Extracto
Este estudio se realizó para evaluar la importancia pronóstica de las aberraciones genómicas en el cromosoma 4q en pacientes con CPNM. Previamente hemos identificado el número de copias cambios en 4q12-q32 que se asociaron significativamente con la diseminación hematógena temprana del cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), y ahora el objetivo de reducir los posibles puntos calientes dentro de esta región que abarca 107 Mb. El uso de ocho marcadores de microsatélites en la posición 4q12-35, el desequilibrio alélica (AI) se realizaron análisis en un estudio de cohortes preliminar (
n =
86). Posiciones que indican asociaciones clínico-patológicos y pronósticos en el análisis de AI fueron validados en una cohorte de estudio más grande, utilizando fluorescencia
In situ
hibridación (FISH) en 209 pacientes con CPNM. Las pérdidas en las posiciones 4q21.23 y 4q22.1, se mostró a ser asociados con las características clínico-patológicos avanzados, así como con la enfermedad acortada libre (DFS) y supervivencia global (SG) (DFS:
P = 0,019
; OS:
P = 0,002
). Un análisis multivariante identificó las pérdidas de 4q21.23-22.1 ser un marcador independiente de pronóstico tanto para SLE y la SG en el CPNM (HR 1,64 a 2,20, todos los
P & lt; 0,04
), y especialmente en el cáncer de pulmón de células escamosas (
P & lt; 0,05
). Un estudio de caso clínico de un paciente con cáncer de pulmón reveló además una pérdida de 4q21.23 en las células tumorales diseminadas (DTC). Ni las ganancias en las últimas posiciones, ni aberraciones genómicas en 4q12, y 4q31.2 4q35.1, indicaron una relevancia pronóstica. En conclusión, nuestros datos indican que la pérdida en 4q21.23-22.1 en el CPNM es de importancia pronóstica en pacientes con CPNM y, por tanto, incluye los posibles nuevos genes supresores de tumores con relevancia clínica
Visto:. Uzunoglu FG, Dethlefsen E, Hanssen A, Wrage M, Deutsch L, Harms-Effenberger K, et al. (2014) Pérdida de 4q21.23-22.1 es un marcador pronóstico de la enfermedad y libre de la supervivencia global en células no pequeñas de cáncer de pulmón. PLoS ONE 9 (12): e113315. doi: 10.1371 /journal.pone.0113315
Editor: Sai Yendamuri, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 24 Marzo, 2014; Aceptado: 26 Octubre 2014; Publicado: Diciembre 11, 2014
Derechos de Autor © 2014 Uzunoglu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la hamburguesa Krebsgesellschaft eV, Hamburgo, Alemania. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la inestabilidad genómica es una de las características principales de cáncer [1]. Numerosos estudios sobre la inestabilidad genómica en el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) han puesto de relieve los patrones de eliminación específicos tanto para los tumores metastásicos y primaria [2] - [4]. número de copias aberraciones en NSCLC pueden encontrarse en múltiples regiones, un poco de ser específico para el subtipo histológico, y un poco de ser dependiente de la gravedad de los cambios histopatológicos (por ejemplo, el estadio del tumor o clasificación) [5] - [11] Además, la presencia de la copia de cambios de número ha demostrado ser un evento temprano en la patogénesis del cáncer de pulmón. Esto se puede encontrar en combinación con un patrón secuencial de pérdida de heterocigosidad (LOH), que comienza con la pérdida alélica en el cromosoma 8p, seguido de 3p y 9p supresiones [7], [12], [13].
Hemos demostrado anteriormente que la diseminación hematógena temprana de las células tumorales es impulsado por un patrón específico de cambios genómicos. Además de este patrón, una gran deleción del cromosoma 4q12-q32 (& gt; 107 Mbp) indica una fuerte asociación con la presencia de células tumorales diseminadas (DTC) en la médula ósea, así como las metástasis cerebrales de pacientes con cáncer de pulmón [14] . Sin embargo, la relevancia pronóstica de esta región aún no se ha investigado. El objetivo de este estudio fue a reducir las regiones críticas pertinentes y para investigar su impacto pronóstico en NSCLC. Además, hemos tratado de analizar si esta pérdida también podría ser detectada en los DTC de un paciente NSCLC.
Para ello, primero realizó desequilibrio alélica (AI /LOH) analiza en una cohorte estudio preliminar (
n =
86). Para realizar comprobaciones adicionales, se llevó a cabo una fluorescencia
In situ
hibridación de análisis (FISH) de 209 pacientes con CPNM. Una pérdida de un mínimo de 4 MB-región que abarca al 4q21.23-4q22.1 fue identificado como un marcador de pronóstico negativo significativo para la enfermedad de forma gratuita, así como la supervivencia global en el CPNM. Además, se realizó inmunofluorescencia consecutivo (IF) y FISH análisis sobre los DTC de un solo paciente NSCLC, mostrando una pérdida de 4q21.23 en el tumor primario. La misma pérdida también podría ser detectada en el DTC.
Materiales y Métodos
Muestras
Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Cámara de los médicos, Hamburgo, Alemania . Escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes. Toda la investigación clínica se ha llevado a cabo de acuerdo con los principios expresados en la Declaración de Helsinki. Se obtuvieron todas las muestras tumorales durante las resecciones quirúrgicas en el Centro Médico Universitario de Hamburgo-Eppendorf o departamentos quirúrgicos asociados. clinicopathological datos fueron extraídos de una base de datos prospectiva, y los datos de seguimiento se obtuvieron mediante entrevistas con el médico de cabecera o al paciente en la consulta externa
.
Para el desequilibrio alélica (AI) analiza en 4q, 86 tratados quirúrgicamente pacientes con CPNM con carcinoma primario emparejado disponible y ADN genómico sanos se evaluaron para su inclusión. La edad media de la cohorte del estudio fue de 65,9 años, con una proporción predominante masculina (65,1% frente a 34,9%). Con respecto a los tipos de células de cáncer de pulmón, 37 pacientes (43,0%) tenían un carcinoma de células escamosas (SQCC) y 49 (57,0%) de un adenocarcinoma (AC). El tiempo de seguimiento medio fue de 21,4 meses (2-60). Más detalle se da en la Tabla S1.
Para aberraciones número de copias de ADN (FISH) en 4q, un microarray tisular (TMA), que consta de 209 pacientes con cáncer de pulmón primario evaluables, se utilizó, con una edad media de 62,3 años en el momento de la cirugía. distribuciones de género eran comparables a la cohorte del estudio de AI, con un predominio similar de pacientes del sexo masculino (68,4%). La cohorte del estudio FISH abarcó 88 (42,1%) pacientes con SqCCs, 78 (37,1%) con CCAA, 34 (16,3%) con carcinoma de pulmón de células grandes, y nueve pacientes (4,5%) con cáncer neuroendocrino de pulmón. La mediana de seguimiento fue de 24,7 meses (2.5-60). Se dan más detalles en la Tabla S1.
Todos los pacientes fueron reclasificados según la séptima edición de la clasificación TNM de los tumores malignos [15]. En lo que se refiere a la administración de la terapia adyuvante, los siguientes criterios especificados se han aplicado desde 2004: ≥ pacientes en estadio II recibieron quimioterapia adyuvante con cisplatino y Vinorelbina. Por etapas pacientes Ib se evaluaron para la terapia adyuvante si el tumor era & gt; 4 cm o en pacientes con invasión en la vena (V +) o invasión en el vaso linfático (L +). La quimioterapia adyuvante seguida de radioterapia (50-60 Gy) se discutió durante ≥ Etapa III. Características de los pacientes para ambas cohortes de estudio se muestran en la Tabla S1.
aislamiento de ADN
ADN genómico de carcinoma emparejado (fresco congelado) y el tejido pulmonar no maligna verificado patológicamente-o leucocitos de sangre periférica, tomada antes de la cirugía fue extraído y purificado de acuerdo con el protocolo del fabricante utilizando el kit QIAamp tejido (Qiagen, Hilden, Alemania) o InnuPREP ADN Microkit (AnalytikJena, Jena, Alemania). Si es necesario, se llevó a cabo la microdisección manual, con el fin de obtener un contenido de células tumorales de al menos 70%. concentración de ADN se determinó por NanoDrop ND-1000 Espectrofotómetro (Wilmington, DE) y las muestras se diluyeron a 10 ng /l y se almacenó a -20 ° C hasta su uso.
alélica análisis desequilibrio
Based en nuestro estudio anterior, cuatro regiones representadas en las posiciones de punto de acceso 4q12, 4q21.23, 4q31.2 4q35.1 y se seleccionaron para su posterior análisis [14]. Para cada región, se utilizaron dos marcadores de microsatélites para evaluar la frecuencia y la relevancia clínica de la gripe aviar (ver Tabla S2, para los detalles de todos los marcadores de microsatélites). cebadores directos se marcaron con un colorante fluorescente (6-FAM) para electroforesis capilar subsiguiente. PCRs se llevaron a cabo en una mezcla de reacción de 10 l que consiste en 10 ng de ADN plantilla, 2,5 mM desoxirribonucleótidos mezcla trifosfato (Invitrogen, Darmstadt, Alemania), 2,5 pmol sentido y antisentido de cebadores (MWG, Ebersberg, Alemania), 0,25 U de AmpliTaq Gold polimerasa ( Applied Biosystems) y 5 l de agua libre de nucleasa. Las condiciones de PCR consistieron en ciclos repetidos a 95 ° C, 60 ° C-62 ° C y 72 ° C durante 30 s. Para la determinación de AI, electroforesis capilar con un ABI Prism 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Freiburg, Alemania), utilizando una mezcla de 40 ml de formamida (Hi-Di), 0,2 l Genescan-500-ROX estándar, así como 0,1 l de PCR productos y desnaturalización a 94 ° C durante 2 minutos, se efectuó y se evaluó la longitud de los fragmentos de los alelos y la intensidad de fluorescencia. Los alelos se definen como los dos picos más altos dentro del rango de tamaños y una relación de ≥1.5 entre las alturas de los picos del tumor y de los alelos normales fueron puntuados como AI. Para el aseguramiento de la calidad en general, el 10% de las muestras utilizadas fueron utilizados al azar para análisis repetidos. La concordancia de estado alélico era & gt;. 99%
fluorescencia
In situ
hibridación (FISH) Análisis
Análisis de la copia número pérdida de ADN de dos regiones de puntos calientes basa en los análisis de la IA se evaluó en un estudio más amplio de la población por fluorescencia
In situ
hibridación (FISH). Tres BAC sondas diferentes dirigidas a las regiones 2 (RP11-570L13: 4q21.23 y RP11-1053C2: 4q22.1) y 3 (RP11-634D8: 4q31.2) se hibridó en una TMA. Las sondas de BAC utilizados se obtuvieron de Life Sciences Fuente BioScience (Nottingham, Reino Unido). Uno g de cada sonda BAC se marcó mediante cebado aleatorio (Sistema de etiquetado BioPrime, Invitrogen) con la etiqueta fluorescente dUTPs (RP11-570L13 y RP11-634D8: Spectrum Orange, RP11-1053C2: verde del espectro; Enzo Life Sciences, Abbott). Como referencia, se emplea una sonda centrómero (CEP 10, SpectrumAqua) (Enzo Life Sciences, Abbott). Con el fin de controlar la especificidad y la calidad de los BAC sondas marcadas con fluorescencia, el pescado fue probado por primera vez en las extensiones de cromosomas en metafase. Posteriormente, se establecieron protocolos para los portaobjetos de parafina para cada sonda BAC por separado. En primer lugar, los portaobjetos se incubaron a 60 ° C durante una hora antes de que se desparafinaron en xileno y se hidrataron en una serie de etanol. La fijación se logró mediante la colocación de los portaobjetos en una solución de 2% de formaldehído y metanol a -20 ° C, seguido de un enjuague en solución salina tamponada con fosfato (1x PBS) y pre-tratamiento con una solución de pre-tratamiento (Invitrogen) a 90 ° C durante 10 min. Después de PBS de lavado, los portaobjetos se trataron con una pre-calentado enzima-reactivo (Invitrogen) a 37 ° C durante 10 min. Una vez más, se lavaron en PBS y luego se deshidrataron en una serie de etanol. Por último, los portaobjetos se desnaturalizaron a 85 ° C durante 5 min, antes de que se incubaron con mezclas de sondas de hibridación a 37 ° C durante la noche. a continuación, lavado post-hibridación se realizó en 2 x SSC, 0,3% de tampón NP-40 a 70 ° C y la temperatura ambiente, seguido de un segundo hidratación en una serie de etanol. solución DAPI se aplicó para la detección de células tumorales que no se superponen morfológicamente intactas. En promedio, las señales fluorescentes de 32 células tumorales para cada sonda se contaron (rango 11-57). Con el fin de evaluar el sesgo experimental, así como para definir los puntos de corte de la relación señal-centrómero, se contaron las señales de hibridación de 10 muestras de control normales (también situada en el TMA). En consecuencia, una proporción & gt; 1,5 se definió como una célula que lleva un ADN de ganancia, mientras que una relación & lt; 0,75 se definió como una pérdida
consecutiva tinción de inmunofluorescencia y análisis FISH
Para el. aislamiento de los DTC, las células mononucleares a partir de aspirados de médula ósea de pacientes con CPNM se aislaron por centrifugación gradiente de Ficoll. Las células fueron luego cito-centrifugaron sobre portaobjetos de vidrio. Para detectar los DTC, una tinción inmunocitoquímica se realizó de acuerdo con el método APAAP (fosfatasa alcalina contra fosfatasa alcalina), utilizando un anticuerpo contra citoqueratinas (A45-B /B3, Micromet, Martinsried, Alemania) [16]. An, anticuerpo isotipo murino monoclonal (MOPC 21, IgG1; Sigma-Aldrich) sirvió como control negativo. los pacientes con CDT positivos se utilizaron para el análisis de la pérdida de 4q22.1 mediante análisis FISH. FISH se realizó en células tumorales que fueron detectados previamente por SI tinción con un anticuerpo marcado con Cy3 anti-citoqueratina (A45-Cy3; Micromet). Para la fijación celular, se utilizó la solución B (Micromet). Después de una etapa de lavado PBS, sitios de unión inespecíficos se bloquearon con 10% de suero AB (Biotest AG, Dreieich, Alemania). Otro lavado PBS fue seguido por 45 min de tratamiento de anticuerpo A54-Cy3 (1:300). Las células se lavaron de nuevo y DAPI (CellSearch) se aplicó para la tinción nuclear. DTC se identificaron de forma automatizada (Ariol Scan, Leica Biosystems, Nussloch, Alemania) y localizada con el Buscador de Inglaterra para la re-identificación. Para el análisis de FISH consecutivos, las células se lavaron con PBS y se incubaron durante 7 min en una proteinasa pre-calentado K (0,1 mg /ml) solución (Tris-HCl 20 mM pH 7,5, 0,2% CaCl2xH2O ad 50 ml de Aqua dest.). Posteriormente, las células se deshidrataron en una serie de etanol y se desnaturalizó durante 5 min a 75 ° C (70% de formamida, 0,6 x SSC, pH 7,4). Las células fueron de nuevo deshidratado y mezclas de sondas de hibridación se desnaturalizaron durante 5 min a 75 ° C. La hibridación se realizó durante la noche a 37 ° C. lavado post-hibridación se realizó en 50% de formamida /SSC 2x, 2x SSC y en en 0,1 x SSC a 45 ° C. Después de aplicar DAPI, los DTC fueron reubicados y se contaron las señales fluorescentes de centrómero 3 y sondas RP11-1053C2. Una proporción de & lt; 0,75 se define como una pérdida
El análisis estadístico
Para el análisis estadístico se utilizó el programa SPSS 21.0 para MAC (SPSS Inc., Chicago, IL).. Correlación entre cambios de número de AI /copia y parámetros clínico se evaluaron mediante la prueba de chi-cuadrado. La supervivencia global (OS) se calcula como el período comprendido entre la fecha de la cirugía, ya sea a la fecha de la muerte o el último seguimiento, lo que ocurra primero dentro de los 60 meses. La supervivencia libre de enfermedad (DFS) se define como el período comprendido entre la fecha de la cirugía a la fecha de la recurrencia o de muerte relacionada con el tumor, lo que ocurra primero dentro de los 60 meses. se censuraron los pacientes vivos sin recurrencia en la última fecha de seguimiento o después de 60 meses. La mortalidad intrahospitalaria (dentro de los 60 días) llevó a la exclusión del análisis de supervivencia. La supervivencia se analizó mediante la prueba de log-rank y se representa mediante el método de Kaplan-Meier. Si no se especifica lo contrario, los resultados se presentan como la mediana de supervivencia en meses con intervalos de confianza del 95% (IC del 95%). Para un análisis multivariante, se utilizó un modelo de riesgos de regresión de Cox para evaluar el valor pronóstico de AI /copiar los cambios de numeración. Los resultados se presentaron como cociente de riesgos instantáneos (CRI) y el IC del 95%. declaraciones significativas se refieren a los valores de p de pruebas de dos colas. & lt; 0,05
Resultados
microsatélites análisis
La cohorte del estudio utilizado para el análisis de microsatélites consistió en un total de El carcinoma 86 de concordancia y muestras de tejido normal de pacientes con cáncer de pulmón que se sometieron a cirugía. Un análisis de microsatélites se llevó a cabo en un total de cuatro regiones en el cromosoma 4q, utilizando dos marcadores polimórficos para cada región. alélicas marcadores cercanos entre sí revelaron frecuencias muy similares de eliminación que conducen a la pérdida definitiva de frecuencias de heterocigosis de 18,6% (
n =
16) en la región 1; 23,3% (
n =
20) en la región 2; 25,6% (
n =
22) en la región 3 y el 34,9% (
n =
30) en la región 4. La tasa de casos no informativos varió de 16,3% a 36,0%, dependiendo en el marcador. Mediante el uso de dos marcadores para la detección de la IA en cada región, los casos no informativos podían reducirse a intervalos de 2,3% a 15,1%. Regiones 1 y 3 tuvieron resultados concordantes (normal /pérdida), mientras que la región 2 contenía tres resultados disconcordant y la región 4 contenía uno de cada uno. Todos los resultados disconcordant se repitieron y los resultados se mantuvieron idénticos, lo que indica un posible punto de ruptura entre los marcadores. En total, el 45,3% (
n =
39) reveló al menos una pérdida alélica dentro de las regiones analizadas. Dentro de estos pacientes, el 17,9% (
n = página 7) reveló una pérdida en todas las regiones. Los resultados numéricos detallados se dan en la Tabla 1 y Figura S1, información de apoyo.
AI en el cromosoma 4q y las características clinicopatológicas
No hubo evidencia de una correlación estadística significativa entre la IA con clinicopatológica características en las cuatro regiones investigadas. Sin embargo, el 83,3% (
n =
15) de los pacientes con AI en la región de 2 desarrollaron una recaída en contraste con 16,7% (
n =
3) sin AI (P = 0,073).
AI en el cromosoma 4q como marcador pronóstico para la supervivencia
en el análisis univariante de supervivencia, una tendencia hacia la supervivencia libre (DFS) y en general más corta enfermedad (SG) en pacientes con AI en la región 1 y 2 fue evidente (diferencia mediana de supervivencia de 11,9 meses a 14 meses, más detalles se dan en la Tabla S3). Sin embargo, las diferencias no alcanzaron significación estadística (p & gt; 0,05). Desde la cohorte del estudio de análisis de supervivencia se limita a 68-77 casos, incluidos los pacientes en estadio IV de la UICC, así como los pacientes con márgenes de resección positivos, efectos sobre el análisis de supervivencia de confusión eran de esperar. Esto fue evidente para la región 2. Por lo tanto, después de la estratificación por edad, sexo, estadio tumoral, y los parámetros de los márgenes de resección, la presencia de la influenza aviar en la región 2 ha demostrado ser un marcador pronóstico independiente para la DFS (HR 3,82,
P =
0,044). Una tendencia similar no significativa se observó también para el sistema operativo (HR 3,56,
P = 0,072
). Un estadio tumoral UICC ≥ III fue el marcador de pronóstico negativo más fuerte y sólo adicional para SLE y la SG, con HR 4,22 (
P = 0,007
) y HR 2,87 (p = 0,047), respectivamente (Tabla S4).
FISH análisis de número de copias
a partir de los resultados reportados allelotyping, hemos tratado de verificar estos resultados en un estudio más amplio de la población mediante el análisis FISH. Dos sondas BAC diferentes, una hibridación de la región 2 y uno de hibridación de la región 3 se establecieron (S5 Tabla).
En la región 4q21.23 detectada por RP11-570L13, una pérdida de ADN se observó en el 24,9% (
n =
52) y una ganancia de ADN en el 4,3% (
n = página 9) de las muestras analizadas. Una pérdida detectada en esta posición reveló una correlación en función del tipo histológico significativa, con un 38,0% (
n =
30) pérdida de SQCC en contraste con el 22,7% (
n = 15
,
P = 0,049
) en AC. El análisis con RP11-1053C2 sonda reveló la pérdida de un 30,6% y un aumento de 7,2% (
n =
15), de nuevo mostrando una tasa significativamente más frecuente pérdida de SQCC (44,6%,
n =
33) en comparación con AC (23,3%,
n = 17
,
P = 0,022
).
Uso RP11-634D8 sonda (región 3), la tasa de análisis de éxito fue del 71,6% (
n =
204). Se detectó una pérdida de número de copias de ADN en el 36,8% (
n =
77) y una ganancia de 7,7% (
n =
16) de las muestras analizables.
Copiar número pérdida en el cromosoma 4q y las características clinicopatológicas
Copiar número pérdida en la posición 4q21.23 (RP11-570L13) mostró una correlación significativa con el tamaño del tumor avanzado (
P = 0,005
), pero sin otras características patológicas. Copia número pérdida en la posición 4q22.1 (RP11-1053C2) reveló una asociación significativa con la presencia de metástasis en los ganglios linfáticos (pérdida pN0: 25,2%,
n = 26 frente a la pérdida
≥pN1: 44,0%,
n = 37
;
P = 0,005
), así como etapa avanzada de la UICC (pérdida UICC I: 25,3%,
n = 23
frente a la pérdida de la UICC ≥II: 41,4%,
n = 41
;
P = 0,032
). Copia número pérdida en la posición 4q31.2 (RP11-634D8) mostró una correlación significativa con el tamaño del tumor avanzado (
P = 0,019
). Sin embargo, no hay más correlaciones con las características clínico-patológicas fueron evidentes (Tabla S5).
Copiar número pérdida en el cromosoma 4q como marcador pronóstico para la supervivencia
En el contexto de un análisis univariado, copia número pérdida en la posición 4q21.23 (RP11-570L13) reveló una tendencia no significativa hacia más corto mediana DFS (12,5 meses frente a 28,0 meses,
P = 0,056
). Los análisis de subgrupos, sin embargo, mostró una fuerte correlación con DFS en SQCC subgrupo (11,2 meses frente a 39,1 meses, P = 0,031; Fig. 1, S6 Tabla). Se informó de un efecto similar en OS para toda la cohorte del estudio (23,9 meses frente a 42,6 meses,
P = 0,033
) y subgrupo SQCC (12,5 meses frente a 41 meses,
P = 0,031
, higo . 2, Tabla S6)
a:. Copiar número pérdida en la posición 4q21.23 (RP11-570L13) reveló una tendencia hacia una menor supervivencia libre de enfermedad de la mediana (DFS) en el análisis univariado (12,5 meses frente a 28,0 meses,
P = 0,056
). B: Copia número pérdida en la posición 4q21.23 (RP11-570L13) en el carcinoma de células escamosas (SQCC) subgrupos mostró una fuerte correlación con DFS más corta (11,2 meses frente a 39,1 meses)
P = 0,031
. C: Copia número pérdida en la posición 4q22.1 (RP11-1053C2) mostró correlaciones significativas con DFS más corta (12,5 meses frente a 32,7 meses),
P = 0,010
. D: Copia número pérdida en la posición 4q22.1 (RP11-1053C2) mostró correlaciones significativas con DFS más cortos en SQCC subgrupo (11,7 meses frente a 35,5 meses),
P = 0,027
. Supervivencia de las parcelas de las aberraciones de ganancia se desvanecieron en aras de la claridad
A:. Copiar número pérdida en la posición 4q21.23 (RP11-570L13) reveló una fuerte correlación con la supervivencia más corta mediana global (SG) en El análisis univariado (23,9 meses frente a 42,6 meses),
P = 0,033
. B: Copia número pérdida en la posición 4q21.23 (RP11-570L13) en el carcinoma de células escamosas (SQCC) subgrupos mostró una fuerte correlación con el sistema operativo más corto (12,5 meses frente a 41 meses),
P = 0,031
C: Copia número pérdida en la posición 4q22.1 (RP11-1053C2) mostró correlaciones significativas con DFS más corta (25,8 meses frente a 40,3 meses),
P = 0,012
. D: Copia número pérdida en la posición 4q22.1 (RP11-1053C2) mostró correlaciones significativas con DFS más cortos en el subgrupo de colon (10,0 meses frente a 43,1 meses),
P = 0,035
. Supervivencia de las parcelas de las aberraciones de ganancia se desvanecieron en aras de la claridad.
Copiar número pérdida en la posición 4q22.1 (RP11-1053C2) mostraron correlaciones significativas con la mediana más corto DFS dentro de toda la cohorte de estudio, así como dentro del subgrupo SQCC (12,5 meses frente a 32,7 meses,
P = 0,010
y 11,7 meses frente a 35,5 meses,
P = 0,027
; Fig. 1, Tabla S6). Por otra parte, una pérdida de 4q22.1 se asoció con el sistema operativo más corto dentro de toda la cohorte del estudio y el subgrupo de CA, mientras que no se observó correlación dentro del subgrupo SQCC (toda cohorte del estudio: 25,8 meses frente a 40,3 meses,
P =
0,012; subgrupo de CA: 10,0 meses frente a 43,1 meses,
P = 0,035
, figura 2, Tabla S6)
por el contrario, las ganancias de número de copias no revelaron una correlación con la supervivencia a.. cualquiera de las posiciones analizadas. En línea con los resultados de la cohorte del estudio de AI, copia número pérdida en la región 3 (RP11-634D8, posición 4q31.2) no tuvo ningún impacto sobre la supervivencia (Tabla S6)
.
Los análisis multivariados número de copias pérdida identificado por lo posición 4q21.23 (RP11-570L13) como un marcador negativo pronóstico de SLE y la SG para toda la cohorte del estudio (cox modelo de riesgo proporcional, estratificado por edad, sexo, despacho de margen, la clasificación y el estadio de la UICC; DFS: HR 1,77 (1.10- 2.84 IC 95%),
P = 0,019
; OS: HR 2,20 (IC del 95% 1,33 a 3,64),
P = 0,002
, tabla 2), así como para el subgrupo SQCC ( DFS: HR 2,85 (1,35-6,04 IC del 95%),
P = 0,006
; OS: HR 2,77 (IC del 95% 1.26 a 6.13),
P = 0,012
, S7 Tabla). Se observaron resultados similares para la pérdida del número de copias en la posición 4q22.1 relativa a todo el grupo de estudio (RP11-1053C2; DFS: HR 1,64 (IC del 95% 1,03 a 2,61),
P = 0,038
; OS: 1.84 ( 01.12 a 03.01; IC del 95%),
P = 0,015
, cuadro 3), mientras que el análisis de subgrupos no alcanzó significación estadística (tabla S8). Un segundo modelo de análisis multivariado incluyendo la administración de la quimioterapia adyuvante se llevó a cabo (información disponible en 116 pacientes). Los resultados permanecieron significativas cuando se incluyó la administración de quimioterapia adyuvante (datos no mostrados).
En resumen, las dos posiciones en la región 2, a saber 4q21.23 (RP11-570L13) y 4q22 0,1 (RP11-1053C2), fueron identificados como marcador pronóstico negativo para DFS, así como sistema operativo en toda la cohorte del estudio. Sin embargo, sólo la pérdida en la posición 4q21.23 alcanzó significación también en el subgrupo SQCC. Un diagrama de flujo que resume el análisis de supervivencia de la cohorte del estudio, el progreso del estudio y los resultados se dan en las figuras S2 y S3.
Presentación de un caso de pérdida de 4q21.23 DTC
Sobre la base de nuestra anterior encontrando que 4q12-32 pérdida se correlaciona con el estado DTC positivo, hemos querido investigar si una pérdida de esta región también está presente en los DTC de un paciente con pérdida de 4q en el tumor primario [14]. Se detectó una pérdida de 4q22.1 en el 77% (17/22) de los pacientes DTC. El rango de la sonda RP11-1053C2 y centrómero 3 señales fueron heterogéneos, variando de 1 a 5 señales (media de 1,7 y 2,7 respectivamente). FISH análisis se realizó también en el material primario del tumor de pulmón y la recaída incluido en parafina del mismo paciente (fig. 3). Estos resultados revelaron nuevamente una pérdida de 4q22.1 y el alto grado de heterogeneidad en las células individuales que van desde 0-4 señales de tumor primario y 0-5 en material de recidiva tumoral.
Células de la médula ósea del paciente se tiñeron immunocytochemically contra citoqueratina utilizando el método APAAP. se muestran Un DTC positivo (rojo) y un leucocito negativo (marrón). B: Células de la médula ósea del paciente fueron teñidas con fluorescencia contra citoqueratina (señal roja) seguido de análisis FISH en C) con la sonda y la sonda RP11-1053C2 CEN3 (sonda RP11-1053C2: 1 señal verde; sonda CEN3: 3 señales de espectro naranja ; tinción nuclear en DAPI). Cen7 sonda (sonda Cen7: aqua espectro mostrado en el color magenta pseudo-color) fue además utilizado para el análisis de FISH en D) del tumor primario (2-5 señales de color naranja /célula, 2-4 señales magenta /célula y 0-2 señales verdes /célula) y e) material tumoral FFPE recaída (3-6 naranja, magenta y 4-5 1-3 señales verdes /célula).
Discusión
En un estudio previo , hemos sido capaces de identificar cinco regiones cromosómicas que diferencian los pacientes con o sin diseminación tumoral temprano. La pérdida de 4q12-q32 mostró la correlación más fuerte con el estado DTC positivo. Setenta y tres genes dentro de esta región se encontraron abajo regulada entre los pacientes de NSCLC de médula ósea positiva, lo que indica una presencia probable de genes supresores de tumores dentro de esta región [14]. En este estudio, hemos sido capaces de reducir la región de destino e identificar las pérdidas de número de copias dentro de un mínimo de 4 MB-que abarcan la región en el cromosoma 4q21.23-22.1 como marcadores pronósticos independientes para DFS, así como sistema operativo en el CPNM. La presencia de pérdidas de número de copias dentro de esta región se asocia con al menos 18 meses de supervivencia media más corta, en comparación con pacientes con el número de copias normales. Además, la presencia de las pérdidas de número de copias provocó un aumento del riesgo de recurrencia de la enfermedad y la muerte que van desde 1,6 hasta 2,9 dentro de los 60 meses de seguimiento, independiente de los marcadores de pronóstico establecidos para NSCLC (dependiendo de subtipo y la posición de la pérdida de número de copias histológico) . Por otra parte, en nuestro estudio, informe del caso, hemos sido capaces de demostrar que la pérdida de la región cromosómica 4q21.23 no sólo está presente tanto en el tumor primario de pulmón y en el tejido de la recaída del tumor, sino también en una gran parte de los DTC muy heterogéneos. Esto pone de relieve la importancia de esta región cromosómica para la difusión de tumores. disomía uniparental es un mecanismo de cómo la pérdida de heterocigosidad en las células podría originar [17]. En CPNM no tenemos conocimiento de estudios que indican disomía uniparental en 4q. Por desgracia, no podía desarrollar una investigación específica sobre si la AI en nuestras muestras se debió a disomía uniparental, ya que las muestras para los análisis de AI y los peces no se superponían. No fuimos capaces de hacer cualquier declaración si una pérdida 4q se produce con mayor frecuencia en un caso polysomic del cromosoma 4, ya que utilizamos centrómero 10 como referencia. En nuestro documento original que describe la relación entre la pérdida de 4q y el estado DTC positivo se investigó a 30 pacientes con CPNM por CGH array. En este lugar pequeño número de casos, pero no hemos encontrado ninguna correlación entre la pérdida de 4q y el número total de aberraciones cromosómicas [14], lo que indica que la pérdida de 4q se asocia específicamente con el comportamiento metastásico, independiente del nivel de inestabilidad cromosómica en el tumor .
Pérdida de diversas regiones de tamaño en el cromosoma 4q se ha asociado con menores tasas de supervivencia en muchos tipos de cáncer epitelial, incluyendo el cáncer colorrectal, de páncreas ductal adenocarcinoma, hepatoblastoma y el carcinoma oral de células escamosas [3], [18] - [22]. Por otra parte, en el CPNM, las pérdidas de 4q se han asociado con los adenocarcinomas de pulmón metastásicos. Sin embargo, el tamaño y la localización de las supresiones 4q varía entre los diferentes estudios [3], [18] - [22]
Además de la identificación de la región diana 4q en NSCLC y su potencial relevancia clínica, nuestra. datos indican desviaciones específicos de subtipo histológico en términos de pérdida de frecuencias alélicas y relevancia pronóstica. El análisis de subgrupos reveló una tasa significativamente mayor de pérdida alélica en sondas SQCC en contraste con sondas de corriente alterna. En línea con estas diferencias, la pérdida en 4q21.23 (con RP11-570L13 marcador) dentro de la región 2 fue identificado como un marcador pronóstico negativo para SLE y la SG en toda la cohorte del estudio NSCLC y especialmente el subgrupo SQCC. no se encontró Esta región a ser un marcador pronóstico independiente en el subgrupo AC. Los histológicos subtipo específico de frecuencias de pérdida de alelos observados con influencia variable sobre la supervivencia están en línea con anteriores estudios que informan de varias regiones cromosómicas diferenciadores SQCC de AC, incluyendo la pérdida más común de 4q en SQCC [5], [8] - [10], [23], [24]. Por otra parte, numerosos estudios han indicado que estos diferentes alteraciones genómicas de CA y SQCC podrían proporcionar oportunidades propicias para las terapias potenciales seleccionados de pacientes con cáncer de pulmón [11]. Como los LCLC y pulmonares neuroendocrinos subgrupos de cáncer eran demasiado pequeños para los análisis de subgrupos, se necesitan más estudios para evaluar el impacto potencialmente desviarse de los desequilibrios alélicos en 4q en estos subtipos histológicos.
Nuestra cohorte del estudio no incluyó precancerosa lesiones. Como consecuencia de ello, todavía no está claro si estos desequilibrios alélicos cruciales ocurren dentro de la línea de tiempo de la patogénesis del cáncer de pulmón.