Extracto
La resistencia al fármaco presenta un desafío en la quimioterapia y tiene interés en la investigación en todo el mundo y atraído una atención especial se le ha dado a los compuestos naturales para superar esta dificultad. Pulchrin A, un nuevo compuesto aislado a partir de productos naturales ha demostrado novela potencial para el desarrollo como fármaco. La identificación de pulchrin A se llevó a cabo utilizando varias técnicas espectroscópicas tales como resonancia magnética nuclear, espectrometría de masas de cromatografía líquida, espectrometría de infrarrojos y ultravioleta. Los efectos de citotoxicidad en Caov-3 células indica que pulchrin A es más activo que el cisplatino, que tiene una IC
50 de 22,3 mM. Cambios significativos en la morfología celular estaban presentes, tales como formación de ampollas en la membrana celular y la formación de cuerpos apoptóticos. La participación de la fosfatidilserina (PS) en la apoptosis se confirmó por Anexina V-FITC después de un tratamiento de 24 h. La apoptosis se activa a través de la vía intrínseca por la activación de procaspases 3 y 9, así como las caspasas 3 y 9 escindidos y terminó en la vía de ejecutor, con la aparición de laddering de ADN. La apoptosis se confirmó a través de genes y expresión de proteínas niveles, en los cuales se había reducido regulado proteína Bcl-2 y la proteína Bax fue regulada de manera ascendente. Además, el ciclo celular Caov-3 fue interrumpido en la fase G0 /G1, lo que lleva a la apoptosis. El modelado molecular de proteínas Bcl-2 demostró una afinidad de unión alta, que inhibe la función de proteínas Bcl-2 y dio lugar a la muerte celular. Los resultados de este estudio pueden arrojar luz sobre el desarrollo de nuevos agentes terapéuticos, en particular, humanos tratamientos para el cáncer de ovario
Visto:. Nordin N, Fadaeinasab M, S Mohan, Mohd Hashim N, R Othman, Karimian H, et al. (2016) Pulchrin A, un derivado de cumarina New Natural de
Enicosanthellum Pulchrum
, induce la apoptosis en células de cáncer de ovario vía intrínseca Camino. PLoS ONE 11 (5): e0154023. doi: 10.1371 /journal.pone.0154023
Editor: Yi-Hsien Hsieh, Instituto de Bioquímica y Biotecnología, TAIWAN
Recibido: 26 Diciembre, 2015; Aceptado: 7 Abril de 2016; Publicado: May 2, 2016
Derechos de Autor © 2016 Nordin et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este estudio fue financiado por la Universidad de Malasia en virtud de concesión PPP (PG151-2012B) y el Ministerio de Educación Superior Malasia bajo altas subvenciones para la investigación de impacto (UM -MOHE UM.C /625/1 /HIR /MoHE /SC /09)
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer es una enfermedad importante que afecta a la población humana en todo el mundo [1]. Aproximadamente, la mitad de todos los hombres y más de un tercio de todas las mujeres son diagnosticadas con cáncer en el transcurso de su vida. Mientras tanto, una cuarta parte de los adultos mueren a causa de cáncer [2]. Los datos recopilados por la Agencia Internacional para la Investigación en Cáncer (IARC) en el registro del cáncer y la mortalidad muestran que se registraron casi 12,6 millones de nuevos casos de cáncer en todo el mundo sólo en 2008 [2]. De acuerdo con el Registro Nacional de Cáncer de Malasia [3], un total de 8.123 (44,6%) hombres y 10.096 (55,4%) residentes hembras fueron diagnosticados con cáncer en la península de Malasia en 2007.
Mientras tanto, un total de 239.000 nuevos casos en todo el mundo se registraron para el cáncer de ovario [4]. El cáncer de ovario es el cáncer ginecológico más fatal debido principalmente a la falta de especificidad y síntomas biomarcadores disponibles para la detección durante las primeras etapas de la enfermedad. En la mayoría de los casos de cáncer de ovario, el diagnóstico de la última etapa se detectó frecuencia entre los pacientes que no pudieron responder con eficacia al tratamiento. En general, estos pacientes tienen una tasa de supervivencia a 5 años, pero esta tasa se ha reducido a un 20-30% [5-7]. El tratamiento de pacientes con cáncer de ovario se basa en el protocolo estándar por lo que la cirugía es el tratamiento inicial seguida de quimioterapia. Tres fármacos diferentes comúnmente utilizados para tratar el cáncer de ovario son doxorrubicina, carboplatino y taxanos. Sin embargo, estos fármacos a menudo son menos eficaces que los pacientes pueden exhibir resistencia al fármaco administrado [8]. Estos inconvenientes han llevado a los investigadores a explorar alternativas de compuestos potencialmente eficaces como tratamiento para el cáncer de ovario.
La cumarina y sus derivados pertenecen a la familia de lactona que comprende la estructura esquelética benzopirona, que se encuentra ampliamente en la naturaleza [9]. derivados de la cumarina se han encontrado que exhiben considerables actividades biológicas terapéuticas y diversos [10, 11] que son útiles en la fotoquimioterapia, y la terapia antitumoral terapia anti-VIH [12, 13]. Pueden ser utilizados como sistema nervioso central (SNC) [14], antibacterianos [15, 16], antifúngicos [17, 18], antiinflamatorios [19], anti-coagulantes [20] o tuberculostáticos [21] y colorantes [22]. Algunos de los derivados cumarínicos también se han reportado como fijadores y agentes aromatizantes. Sin embargo, la Food and Drug Administration de Estados Unidos (FDA) ha regulado el uso de la cumarina como aditivos alimentarios [23-25]. antibióticos potentes derivados de la cumarina, tales como novobiocina, coumaromycin y chartesium están disponibles comercialmente [26]. En el presente estudio, un nuevo derivado de la cumarina se aisló por primera vez a partir de productos naturales,
Enicosanthellum Pulchrum
. Un grupo alquilo larga se conecta a anillo heterocíclico cumarina para investigar su potencial como agente anticanceroso prometedor contra la línea celular de cáncer de ovario humano Caov-3 a bajas concentraciones a las 24 h.
Materiales y Métodos
experimental
El gel de sílice H se adquirió de Sigma-Aldrich, mientras gel de sílice 60 (malla 230˗400), dimetilsulfóxido (DMSO), metanol (MeOH), etanol (EtOH),
n
hexano y acetato de etilo (EtOAc) se adquirieron de Merck Co. (Alemania). 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2, 5-difenil bromuro de tetrazolio (reactivo MTT) fue proporcionado por Invitrogen (Carlsbad, EE.UU.). RPMI-1640 (pH 7,4), penicilina /estreptomicina y suero fetal bovino (FBS) fueron adquiridos de Nacalai Tesque (Japón) y tripsina-EDTA 10X fue suministrado por BioWest (EE.UU.). La radiación ultravioleta (UV) y los espectros de los espectros de infrarrojos (IR) se registraron en un espectrofotómetro UV (UV-1601 Shimadzu, Japón) y el espectrómetro de FT-IR Spectrum RXI (Perkin Elmer, EE.UU.), respectivamente. La resonancia magnética nuclear (RMN) se registraron en un Bruker espectrómetro (Suiza) 600 MHz. La rotación óptica se llevó a cabo en Jusco (Tokio, Japón). Los espectros de masas se registraron para ionización por electrones (ESI) espectrometría de masas en IT-TOF de Shimadzu, Japón. También se llevó a cabo la cromatografía líquida (HPLC) de alto rendimiento.
Preparación de la planta de extracción
Las raíces de
E
.
Pulchrum
se recogieron en septiembre de 2011 en el bosque de la montaña de Cameron Highlands (Pahang, Malasia). El Director del Departamento de Silvicultura Pahang, Malasia se le dio el permiso para entrar y recoger las muestras [27]. La planta fue identificada por el difunto Prof. Dr. Kamarudin Mat Salleh de la Universidad Kebangsaan Malaysia (UKM). El ejemplar (SM769) se colocó en el Departamento de Botánica Herbario de la Facultad de Ciencia y Tecnología, UKM (Bangi, Malasia). Las raíces se secaron al aire y tierra a 40-60 tamaño de partícula de malla. Los extractos fueron obtenidos por maceración en
n-hexano
disolvente. Un evaporador rotatorio (Büchi, Suiza) se utiliza para eliminar los disolventes de las muestras.
Extracción y aislamiento de pulchrin A
Para la purificación de pulchrin A, el extracto de hexano se separó por cromatografía en columna (CC) usando gel de sílice de tipo 60 (malla 230-400). El sistema disolvente se utiliza para separar los compuestos en la columna de gradiente de menos polar a más polar (hexano-EtOAc-MeOH). Un total de 157 fracciones se recogieron usando un vial de 20 ml. Se obtuvo un total de 12 fracciones en base al factor de retención de cada compuesto por análisis de cromatografía en capa fina (TLC). La fracción 3 (A9-A12) se purificó adicionalmente mediante TLC preparatoria. Un nuevo compuesto se separó con éxito utilizando el
n-hexano-EtOAc
(8: 2) sistema de disolventes. El compuesto se denomina pulchrin A fue aclarada por RMN, mientras que la pureza de pulchrin A se determinó por HPLC utilizando 10% a 100% de acetonitrilo (v /v) gradiente de elución durante 15 min a un caudal de 0,5 ml /min.
Análisis elucidación estructural
Espectroscopía de Resonancia magnética Nuclear (RMN).
En breve, pulchrin a se analizó mediante RMN para examinar la presencia de protones y átomos de carbono a 1D (
1H y
13C) y 2D (COSY-45, HSQC y HMBC) experimentos. El compuesto se preparó mediante la disolución con cloroformo deuterado (CDCl $
3) en el tubo de RMN. Antes del análisis, el tubo de RMN se colocó en el espectrómetro de RMN para su posterior procesamiento.
espectroscopía de masas (MS).
La espectroscopía de masas es principalmente para determinar el peso molecular de pulchrin A. El análisis se llevó a cabo utilizando el instrumento LCMS-IT-TOF. Pulchrin A se disolvió en MeOH antes de la inyección en el instrumento. El espectro de masas se ha grabado en el modo positivo y negativo.
Transformada de Fourier espectroscopia de infrarrojo (FT-IR).
Se llevó a cabo la espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier-(FT-IR) para detectar la presencia del grupo funcional en pulchrin A. el compuesto se disolvió en CHCl
3 y se dejó caer en el cloruro de sodio (NaCl) de pellets. Antes del análisis, el sedimento se coloca en el instrumento FT-IR. El resultado fue grabado en la absorción de 500-4000 cm
-1.
Ultraviolet Espectroscopía (UV) y la rotación óptica.
Pulchrin A se disolvió en MeOH antes de ser transferido a una cubeta. Las longitudes de onda utilizadas para detectar la presencia de átomos, variaron de 190 nm a 800 nm. A continuación, la absorción fue grabado usando un espectrofotómetro UV. Los resultados se expresaron en forma de un espectro de absorción. Mientras tanto, un total de 0,05 M de pulchrin A se disolvió en CHCl
3 y se transfiere a un polarímetro Jasco P-1020. La temperatura de la medición de la rotación óptica era 24 ° C.
Ensayo de citotoxicidad
dos células de cáncer de ovario humano (Caov-3 y SKOV-3) se compró a la American Type Culture Collection (ATCC , Manassas, EE.UU.). Inmortalizado células epiteliales de ovario humano (T1074) se obtuvieron de Applied Materiales Biológicos (ABM
® Crestwood Place Richmond, Canadá). Estas líneas celulares se cultivaron en nuestro laboratorio institución. Todas las células se subcultivaron y se hicieron crecer en 25 ml matraz que contenía medio RPMI-1640 (Caov-3 y SKOV-3) y Prigrow 1 medio (T1074) [28], complementado con 10% de FBS y 1% de penicilina /estreptomicina. a continuación, las células confluentes se lavaron con PBS antes de ser cosechadas con solución de tripsina-EDTA 10X. Las células recogidas se centrifugaron a 1800 rpm durante 5 min y se diluyeron a 1 x 10
6 células /ml de células. El ensayo se realizó en una placa de 96 pocillos que contenía 1 × 10
4 células /pocillo. Antes del tratamiento, un total de 1 × 10
4 mg /ml de pulchrin A se preparó mediante la adición de 1,0 mg de compuesto en 100 l de DMSO. Las células Caov-3 fueron tratados con pulchrin A en la concentración de 50 mg /ml hasta 0,78 mg /ml por 2 veces la dilución en serie. a continuación, las células se incubaron a 24, 48 y 72 h. Antes de la medición, la solución de MTT (20
μ
L) se añadió en cada pocillo y se incubaron durante 3 h. La placa se registró a una absorbancia de 570 nm utilizando un lector de microplacas. El resultado se establece como el IC
50 valor, con lo que el cisplatino (IC
50: 30,6 mM). Se utilizó como control positivo en el estudio
naranja de acridina /yoduro de propidio (AO /PI) doble tinción ensayo
ensayo de doble tinción AO /PI se llevó a cabo de acuerdo con el procedimiento estándar usado para la microscopía de fluorescencia (Lieca con el software Q-Floro). El ensayo se realizó en un matraz de 25 de cultivo (Nunc), con lo que las células Caov-3 y T1074 fueron expuestos con pulchrin A (22 mM) a las 24, 48 y 72 h. Antes de la tinción, las células recogidas se lavaron con PBS. Un total de 10
μ l de
AO y PI (10
μ
g /ml) se añadieron al sedimento celular. Las células se observaron a los 30 minutos con un microscopio fluorescente ultravioleta (Olympus BX51) para evaluar los cambios morfológicos de fluorescencia antes de la decoloración.
Anexina-V-FITC ensayo
El efecto de pulchrin A durante la etapa inicial de la apoptosis fue ensayada mediante el isotiocianato de fluoresceína Kit (FITC) Anexina V Detección de apoptosis I (BD Pharmingen
™). Las células Caov-3 se cultivaron en una placa de 6 pocillos y se trataron con pulchrin A (22 mM) para 24, 48 y 72 h. Las células (5 × 10
4 células /ml) se recogieron por centrifugación a 1600 rpm durante 5 min. Un total de 100 l de cada muestra se transfirió a un tubo que contiene 5 l de FITC Anexina V y 10 l de PI. La suspensión se mezcló suavemente y se añade con 100 l de tampón de ensayo 1 ×. La detección se realizó utilizando un citómetro de flujo (BD FACSCanto
™ II, San José, CA, EE.UU.)
caspasas colorimétricos análisis
cisteinil ácido aspártico-proteasa (caspasas) -3,. - 8 y -9 ensayos se llevaron a cabo utilizando un kit comercial (caspasas 3, 8 y 9 ensayo colorimétrico: R & amp; D Systems, Inc. EE.UU.). Las células se sembraron en un matraz de 75 y se trataron con el IC
50 concentración de pulchrin A para 24, 48 y 72 h. Las células tratadas se recogieron por centrifugación a 1800 rpm durante 5 min. A continuación se añadió el tampón de lisis al sedimento celular y se incubó en hielo durante 10 min. El lisado se centrifuga a 9450 rpm durante 1 min para recoger el sobrenadante. El ensayo se llevó a cabo en una parte inferior de microplacas de 96 pocillos plana. Aproximadamente 5 l de la caspasa 3, 8 o 9 sustrato colorimétrico (LEHD-pNA) se añadió a cada reacción que contiene un lisado de células y un tampón de reacción 2 X de la caspasa 3, 8 o 9. La reacción se incubó durante 1 h a 37 ° C y luego se leyó en un lector de microplacas (Infinito M200PRO, Tecan, Männedorf, Suiza) a longitud de onda de 405 nm.
múltiples ensayos de citotoxicidad
múltiples ensayos de citotoxicidad se realizaron utilizando el Celómica
® multiparámetro citotoxicidad 3 Kit (Thermo Scientific, PA, EE.UU.). Un total de 5 × 10
3 Las células se sembraron en cada pocillo de 96 pocillos de microplacas. Las células se trataron luego con pulchrin A en tres concentraciones (11, 22 y 33 mM) durante 24 h y después se incubaron durante la noche a 37 ° C. Después de la incubación, varias soluciones se añadieron continuamente en cada pocillo que contiene 50 l de solución de tinción de células vivas, 100 l de tampón de fijación, 100 l de tampón de permeabilización 1 X y 100 l de 1 X tampón de bloqueo, que se incubaron durante 20 min, 10 min, 30 min y 15 min, respectivamente. Dos soluciones de anticuerpos (citocromo
c
anticuerpo primario y DyLight
™ 649 conjugado de cabra anti-ratón IgG anticuerpos secundarios) se añadieron en la etapa final de la preparación de ensayo. La placa fue entonces leído y evaluado en el ArrayScan, de alto contenido de cribado (HCS) Lector de Thermo Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, EE.UU.).
ensayo de fragmentación del ADN
Este experimento se llevó a cabo utilizando un suicidio-Track
™ Kit de aislamiento de ADN de escalera (Calbiochem, KGaA, Darmstadt, Alemania). Las células COAV-3 fueron sembradas en frascos de cultivo de 75 ml y después se trataron con pulchrin A (22 mM) para 24, 48 y 72 h. Los sedimentos celulares se obtuvieron por centrifugación a 1800 rpm durante 5 min. Los sedimentos de células se resuspendieron suavemente en tres soluciones sucesivamente: 55 l de la solución#1, 20 l de la solución#2 y 25 l de la solución#3 (componentes del kit). Antes de la incubación a 50 ° C, se añadieron 500 l de tampón de resuspensión del en la mezcla. La electroforesis se realizó mediante la preparación del gel de agarosa (1,5%) en 1 X TAE tampón con un reactivo de tinción suministrado en el kit. El gel se hizo funcionar a 50 voltios hasta que el colorante alcanzó 1-2 cm del extremo del gel. El gel se visualizó bajo un transiluminador de luz UV y luego se fotografió.
-PCR en tiempo real
ARN total fue extraído de Caov-3 células utilizando RNeasy Mini Kit (Qiagen, Alemania). La concentración final de ARN total y su pureza se midió utilizando un espectrofotómetro Nanodrop 2000 (Thermo Scientific). La conversión de ARN a ADNc se realizó utilizando el kit de dos pasos QRT-PCR (Applied Biosystems, EE.UU.). Se utilizó un total de 1 mg /ml de cDNA (1 l) en el ensayo de genes de expresión con cebadores siete TaqMan específicas y sonda (β-actina, Bax, Bcl-2, survivin, así como las caspasas 3, 8 y 9) se añadieron genes en el ensayo (Applied Biosystem, EE.UU.). Los niveles de expresión génica fueron entonces evaluadas usando el sistema de PCR (Applied Biosystems, EE.UU.) StepOne Plus en tiempo real; cada ciclo consistía en 2 min de la transcriptasa inversa a 50 ° C, 20 seg de activación de la polimerasa a 95 ° C, 1 seg de desnaturalización a 95 ° C y 20 seg de recocido a 60 ° C. El proceso se completó después de 40 ciclos de lectura. Los datos fueron calculados con base en la comparativa Ct (2-ΔΔCt) método estándar descrito en el estudio de Wong y Medrano (2005) [29].
Western blot ensayo
El Caov-3 las células se sembraron en un matraz de cultivo de 75 ml y se trataron con pulchrin a (22 mM) a las 24, 48 y 72 h. Las células recogidas se centrifugaron a 13.000 rpm durante 10 s y 400 l de PRO-PREP
™ se añadió una solución para resuspender las células. Las células fueron inducidas para la lisis por incubación a -20 ° C durante 20 min. Antes de la separación por 10% SDS-PAGE, 100 g de proteína se dividió en alícuotas y se mezclan con colorante de carga. El gel se dejó funcionar durante 90 min antes de que se transfirió a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) (Bio-Rad). La membrana de PVDF se bloqueó durante 3 h con 5% de BSA. El anticuerpo primario para
β-actina
(1: 1000), Bax (1: 1000), Bcl-2 (1: 1000), survivina (1: 1000), las caspasas 3 y 9 (1: 1000 ) y se escindió caspasas 3 y 9 (1: 1000) se conjugaron con un anticuerpo secundario (de cabra pAb a RB IgG). El proceso continuó durante 1 h de incubación a temperatura ambiente. El anticuerpo unido se detectó utilizando un kit de detección colorimétrico y se expuso durante varios minutos para permitir la aparición de las bandas. La membrana de PVDF fue visto y fotografiado usando un transiluminador de luz UV.
Proteína perfil de la matriz
Caov-3 células tratadas con Pulchrin A (22 M) se evaluaron para determinar los marcadores de proteínas apoptóticas mediante el proteoma Profiler array (RayBio
® humana la apoptosis del anticuerpo Kit array, RayBiotech, EE.UU.), de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se añadió proteína extraída (200 mg /ml) a partir de Caov-3 células en cada pocillo que contiene la membrana y se dejó durante la noche a 4 ° C para la incubación. El procedimiento de lavado utilizando tampones de lavado I y II fue ejecutado para cada incubación. Antes de la detección, se añadió la membrana con un cóctel de anticuerpo biotinilado y posteriormente con HRP-estreptavidina para la incubación durante la noche. Un total de 500 l de la memoria intermedia de detección se pipeteó sobre la membrana. Las membranas intercaladas fueron transferidos y expuestos al sistema de imágenes de quimioluminiscencia y después se fotografiaron (BioSpectrum AC Chemi HR 410, UVP, Cambridge, Reino Unido).
Ciclo celular ensayo
Las células tratadas con un pulchrin se recogieron y después se lavó dos veces con PBS a 1800 rpm centrifugación durante 5 min. Las células se fijaron con una solución de fijación mediante la adición de 700 l de 90% de EtOH frío y se mantuvieron durante la noche a 4 ° C para restaurar la integridad células. luego EtOH se desechó y se lavó con 600 l de PBS por centrifugación a 1800 rpm durante 5 min. Un total de 25 l de ARNasa (10 mg /ml) y 50 l de yoduro de propidio (PI) (1 mg /ml) se mezclaron con las células fijadas y se incuba durante 1 h a 37 ° C. El análisis del contenido de ADN para la detención del ciclo celular se realizó por citometría de flujo (BFACSCanto
™ II).
interacción de unión proteína-
Este estudio se ha realizado mediante la proteína anti-apoptótica Bcl 2 en conjunción con el estándar inhibidor de Bcl-2 ABT 737 [30]. La estructura cristalina tridimensional de Bcl-2 se obtuvo de la Protein Data Bank RCSB [31, 32] con 4IEH el AP de ID [30]. Se utilizó el programa de software de acoplamiento automático (AutoDock 4.2) para calcular el acoplamiento de moléculas pequeñas, basado en el algoritmo genético lamarckiana [33]. Las moléculas de agua se eliminaron para la preparación de moléculas de proteína. átomos de hidrógeno polares fueron añadidos a la estructura, mientras que los átomos de hidrógeno no polares se fusionaron. Además, los cargos Gasteiger y parámetros de solvatación fueron asignados de forma predeterminada. Al utilizar el software AutoGrid 4.2, el archivo de parámetros de rejilla se estableció usando los valores para x, y, y Z; el espaciado de la malla era de 0.375 Å, el valor por defecto. La energía de enlace interacción también se calculó utilizando el programa AutoDock 4.2.
El análisis estadístico
El IC
50 valores se determinaron utilizando GraphPad Prism ver. 4.0 (GraphPad Software Inc, EE.UU.). Cada ensayo se llevó a cabo en tres repeticiones, y los valores se presentan como media ± desviación estándar (SD). Mediante el uso de SPSS ver. 17,0 (IBM Corporation, EE.UU.), ANOVA de una vía con la prueba de Dunnett se utilizó para analizar los datos para la significación estadística. Mientras tanto, los análisis cuantitativos de proteínas se perfomed utilizando el software ImageJ.
Resultados
Estructura Identificación de Pulchrin Un
Un nuevo derivado de cumarina natural, pulchrin A (Figura 1) fue dilucidada mediante el uso de los espectros de RMN completa (Tabla 1), así como la espectrometría de masas UV, IR y ESI (S1-S7 Figs).
la correlación HMBC se pone de relieve con flechas rojas y azules indicados como
J
2 y
J
3, respectivamente, mientras que las correlaciones COSY en flecha de color negro
aceite blanco.; Rendimiento: 0,005%, [α] -16 (
c
0,05, CHCl
3). TLC: (
n-hexano
: EtOAc, 80:20 v /v): R
f = 0,56. UV (MeOH) λ
max (registro de €): 356 (3.80), 315 (4.03), 280 (4,32) nm. IR ν
max (CHCl
3); 2921, 2853 (CH), 1759 (OC = O), 1463 cm
-1. HRESIMS m /z [M + Na] 465,3240 (10), 338,3380 (90), 339,3430 (60) (calculado para C
30H
50O
2, 442,7066).
1 H RMN (CDCl
3, 600 MHz) δ ppm: 0,89 (3H,
m
, H-21), 1,25 (2H,
m
, H-18) , 1,28 (14H,
m
, H-11, H-12, H-13, H-14, H-15, H-16, H-17), 1,29 (2H,
m
, 6'-H), 1,30 (2H,
m
, H-19), 1,32 (2H,
m
, H-20), 1,34 (2H,
m
, 7'-H), 1,43 (2H,
m
, H-8'), 1,51 (2H,
m
, H-2), 1,55 (2H ,
m
, H-10), 1,59 (2H,
m
, H-5 '), 2,02 (2H,
m
, H-9), 2,21 (2H,
m
, H-3), 2,25 (2H,
m
, H-1), 2,91 (2H,
m
, H-6), 2,93 (1H,
m
, H-4a), 4,90 (1H,
m
, H-8a), 5,33 (1H,
m
, H-7) , 5,35 (1H,
m
, H-8), 5,40 (2H,
m
, H-4, H-5), 6,98 (1H,
m
, H-4 ').
13C RMN (CDCl $
3, 150 MHz) δ ppm: 14,1 (C-21), 22,4 (C-20), 22,7 (C-18), 24,3 (C-3), 25,2 (C- 1), 26,6 (C-2), 27,2 (C-7 '), 27,4 (C-9), 27,9 (C-5'), 28,0 (C-10), 29,2 (C-6 '), 29,5 ( C-11, C-12, C-13, C-14), 29,6 (C-15, C-16, C-17), 29,7 (C-8 '), 32,0 (C-19), 56,8 (C 4a), 57,3 (C-6), 76,9 (C-8a), 128,3 (C-8), 129,8 (C-7), 131,0 (C-4, C5), 134,4 (C-3 '), 148,8 (C-4 '), 173,9 (C-2').
Efecto citotóxico de Pulchrin Un
se ensayaron tres líneas celulares, incluyendo dos células de cáncer de ovario (Caov-3 y SKOV- 3) y una línea inmortalizada humana normal de ovario epitelial celular (T1074) para determinar los efectos citotóxicos de pulchrin a (Tabla 2). Además, el cisplatino se ensayó también como control positivo en este estudio (Fig 2). El IC
50 resultados mostraron que pulchrin A inhibió 50% de Caov 3 de crecimiento de células a 22.31 mu M, en comparación con 33,63 M contra células SKOV-3 después de 24 h de tratamiento. -3 SKOV células El Caov-3 y se investigaron más de los efectos citotóxicos a las 48 y 72 h, mostrando disminuciones en el IC
50 valores como se muestra en la figura 2. Mientras tanto, los efectos citotóxicos de pulchrin A mostraron efectos comparables en comparación con cisplatino a las 24 h contra Caov-3 y células Skov-3, lo que demuestra que pulchrin Un ejerció mayor citotoxicidad contra las dos líneas celulares de cáncer de ovario. Por el contrario, un efecto menos citotóxica contra las células T1074 se encontró incluso a concentraciones de más de 100 mM.
El experimento se realizó por triplicado. Los datos se presentan como media ± desviación estándar.
Evaluación de la apoptosis por Citomorfología AO /PI tinción doble
El efecto apoptótico de pulchrin A en células Caov-3 y T1074 eran observado a través de cambios morfológicos bajo un microscopio de fluorescencia. La evaluación se llevó a cabo en citomorfología Caov-3 células debido a pulchrin A mostró bajo IC
50 concentración contra Caov 3-células en comparación con células SKOV-3 en el ensayo de citotoxicidad. Después del tratamiento a una concentración de 22 mM durante 24, 48 y 72 h, las células Caov-3 exhiben características apoptóticas en comparación con las células T1074. En condiciones sin tratar, las células exhiben una forma redondeada sana con una estructura nuclear intacta. La morfología células se cambiaron después de 24 h de tratamiento en Caov-3 células con la presencia de formación de ampollas en la membrana celular y la fragmentación del ADN. Amplia daño celular puede observarse claramente después de 48 h en adelante, con la presencia de cuerpos apoptóticos y un color rojizo-anaranjado, lo que indica que las células se sometieron a apoptosis tardía (Fig 3a). En contraste, las células T1074 no mostraron diferencias significativas en la morfología celular en comparación con las células no tratadas T1074 hacia proceso de apoptosis, lo que sugiere que pulchrin A era inocuo para las células de ovario normales (Fig 3b).
[A] no tratados y tratados -CAOV-3 células con pulchrin A a 24, 48 y 72 h de tratamiento. Las células Caov-3 mostraron formación de ampollas en la membrana celular tan pronto como 24 horas de tratamiento. Los siguientes 48 h de tratamiento mostraron más formación de ampollas en la membrana celular y la presencia de cuerpos apoptóticos y cromatina condensación. La presencia de células de tinción de color naranja a las 72 h de tratamiento, lo que representa el sello de finales de la apoptosis. [B] Las células no tratadas y tratadas con-T1074 pulchrin A a 24, 48 y 72 h de tratamiento. Las células T1074 no mostraron diferencias significativas en la morfología células después de tratarse con pulchrin A hasta 72 h de tratamiento. VI, células viables; BL, formación de ampollas de la membrana celular; CC, condensación de la cromatina; LA, la apoptosis tardía; AB, cuerpos apoptóticos. (Ampliación × 40 y 100 ×).
Análisis de Membrana La alteración
Los cambios en la membrana celular se observó mediante un ensayo de anexina V-FITC a cabo utilizando un matraz de 25 cointaining Caov-3 Las células tratadas con pulchrin a en 24, 48 y 72 h. Como se muestra en la figura 4, los resultados revelaron que Caov-3 células tratadas con pulchrin A en 24, 48 y 72 h se sometieron a apoptosis de fase temprana como se indica por 5,3, 9,4 y 14,3% de incremento en la cantidad de una manera dependiente del tiempo, respectivamente. Las células que se sometieron a apoptosis en fase tardía y la necrosis también aumentó dentro de los primeros 24 a 72 h después del tratamiento, a diferencia de las células viables, que mostraron una disminución de 92,5% a 40,5% en la población celular después del tratamiento.
[A] control (sin tratar), [B] 24 h, [C] 48 h, [D] 72 h. Color rojo oscuro rojo, azul, verde y la luz se ha indicado, la apoptosis temprana viable, la apoptosis y la necrosis secundaria tardía, respectivamente. Movimiento de la población celular se inició en la Q3 (células viables) a Q4 (a principios de la apoptosis) a Q2 (finales de la apoptosis), y finalmente a Q1 (necrosis secundaria). [E] histograma de las poblaciones de células viables de, principios de la apoptosis, a finales de la apoptosis y la necrosis secundaria-Caov-3 células. Los resultados se representan como media ± desviación estándar de tres réplicas. *
p
. & Lt; 0,05 indica una diferencia significativa del control
Análisis de caspasas
Las caspasas 3, 8 y 9 se ensayaron para determinar las vías de la apoptosis. Los resultados en la figura 5 muestran que las caspasas 9 y 3 se activa mediante pulchrin Una exposición a través de las vías intrínseca y ejecución, respectivamente. Por el contrario, la caspasa 8 mostraron valores irregulares, como se representa en el gráfico de barras, lo que sugiere que no activación de la caspasa 8 se detectó a través de la estimulación de pulchrin A. La activación de las caspasas 3, 8 y 9 también se confirmaron en los niveles de mRNA en el que sólo caspasas 3 y 9 exhiben sobre-expresión en relación con la caspasa 8 en una manera dependiente del tiempo. Del mismo modo, los niveles de expresión de caspasa 3 y caspasa 9 proteínas se upregulated significativamente (
p
& lt; 0,05) con relación a la de las células Caov-3 no tratados. Además, la expresión de la proteína de la caspasa 3 escindida y la caspasa 9 escindida aumentaron en los tres periodos de tratamiento diferentes, lo que indica que la inducción de la apoptosis se produjeron a través de las vías intrínseca y de ejecución.
[A y B] colorimétricos y real análisis PCR en tiempo de las caspasas 3, 8 y 9, respectivamente. [C] Western blot se caracteriza por imágenes y el histograma de los pro-caspasas y caspasas escindidos. Los resultados se representan como media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. La diferencia significativa se expresa como *
p
. & Lt; 0,05
Análisis de los cambios mitocondriales
Este estudio se realizó para examinar la participación de la mitocondria en la apoptosis tras pulchrin Un tratamiento. Los tres parámetros de intensidad nuclear total, la permeabilidad celular y citocromo
c
liberación indicaron que la intensidad de fluorescencia se incrementó, como se muestra en la figura 6. Las intensidades de fluorescencia de estos tres parámetros se incrementaron a concentraciones tan bajas como 22 M y significativa diferencias (
p
& lt; 0,05) se determinaron a una concentración de 33 mM. Por el contrario, la intensidad de fluorescencia del potencial de membrana mitocondrial (MMP) para los Caov-3 células pulchrin A-tratado se redujo de una manera dependiente de la concentración. No se observó diferencia significativa entre las células Caov-3 tratadas y no tratadas en concentraciones superiores a 33 mM cuando
p
. & lt; 0,05
Las células se tiñeron con Hoechst, la permeabilidad celular, potencial de membrana mitocondrial (MMP) y citocromo
c
colorantes. Las imágenes en cada fila fueron capturados desde el mismo campo. Las células Caov-3 mostraron una reducción en el número de células y MMP, mientras que las células tratadas con pulvhrin A en 24 h (20 aumentos) mostraron aumentos en la permeabilidad celular y citocromo
c
liberación. Histograma representa las intensidades medias observadas simultáneamente en Caov-3 células de una manera dependiente de la concentración de intensidad total nuclear, la permeabilidad celular, MMP y el citocromo
c
liberación. Todos los datos se determinaron como media ± desviación estándar en el que se expresó la diferencia significativa como *
p Hotel & lt; 0.05.
Fragmentación de ADN Ensayo
Este ensayo se realizó para confirmar la ocurrencia de finales de la apoptosis en las células tratadas con pulchrin A. La presencia de una escalera de ADN en las células Caov-3 se observó después de 24 h de tratamiento (figura 7); lo mismo se observó para el próximo 48 y 72 h. La formación de escalera de ADN demostró la aparición de fragmentación de ADN en las células Caov-3, que induce apoptosis
Lanes A-C:. Las células tratadas con pulchrin A para 72, 48 y 24 h, respectivamente. Carril D: células no tratadas.