gran variación en los números de la rama, esta diferencia no fue estadísticamente significativa (p = 0,160) (Figura 2D-F). Tampoco hubo una significativa conservación de la longitud total de proyección cuando se normalizó para la longitud neurópila (longitud media neurópila = 544 ± 81,1 micras, N = 17) y se comparó la longitud de la rama resumió en preparaciones con uno o dos procesos (p = 0,69) (tabla 1). Sin embargo, en las preparaciones con dos proyecciones en el neuropilo, como se muestra en la Figura 2 D y E, la más posterior (más cerca de la AGR soma) proceso fue significativamente más corta que la proyección anterior (89 ± 73 micras frente a 168 ± 99 micras, respectivamente , p = 0,003).
Número de ramas
N
1
er longitud de la rama
1
er longitud de la rama, normalizado para el tamaño neurópila página 2
nd rama longitud página 2
nd longitud de la rama, normalizado para el tamaño neurópila página 3
er rama longitud página 3
longitud de la rama rd, normalizado para el tamaño neurópila
rama longitud total
longitud total rama, normalizado para el tamaño neurópila
18240 ± 136.2235 ± 118,3 ---- 241 ± 136.2235 ± 118.32 ± 7109 ± 94,189 73,3176 95,4168 ± ± ± 98,6--286 94.8258 85.93 ± 2.175 ± ± 219.2169 202.372 ± 31.877 ± 18.160 56.660 ± ± ± 48.6307 103306 ± 89.7Table 1. AGR características de ramificación.
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Otra característica anatómica sorprendente fue la localización de las ramas AGR con respecto a la arquitectura ganglionar. El somata STG están situados en una agrupación alrededor del neuropilo en la región posterior del ganglio. Estas neuronas envían un neuritas primaria hacia el centro del ganglio (neuropil grueso), donde se ramifica en procesos incrementalmente más pequeños y uno o más axones que dejan el ganglio a través de los nervios conectados. Los procesos más pequeñas de las neuronas STG se encuentran en el medio del centro del ganglio y los cuerpos celulares en el exterior, donde forman la multa o neuropil sináptica, una estructura en forma de concha alrededor de la neuropil grueso que es el interior del ganglio (Figura 3) [34]. La multa neurópila es el área donde las interacciones sinápticas tienen lugar [35]. Se puede marcarse con anticuerpos contra proteínas presinápticas como sinapsina (synorf) [14,32,33,36]. Se encontró que el axón AGR era a veces fuera del centro hacia la derecha o hacia la izquierda, pero siempre corrió en el lado más ventral del STG (n = 27) (Figura 3AB). Desde allí, el AGR proyecta dorsalmente a través de la neuropil gruesa en el centro de la STG y en el dorsal bien neuropil (Figura 3B).
A1. Renderizada vista dorsal de AGR lleno de tinte LY (verde), proyectadas a lo largo del eje dorso-ventral. A2. Lateral, proyección de intensidad máxima de la misma ganglio. B1. Doble etiquetado con el anticuerpo anti-sinapsina (púrpura) revela la neurópila sináptica en el STG. B2. proyección lateral del ganglio anti-sinapsina etiqueta muestra el axón AGR ventral situada y sus proyecciones dorsales en el neurópila sináptica. Modo de mezcla (A1, B1 y B2) y la intensidad máxima (A2) proyecciones de 10 fusionaron pilas de imágenes confocales, cada uno compuesto de 264 rebanadas ópticos (adquiridos a la resolución de 0.179μm x 0.179μm x 0.38μm). La barra de escala es 50 micras.
La localización de los sitios de contacto entre el candidato AGR otras células
Nos quería saber si las proyecciones AGR entraron en contacto cercano con otras neuronas STG. Para ello se realizó un doble rellenos de AGR y otras células STG, centrándose en las neuronas que forman parte de la red molino gástrico, donde la estimulación AGR tiene los efectos más fuertes en la actividad de la red
in vivo
y
in vitro
[24,25,37,38].
rellenos dobles de la neurona DG y AGR en tres preparaciones revelaron varias zonas de contacto cerca aparente en el nivel de resolución disponibles con el microscopio confocal (Figura 4A) . Se realizó la reconstrucción de la superficie de uno de estos pares de obtener una mejor visión de los sitios de contacto aparentes. Los puntos de contacto candidato más llamativo no estaba en el neurópila sináptica (bien), pero en el neurópila gruesa en el centro del ganglio, donde un proceso de gran diámetro de la DG fue visto aparentemente envuelto alrededor de una proyección AGR. Además, otro sitio de contacto del candidato AGR con un proceso DG muy fino fue visto en el neurópila sináptica (Figura 4A). Otras células que entraron en contacto cercano con AGR cada vez que se realizó un doble rellenos eran al menos uno de los cuatro neuronas gástricos molino (GM) (n = 3) y la neurona gástrica lateral única (LG) (n = 5). Una inspección más cercana de un doble relleno de la neurona GM y AGR en dos preparaciones mostró un sitio candidato único de contacto aparente entre dos procesos (Figura 4B), claramente visto en una reconstrucción de la superficie del sitio de contacto en el inserto en la figura 4B2. En la misma preparación, procesos muy finas (~ diámetro con 1 m) de la neurona GM también envuelven alrededor del axón AGR (Figura 4B3). La figura 4C muestra una doble ración de AGR y LG con los sitios de contacto candidato en los procesos más amplios de la neurópila gruesa. contacto con los sitios candidatos similares se observaron en el neurópila de cinco ganglios con LG y AGR rellenos dobles.
A1. Doble relleno de la neurona con la Dirección General de TMR (amarillo) y la neurona AGR con LY (azul) muestra los sitios de contacto candidatos en el neurópila. Lateral de proyección modo de mezcla de 18 fusionó pilas de imágenes confocal, cada uno compuesto de 133 rebanadas ópticos (adquiridos a la resolución de 0.177μm x x 0.177μm 1.007μm). La barra de escala es 40μm. A2. visualización de la superficie reconstruida del sitio de contacto candidato DG-AGR en la neurópila gruesa, reconstruido a partir de los mismos datos que figuran como A1. La barra de escala es 10μm. B1. relleno doble de una neurona GM con neurobiotin (verde) y la neurona AGR con Alexa Fluor 594-hidrazida (magenta). Mezcla de proyección de modo 18 se fusionó pilas de imágenes confocal, cada uno compuesto de 185 rebanadas ópticos (adquirida a una resolución de 0.088μm x x 0.088μm 0.504μm), tras la sustracción de fondo. La barra de escala es 50 micras. B2. Primer plano de sitio de contacto candidato en la neurópila gruesa. La barra de escala es 5μm. Una visualización superficie reconstruida del sitio de contacto (recuadro en la B2) permite una visión más clara. B3. Primer plano de sitio de contacto entre los procesos candidato neuropilo finas de GM y el axón AGR. La barra de escala es 10μm. C. Doble relleno de la neurona LG con LY (verde) y la neurona AGR con Alexa Fluor 594-hidrazida (rojo) muestra sitio de contacto aparente entre el neuritas primaria LG y un proceso de AGR. Mezcla de proyección modo de 8 fusionó pilas de imágenes confocal, cada uno compuesto de 155 rebanadas ópticos (adquirida a una resolución de 0.177μm x x 0.177μm 0.336μm), tras la sustracción de fondo. La barra de escala es 30 micras.
descendente fibras de proyección
Aproximadamente 25 pares de neuronas descendente proyecto de los dientes y de los JO a través del nervio stomatogastric
STN
a la STG [39], donde la liberación modulador de sus terminales da forma a la actividad de las neuronas pilórico gástrico y [40-43]. En cuatro preparaciones, cuando nos llena AGR con Lucifer Yellow durante un período prolongado de tiempo (2-3 horas), encontramos débil propagación de tinte de AGR a los procesos que eran similares en forma a las neuronas de proyección descritas (Figura 5A). Curiosamente, cuando se repitió el experimento con neurobiotin, una molécula que pasa a través de uniones en el sistema nervioso crustáceo, no vimos ningún acoplamiento a otras células. Queríamos saber si los procesos de colorantes acoplados en el STG eran proyecciones de la moduladora de la comisura de la neurona 1 (MCN1), un par de células moduladoras en el CdG que se activan y reguladas por la actividad AGR través de las vías de bucle largo a través de la
STN
y dientes, y provocar un molino ritmo gástrico [37,42-44]. MCN1 contiene tres péptidos moduladores en sus proyecciones en el STG; uno de ellos es un péptido taquiquinina como, CabTRP1a. Como MCN1 es la única fuente de péptido taquiquinina como en el STG, los dos MCN1 proyecciones en el STG pueden marcarse específicamente con un anticuerpo anti-P sustancia, que reconoce los péptidos de taquiquinina-como a través de muchas especies diferentes [30,31]. Se realizó inmunomarcación de CabTRP para visualizar terminales MCN1 en tres ganglios con colorante se extendió desde AGR a
procesos STN
. En una de estas preparaciones, un
proceso de STN
colorante acoplado marcado positivo para CabTRP y por lo tanto era probable MCN1. En las otras dos preparaciones, las dos proyecciones MCN1 no coincidían con el proceso de colorante acoplado en el STN (Figura 5B). Sin embargo, cuando se realizó un doble etiquetado de AGR y CabTRP en los ganglios sin teñir-difusión, hemos encontrado consistentemente al menos una de las ramas de AGR en estrecha proximidad o envuelto alrededor de un axón MCN1 antes de que arborized en el neurópila (Figura 5C-D) ( N = 7 de 7).
A. A largo plazo (2 horas) LY tinte de llenado de la neurona AGR (magenta) reveló fibras descendente STN colorantes acoplados. B. Doble etiquetado para CabTRP en el mismo preparado muestra que las fibras STN colorantes acoplados no eran MCN1 proyecciones. A y B son mezclas de proyecciones modo de 12 fusionaron pilas de imágenes confocales, cada uno compuesto de 200 rebanadas ópticos (adquiridos a la resolución de 0.187μm x 0.187μm x 0.504μm). La barra de escala es 50 micras. C. procesos AGR (lleno-LY tinte, magenta) están en estrecha aposición con las proyecciones de las neuronas MCN1 que fueron etiquetados con un anticuerpo anti-P sustancia (verde). Mezcla de proyección de modo 12 se fusionó pilas de imágenes confocal, que muestra una sección media de espesor 47μm del ganglio (127 de 210 rebanadas ópticos, adquiridos en la resolución de 0.187μm x x 0.187μm 0.713μm). La barra de escala es 50 micras. D. Un primer plano de la neurópila muestra un final en forma de garra de la proyección LY tinte lleno de AGR (magenta) en estrecho contacto con los procesos MCN1 (en color verde), y dos terminales AGR distintas en contacto aparente con mayor diámetro MCN1 procesos (flechas). proyección modo de mezcla de la mitad de la sección de espesor 24μm en la misma preparación que 4B, gira 180 ° alrededor del eje dorso-ventral (66 de 210 rebanadas ópticos, adquiridos en la resolución de 0.187μm x x 0.187μm 0.713μm). La barra de escala es 15μm.
Por último, se realizó dobles grabaciones de AGR y los procesos identificados en el nervio stomatogastric (STN) (Figura 6). Registramos de 1-5
STN
axones por ganglio. En la mayoría de los ganglios cuando se controlaron de forma intracelular tanto de las células, no se encontraron
procesos STN
que fueron acopladas eléctricamente a AGR (N = 7). Sin embargo, en una ocasión acoplamiento eléctrico tras la inyección de corriente en cualquiera de AGR o el proceso STN no identificado fue visto y el
STN proceso
estaba lleno de tinte. El inserto en la Figura 6A muestra una reconstrucción de la superficie de un área de contacto estrecho entre AGR y esto no identificada descendente
proceso de STN
de la multa neurópila. Por desgracia, no hemos podido encontrar posteriormente, ficha de, o llenar el mismo
STN
proyección en otros ganglios.
relleno doble de un proceso de STN no identificado con LY (verde) y la neurona AGR con Alexa Fluor 594-hidrazida (magenta) muestra estrecha aposición de los procesos sobre un área grande en el neuropilo STG. la visualización de la superficie reconstruida 9 fusionó pilas de imágenes confocal, cada uno compuesto de 229 rebanadas ópticos (adquiridos a la resolución de 0.168μm x x 0.168μm 0.252μm). La barra de escala es 50 micras. Insertar muestra primer plano de área de caja, dejando al descubierto los sitios de contacto aparente entre los terminales de proyección AGR y procesos finos de la neurona de proyección no identificado.
putativos sinapsis químicas de AGR en el STG
A continuación examinó cuidadosamente la distribución de las sinapsis potenciales en AGR celda llena. Se utilizó reconstrucciones de superficie para separar la inmunorreactividad sinapsina como en el AGR de la señal en el resto de la neuropil sináptica (véase la sección Métodos). La Figura 7A muestra la señal sinapsina aislado sobrepuesto con el relleno celular AGR.