Extracto
Objetivos
El papel de sonic hedgehog (SHH) en la transición epitelio mesenquimal (EMT) de cáncer de páncreas (PC) se sabe, sin embargo, su mecanismo no está claro. Debido a SHH promueve el desarrollo de tumores predominantemente a través de Gli1, hemos tratado de comprender su mecanismo mediante la identificación de objetivos Gli1 en las células de cáncer de páncreas.
Métodos
En primer lugar, se investigó la invasión, la migración y la EMT en las células PC transfectadas con vectores de lentivirus de interferencia Gli1 o SHH sobreexpresión vectores
in vitro
y
in vivo
. A continuación, se determinaron los perfiles de genes diana de Gli1 en células PC utilizando ensayos de microarrays de ADNc. Por último, las redes de regulación primaria aguas abajo de SHH Gli1 señalización en las células PC se estudiaron mediante análisis funcionales de estos objetivos.
Resultados
Nuestros resultados indican que hay una disminución de la expresión de E-cadherina en el aumento de expresión de SHH /Gli1. La migración de las células PC se incrementó significativamente de una manera dependiente de la dosis dentro de las 24 horas de expresión Gli1 (
P
& lt; 0,05). La relación de la metástasis de hígado y metástasis en miniatura el interior del bazo aumentó notablemente tras la activación de las señales de SHH-Gli1 en ratones desnudos. El uso de microarrays de ADNc, se identificaron 278 upregulated y 59 genes regulados negativamente partir de su expresión en las células Gli1 AsPC-1. Los datos indican que las señales de SHH-Gli1 promueven EMT por mediación de una red de señalización complejo incluyendo TGF, Ras, Wnt, factores de crecimiento, PI3K /AKT, integrinas, transmembrana 4 superfamilia (TM4SF), y S100A4.
Conclusión
Nuestros resultados sugieren que la orientación de las conexiones que se establecen entre moleculares SHH Gli1 de señalización y EMT podría proporcionar terapias eficaces para PC
Visto:. Xu X, y Zhou, Xie C, Wei Sm, Gan H , He S, et al. (2012) Genome-Wide Screening revela una red molecular EMT mediada por Sonic Hedgehog-Gli1 señalización en las células del cáncer pancreático. PLoS ONE 7 (8): e43119. doi: 10.1371 /journal.pone.0043119
Editor: H. Fazlul Sarkar, Wayne Facultad de Medicina de la Universidad del Estado, Estados Unidos de América
Recibido: 6 Junio, 2012; Aceptado: 17 Julio 2012; Publicado: 10 Agosto 2012
Copyright: © Xu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue financiado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81072005 y 81172312) y el Comité de Ciencia y Tecnología de Shanghai (10ZR1423300). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
sonic hedgehog (Shh) está implicado en la organogénesis embrionaria como un morfógeno. La activación inapropiada de las señales de SHH durante el páncreas resultados de formación en agenesia y varias enfermedades pancreáticas [1]. SHH se excluye del páncreas en desarrollo, así como el órgano maduro, pero está regulada positivamente en la pancreatitis crónica, neoplasia intraepitelial primeros pancreáticas lesiones (PanIN), y cáncer de páncreas invasiva (PC) [2]. la regulación positiva de SHH aberrante se informó en células PC subtotal humanos y podría ser un mediador crítico principal del desarrollo de PC [3].
El erizo (HH) vía de señalización está estrechamente relacionado con la metástasis tumoral y el pronóstico en estudios clínicos y es requerido para la metástasis del tumor PC en modelos de ratón ortotópico [3], [4]. Recientemente, se pensaba que esta vía para orquestar la reprogramación de las células cancerosas a través de transición epitelio mesénquima (EMT). Curiosamente, la evidencia reciente encontró que SHH se upregulated significativamente en células PC gemcitabina resistentes que expresan simultáneamente cáncer de células madre (CSC) marcadores [5]. Debido a que los productos de los genes diana SHH inducida podrían contribuir a la auto-renovación, la supervivencia y la migración de las células progenitoras cáncer y Gli1 pueden desempeñar un papel crucial en el comportamiento maligno de las células PC [6], [7], la identificación de objetivos Gli1 es un paso lógico para comprender su mecanismo en las células PC.
El objetivo de este estudio era proporcionar un marco para las redes de regulación primaria aguas abajo de SHH Gli1 señalización en las células PC. También hemos tratado de determinar si Gli1 genes diana específica conectan SHH Gli1 señalización y EMT, proporcionando así una estrategia terapéutica para PC.
Materiales y métodos
Cultivo de células
La líneas celulares PC (BxPC3, AsPC-1 y Panc-1 fueron salvados por la Academia china de Ciencias.) se cultivaron en medio RPMI-1640 suplementado con suero bovino fetal al 10% (FCS). Todas las células se incubaron a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2 en el aire.
La construcción del vector y la infección de células
vectores de transferencia lentiviral para Gli1 shRNA cDNA humano o SHH fueron construidos por Genechem Co., Ltd, Shanghai, china. Este sistema incluye la pLVTHM vector lentiviral, el plásmido de la cubierta pMD2G, y los plásmidos de embalaje PRSV-REV y pMDLg-pRRE. El lentivirus-SHH (L-SHH) contiene un 3,3-kb SHH secuencia de codificación y de la lentivirus-Gli1i (L-Gli1i) contiene horquilla pequeña Gli1 RNA a la secuencia de dirección de la shRNA, como se describe anteriormente (5'-3-CTCCACAGGCATACAGGAT ') [8]. El control de lentivirus (L-C) no incluía secuencias de interferencia Gli1 o secuencias de ADNc de SHH y sirvió como control. construcciones lentivirales se verificaron por secuenciación de ADN. lentivirus recombinante se produce mediante transfección transitoria de células 293T siguiendo un protocolo estándar. Cuando BxPC3, AsPC-1, y las células Panc-1 fueron aproximadamente 50% de confluencia (en medio RPMI-1640 que contiene 2% de FCS), que estaban infectadas con las construcciones lentivirales en MOI de 5. Las células se recogieron después de 72 horas para experimentos adicionales. Para identificar funcional L-SHH y L-Gli1i construye, se analizaron de forma rutinaria SHH y Gli1 expresión de QRT-PCR
A:. La expresión de SHH, Gli1, Patched1, y el ARNm de E-cadherina en presencia de L -Gli1i y SHH transducción. B:. Western blot que muestra la expresión de la proteína de Gli1, E-cadherina, y GAPDH en líneas celulares de cáncer de páncreas
extracción de RNA y en tiempo real RT-PCR ensayos
El ARN total se extrajo con el reactivo Trizol (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ARN total (100 ng) fue transcrito inverso en el se usó un volumen de 20 l y 2 l de ADNc para PCR, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. (Takara Biotecnología, Dalian, China). Las secuencias de los cebadores se muestran en la Tabla 1. Los valores de Ct (ciclo umbral) fueron normalizados a valores CT de GAPDH
A1-9:. Cristal violeta tinción de las células PC a través de los poros de la membrana de policarbonato (× 200 aumentos). B: Los recuentos de células de la migración de las células PC como analizados por transwell ensayo. C1-3: La proliferación celular como se determina por MTT (C1: células BxPC-3; C2: células AsPC-1; C3: células Panc-1). *
P Hotel & lt; 0,05, **
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. & Lt; 0,01
La extracción de proteínas y ensayos de Western Blot
se extrajo la proteína total con tampón RIPA acuerdo con los métodos y las muestras estándar se normalizaron para el contenido de proteína usando un kit comercialmente disponible (Bio-Rad Laboratories Inc Philadelphia, PA EE.UU.). Las muestras de proteína se separaron por 6% de SDS-PAGE (para la proteína Gli1) y 12% de SDS-PAGE (para SHH, E-cadherina, y GAPDH). Las proteínas se transfirieron a membranas de PVDF y membranas se incubaron durante 2 h en tampón TBST, seguido de incubación durante la noche a 4 ° C con los anticuerpos primarios [1:1000 (v /v) para SHH, E-cadherina, o GAPDH y 1: 500 (v /v) para Gli1] en solución de bloqueo y visualización utilizando el sistema de detección ECL (GE Healthcare Biosciences, Piscataway, NJ, EE.UU.)
a:. metástasis de tumores de hígado y bazo en un espécimen macroscópicas del grupo L-SHH. B: Los tumores del bazo y metástasis hepáticas en un espécimen macroscópicas del grupo L-C. C, D, y E: Imágenes de microscopía de fluorescencia. F, G y H: imágenes Lightmicroscopy. (C, F: tumores de bazo de el grupo L-Gli1i; D, G: metástasis en miniatura intraesplénica del grupo L-C; E, H: metástasis hepáticas de el grupo L-SHH). *
P Hotel & lt; 0,05, ** P
. & Lt; 0,01
Transwell ensayos
ensayos de invasión celular (24 kits de muestra -bien; Chemicon, Bedford, MA, EE.UU.) se utilizaron para estudiar células PC invasión de la línea y la migración. Brevemente, las células PC (1 × 10
5) se sembraron separadamente en un medio libre de suero en Matrigel cámaras de pre-recubierto transwell (cámara superior), que contenían membranas de policarbonato con poros de 8 micras. Los medios que contienen 2% de FCS se añadió en la cámara inferior. Las cámaras transwell se colocaron a continuación en las placas de 24 pocillos. Después de la incubación durante 24 h, la migración de las células PC se determinó fotografiando la membrana a través del microscopio. Los recuentos se registraron a partir de las 5 áreas con las más altas concentraciones de células en magnificación de alta energía (x200). El valor medio de los campos fue considerado como el recuento de la migración de las células PC
A:. Clúster de datos de microarrays de ADNc comparando las células L-Gli1i L-C y. B: Clasificación funcional de los genes expresados diferencialmente. Ver también la Tabla 2.
ensayos de crecimiento celular
El crecimiento celular se determinó utilizando MTT [3- (4, 5 dimetil-2-tiazolilo) -2.5 bromuro] ensayos -diphenyl- tetrazolio 2H-. Brevemente, las líneas celulares PC se sembraron en placas de 96 pocillos. MTT ensayos se realizaron después de 12, 24, 48, y se determinaron las 72 horas y las densidades ópticas a una longitud de onda de 490 nm.
metástasis de hígado de inducción mediante inyección esplénica
Tres grupos de AsPC-1 se utilizaron células (lentivirus-Gli1i, de control de lentivirus, y lentivirus-SHH) para detectar metástasis después de la inoculación el interior del bazo en ratones desnudos tal como se describe anteriormente [9]. Brevemente, los ratones fueron anestesiados con metoxiflurano, se hizo una incisión abdominal menor flanco izquierdo, y el bazo fue expuesto. Se inyectaron células AsPC-1 en el bazo con una aguja de calibre 30. El bazo se devolvió al abdomen, y la herida se cerró en una capa con grapas para heridas. Después de 8 semanas, cosechamos el hígado y el bazo y producido continuos cortes congelados. Estamos manchados las secciones con hematoxilina y eosina y tumores de bazo contados, las metástasis en miniatura intraesplénicos, y metástasis hepáticas en un microscopio de fluorescencia y microscopio óptico. Todos los protocolos de experimentación animal utilizados en este estudio fueron aprobados por el Comité de Investigación Animal de la Universidad de Tongji
R: Los genes diana y de señalización implicadas en la EMT regulada por Gli1 en células PC;. B:. El modelo de diafonía putativo dentro de la red molecular EMT mediada por la señalización de SHH Gli1
análisis de microarrays de ADNc
células AsPC-1 transducidas con L-Gli1i y LC fueron utilizados en los ensayos de microarrays de ADNc con el GeneChip Affymetrix Genoma humano U133 Plus2.0. Se realizaron tres experimentos en una sola preparación de ARN total a partir de las células. Los valores de señal se presentan como el valor medio de 3 experimentos replicados. Se llevaron a cabo ensayos de cDNA microarray y análisis estadísticos de los resultados de la expresión génica como se describe anteriormente [10].
Análisis estadísticos
Para todos los análisis estadísticos, se empleó el software SPSS17.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, EE.UU.). Las variables continuas se expresan como la media ± SE. pruebas t no pareado de Student se utilizaron para la evaluación estadística.
P
. & Lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Resultados
Lentiviral-Gli1i y -SHH eficacia de transducción celular y PC EMT está regulada por la señalización de SHH Gli1
Estamos transfectadas tres líneas celulares PC con el vector lentiviral Gli1 interferencia (L-Gli1i), SHH sobre-expresión del vector (L-SHH), y el vector de control (LC). Verificamos las alteraciones en la activación de la señalización de SHH Gli1 mediante la evaluación de la expresión de SHH, Gli1, y Patched1 utilizando en tiempo real de RT-PCR. La información en tiempo real RT-PCR reveló que los genes Gli1 y Patched1 fueron regulados a la baja de manera significativa por la L-Gli1i transducción, mientras que Gli1 y Patched1 se upregulated por transducción L-SHH en comparación con LC (
P Hotel & lt; 0,01; Figura 1A). Gli1 y Patched1 eran genes diana en la mayoría de tipos de células con la señalización de SHH activado, por lo tanto, los resultados sugieren que los vectores lentivirales cambiaron de manera eficiente la activación de las señales de SHH-Gli1. Los niveles de mRNA de la E-cadherina se redujeron drásticamente por el aumento de SHH /Gli1-expresión en células PC. Una tendencia similar se observó con la proteína E-cadherina.
PC invasión y migración celular está regulada por la señalización de SHH Gli1
Los datos de los ensayos transwell mostraron que un mayor número de células de la líneas celulares PC invadieron de una manera dependiente de la dosis Gli1 a través del filtro revestido con Matrigel dentro de las 24 horas (
P
& lt; 0,05; Figura 2A1-A9, B).
el SHH-Gli1 vía de señalización regula la proliferación celular PC
Nuestros datos MTT demostraron que la L-Gli1i /SHH transducción no influyó significativamente en la proliferación de células dentro de las 24 horas. Sin embargo, después de 48 horas, la proliferación de células PC aumentó con la transducción viral (Figura 2C1-C3).
Las metástasis hepáticas después de la inyección de las células ASPC-1 en ratones desnudos está regulada por la señalización de SHH Gli1
Nuestros datos del modelo de ratones desnudos mostraron que 8 semanas después de la inyección el interior del bazo de células ASPC-1, no hubo el bazo tumores en 8 de 10 ratones en el grupo L-Gli1i, 8 de 9 ratones en el grupo LC, y 9 de 9 animales en el grupo de L-SHH. El número promedio de tumores en miniatura del bazo fueron de 2,6, 4,9, y 8,9, respectivamente. La incidencia de metástasis en el hígado era 3 de 8 ratones en el grupo L-Gli1i, 5 de 8 ratones en el grupo L-C y 8 de 9 animales en el grupo L-SHH. El número medio de metástasis hepáticas fueron 2.7, 4.2 y 6.7, respectivamente (Figura 3, Tabla 2).
análisis de microarrays de ADNc de Gli1 genes diana en las células ASPC-1