Extracto
cáncer de pulmón de células pequeñas para no albergar receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) mutaciones alcanza una respuesta significativa a los inhibidores de quinasa del EGFR-tirosina (TKIs). Sin embargo, la resistencia adquirida a EGFR-TKI podría afectar el resultado a largo plazo en casi todos los pacientes. Para identificar los posibles mecanismos de resistencia, establecimos líneas celulares resistentes a EGFR-TKI de la líneas celulares de cáncer de pulmón humano and11-18 PC9, que albergaba mutaciones activadoras del EGFR. se establecieron de forma independiente una línea celular resistente a erlotinib de PC9 y dos líneas celulares resistentes a erlotinib y gefitinib dos líneas celulares resistentes de 11-18. se observó pérdida casi completa del gen EGFR delE746-A750 mutante en las células de erlotinib resistentes aisladas de PC9, y la pérdida parcial de la mutante de copias del gen EGFR L858R se observó específicamente en las células Erlotinib- y gefitinib resistente 11-18. Sin embargo, la activación constitutiva de EGFR señalización corriente abajo, PI3K /Akt, se observó incluso después de la pérdida del gen EGFR mutado en todas las líneas celulares resistentes incluso en presencia de la droga. En las células resistentes a erlotinib de PC9, PI3K constitutiva de activación /Akt se inhibió de manera efectiva por el lapatinib (un doble TKI del EGFR y HER2) o BIBW2992 (pan-TKI de proteínas de la familia EGFR). Además, erlotinib, ya sea con HER2 o HER3 desmontables por sus siRNAs cognados también inhibe la activación de PI3K /Akt. La transfección de activación de ADN complementario EGFR mutante restauró la sensibilidad de drogas en la línea celular resistente a erlotinib. Nuestro estudio indica que la pérdida de la adicción a la mutante EGFR resultó en la ganancia de la adicción a ambos HER2 /HER3 y PI3K /Akt señalización para adquirir resistencia EGFR-TKI
Visto:. Tabara K, Kanda R, Sonoda K, Kubo T, Murakami Y, Kawahara A, et al. (2012) Pérdida de Activación del EGFR mutante de genes contribuye a la resistencia adquirida a EGFR inhibidores de tirosina cinasa en las células del cáncer de pulmón. PLoS ONE 7 (7): e41017. doi: 10.1371 /journal.pone.0041017
Editor: G. Yiqun Shellman, Universidad de Colorado, Estados Unidos de América
Recibido: 21 Febrero, 2012; Aceptado: 15 de Junio de 2012; Publicado: 17 Julio 2012
Derechos de Autor © 2012 Tabara et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación fue apoyado por becas-en-ayudas a la Investigación Científica en Áreas prioritarias (cáncer) del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología de Japón y por la investigación sobre el control 3er término amplio para el cáncer del Ministerio de Salud, Trabajo y Bienestar, Japón. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
de células pequeñas no cáncer de pulmón (NSCLC) es uno de los cánceres malignos más comunes y una causa principal de muerte en todo el mundo. El desarrollo de medicamentos contra el cáncer que se dirigen a receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) ha mejorado el tratamiento de NSCLC. Dos inhibidores de quinasa del EGFR-tirosina representativos (EGFR-TKIs), gefitinib y erlotinib, tienen una estructura común quinazolina y han sido aprobados para el tratamiento del NSCLC progresiva. Tanto erlotinib y gefitinib muestran similares selectividad de inhibición de la quinasa basado en el análisis cuantitativo de la interacción molécula pequeña-quinasa mapas para los inhibidores de quinasa 38 [1], y mostrar eficacia terapéutica contra pacientes con CPNM progresivas [2] - [4].
las mutaciones de EGFR activación más comunes son deleción en marco en el exón 19 (delE746-A750) y la mutación puntual sustitución de leucina por arginina en el codón 858 de exon21 (L858R) [5] - [9]. Estas dos mutaciones principales representan el 85-90% de todas las mutaciones y mejorar la eficacia terapéutica de las drogas EGFR [10] - [13]. Además, estas mutaciones activadoras obtenidos adicción a EGFR en células de cáncer de pulmón, lo que resulta en mayor susceptibilidad a EGFR-TKI tales como gefitinib y erlotinib [6], [14] - [16].
Un grave problema con EGFR tratamiento -TKI es la aparición de tumores resistentes a los fármacos. Para la resistencia adquirida, la mutación T790M secundaria en el gen EGFR [16] - [18] o la activación de EGFR-independiente alternativa de vías de señalización del crecimiento celular, incluyendo la activación de c-Met es bien conocido [19], [20]. La pérdida de expresión de PTEN es uno de los mecanismos de resistencia adquiridos, que se demostró mediante el aislamiento de mutantes resistentes a gefitinib a partir de células que albergan PC9 activación de la mutación de EGFR [21], [22]. Además de las causas bien caracterizados de resistencia a los fármacos en los pacientes con cáncer de pulmón, la elucidación de una mayor mecanismo de resistencia adquirida es esencial para el desarrollo de nuevos fármacos EGFR.
En el presente estudio, Erlotinib- y gefitinib se establecieron líneas celulares resistentes a partir de dos líneas celulares de cáncer de pulmón humano, células PC9 que alberga la mutación delE746-A750 y 11-18 células que albergan la mutación L858R, respectivamente. Sorprendentemente, se observó la pérdida parcial o completa de la copia del gen EGFR mutante en el Erlotinib- y líneas celulares resistentes a gefitinib. La importancia clínica de la pérdida de EGFR mutante se discute en relación a su estrecha relación con la adquisición de resistencia a los medicamentos a EGFR-TKI en pacientes con CPNM.
Materiales y Métodos
Cultivos Celulares y reactivos
líneas celulares de cáncer de pulmón humano, PC9, QG56 y 11 a 18 se cultivaron en medio RPMI suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) como se describe anteriormente [14], [21]. PC9 y QG56 fueron amablemente proporcionados por el Dr. Yukito Ichinose (Organización Nacional Centro Hospitalario de Cáncer de Kyushu, Fukuoka, Japón), y fue 11-18 por el Dr. Kazuhiko Nakagawa (Universidad de Kinki, Osaka, Japón). Erlotinib fue proporcionado amablemente por F. Hoffman-La Roche Ltd., gefitinib fue por AstraZeneca Inc. BIBW2992 se adquirió de Selleck Chemicals, SU11274 y wortmanina eran de Calbiochem, LY294002 fue de Señalización Celular Tecnología y lapatinib fue desde Toronto Investigación de Sustancias Químicas. Los anticuerpos anti-HER2 y anti-fosfo-HER2 se adquirieron de Upstate Biotechnology, anti-fosfo-EGFR, anti-EGFR, anti-fosfo-HER3, anti-fosfo-c-Met, anti-fosfo-Akt, anti-Akt, anti-PTEN, anti-fosfo-ERK1 /2, anti-ERK1 /2, y la mutación específica (L858R en el exón 21 y la supresión E746-A750 en 19 exones) anticuerpos eran de Cell Signaling Technology, anti-HER3 y anti-c anticuerpos Met eran de Santa Cruz Biotechnology, anticuerpo anti-α-tubulina fue de Sigma-Aldrich, y el anticuerpo anti-GAPDH era de Trevigen. El DNA complementario (cDNA) para la activación de EGFR y EGFR mutante fueron amablemente proporcionados por el Dr. Willam Pao y el Dr. Nishio. Las células fueron transfectadas con cDNA utilizando Lipofectamine LTX, PLUS reactivo y Opti-MEM (Invitrogen) según las recomendaciones del fabricante. EGF humano recombinante se adquirió de PeproTech. Los ARN pequeños de interferencia (siRNA) que corresponden a HER2 (5'-AAACGUGUCUGUGUUGUAGGUGACC-3 '), HER3 (5'-GGCAGUGUAUAAUCUAUCUCCACUA-3') y PIK3CA (5'-CCCUAUUGGUGGUGUUACUGGAUCAAAU-3 ') se compraron de Invitrogen, y que corresponde a EGFR (5'-GAGGAAAUAUGUACUACGA-3 ') se adquirieron de Sigma-Aldrich. Las células se transfectaron con ARNsi dúplex utilizando Lipofectamine RNAiMAX y Opti-MEM (Invitrogen) según las recomendaciones del fabricante.
Ensayos de citotoxicidad
crecimiento exponencial suspensiones de células se sembraron en cada pocillo, y el día siguiente el se añadieron concentraciones indicadas de los diferentes fármacos. Después de la incubación durante 72 horas, la citotoxicidad se determinó como se describe anteriormente [21].
Western blot
Las células fueron lavadas con PBS enfriado con hielo y se lisaron en Triton X-100 al tampón (50 mmol /L de HEPES, 150 mmol /L de NaCl, 50 mmol /L NaF, 1% de Triton X-100, y 10% de glicerol, que contiene 5 mmol /L EDTA, 1 mmol /L de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 10 mg /ml de aprotinina, 10 mg /ml de leupeptina, y 1 mmol /L ortovanadato de sodio), y las proteínas de los lisados celulares se separaron mediante SDS-PAGE y se transfirieron a membranas Immobilon (Millipore Corp.), como se ha descrito previamente (21). Después de la transferencia, las membranas se incubaron en solución de bloqueo, se sondaron con los diferentes anticuerpos, se lavaron y se visualizaron utilizando rábano picante anticuerpos conjugados con peroxidasa secundarios (GE Healthcare) y reactivo de quimioluminiscencia mejorada (Amersham).
A, Western blot el análisis muestra la expresión de pEGFR, EGFR, pHER2, HER2, pHER3, HER3, PC-Met, c-Met, PTEN, pAkt, Akt, pERK1 /2 y ERK1 /2 proteínas, y α-tubulina como control de carga. B, crecimiento exponencial PC9 y células /ER1 PC9 se expusieron a varias dosis de erlotinib durante 5 horas, y seguido por análisis de transferencia de Western. C, en crecimiento exponencial 11-18, 11-18 /ER1-7 y 11-18 /ER2-1 células fueron expuestas a diferentes dosis de erlotinib durante 5 horas, y seguido por Western blot.
humano RTK arrays
Proteoma Profiler humanos fosfo-RTK de anticuerpos (R & amp; D Systems) se utilizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante
Análisis LUGAR-SSCP
LUGAR. se realizó un análisis -SSCP como se describe anteriormente [23] - [25]. segmentos genómicos que contienen secuencias mutadas fueron amplificados por PCR a partir de ADN extraído de cinco líneas de células (11-18, 11-18 /ER1-7, 11-18 /ER2-1, 11-18 /GEF10-1, y 11-18 /GEF20-1), y las células umbilicales humanos normales endoteliales de la vena (HUVEC), que se adquirieron de Lonza Inc. Walkersville Para analizar la mutación L858R, el exón 21 del gen EGFR se amplificó usando los cebadores (directo: 5 '-ATTCAGGGCATGAACTACTTGG-3', inversa: 5'-GTTACCTCCTTACTTTGCCTC CT-3 ') y Takara ExTaq polimerasa (Takara Bio Inc.). Los archivos de seguimiento obtenidos (.fsa) sirvieron como archivos de entrada para QSNPlite para el análisis [26].
El alelo cuantificación
QSNPlite calcula la relación de pico-altura (R
h) de dos alelos del (de tipo salvaje y mutante alelo) en cada serie de SSCP. Para estimar el número de copias de alelos por célula en cada una de las cinco células de ensayo (véase la subsección anterior), los experimentos de mezclado se realizaron utilizando HUVECs como referencia. En este caso, HUVECs se presume que llevar dos copias del alelo de tipo salvaje por célula. los valores de humedad relativa durante cada una de las cinco células de ensayo se obtuvieron como la media de cinco repeticiones, cada uno de los cuales consisten en células de ensayo por sí solos y mezcla igual-parte de la prueba y la referencia. El número de copias de los dos alelos en las células de ensayo se estimó a partir de la diferencia de R
h valores entre las células de la prueba solo y la mezcla de partes iguales partes, de la siguiente manera: Supongamos que las células de ensayo llevan X de copias por célula de tipo salvaje tipo de copia de EGFR, e y por célula mutante de EGFR. A continuación, el R
h de análisis SSCP para células de ensayo, R
h (prueba), está representado por; R
h (prueba) = M x (X /Y), donde M es una constante de alelo-dependiente que proviene de las diferencias en la eficiencia PCR-amplificación, la eficiencia de etiquetado, y la forma de pico, entre los de tipo salvaje y alelos mutantes. Del mismo modo, R
h de una mezcla igual-parte de células de prueba y el de referencia, R
h (la mezcla), se da en la siguiente ecuación
.
A partir de las dos ecuaciones anteriores, X y Y se obtiene de la siguiente manera.
las ecuaciones anteriores implicar que el número de copia absoluta del alelo mutante en las células de la prueba no puede ser estimado, porque M es desconocido. Sin embargo, los valores relativos de copia números para el mismo alelo mutante en diferentes células de ensayo se pueden estimar, porque M es una constante.
A, transferencias de Western que muestra la expresión de delE746-A750 EGFR y EGFR total en el PC9 y células /ER1 PC9. B, La detección de tipo salvaje y secuencias de mutación utilizando cebadores específicos. PC9 células muestran tanto de tipo salvaje y mutante bandas específicas, mientras que PC9 /ER1, 11-18, y QG56 células muestran la banda sólo de tipo salvaje-específica. Mut, exon19 mutante, y WT, de tipo salvaje exon19. C, el análisis de PCR muestra de heterodúplex (Mut /WT) y homodúplex (WT /WT y Mut /Mut) en células PC9, y sólo homodúplex (WT /WT) en células PC9 /ER1, 11-18 células que albergan la mutación L858R, y QG56 células que albergan EGFR de tipo salvaje.
A, Western blot utilizando anticuerpos específicos L858R y el anticuerpo total de EGFR reconocimiento tanto de tipo salvaje y mutante de EGFR. Los niveles de expresión de EGFR mutante (L858R), total de EGFR, y L858R frente al total de EGFR (L858R /EGFR total) se normalizan sus niveles de expresión en las células 11-18. El análisis de transferencia Western con células endoteliales humanas primarias (HUVEC) muestra la expresión de EGFR total, pero no mutante L858R EGFR. B, secuencias de ADN lee de 15 bases alrededor de la mutación L858R en 11-18, 11-18 /ER1-7, y se comparan 11-18 /ER2-1 células. Las flechas indican la base en 2573. Tenga en cuenta que el nucleótido de 11-18 en 2573 fue de G /T heterocigoto. C, el análisis PLACE-SSCP de muestras de ADN de 11 a 18, 11 a 18 /ER1-7, y 11-18 /ER2-1 células en ausencia o presencia de cantidades iguales de ADN a partir de células endoteliales vasculares humanas (HUVECs) son mostrado. Dos picos muestran de tipo salvaje (WT) y el gen EGFR mutante (Mut) (a). Sobre la base de las ecuaciones que se muestran en Materiales y Métodos, la copia se estiman cambios en el número de los de tipo salvaje y los genes mutantes EGFR (b).
Análisis de PCR
Para analizar la mutación por deleción , el exón 19 del gen EGFR se amplificó usando los siguientes cebadores directos de PCR:
de tipo salvaje específicos, ', TCCCGTCGCTATCAAAACATC-3-5' específica mutante 'tanto de tipo salvaje 5'-CCGTCGCTATCAAGGAATTAAG-3 y mutante tipo, 5'-ATGTGGCACCATCTCACAATTGCC-3 'cebador inverso 5'-CCACACAGCAAAGCAGAAACTCAC-3' y Takara ExTaq polimerasa.
Para analizar la mutación por deleción, exon5 y 8 del gen PTEN se amplificó usando los siguientes cebadores directos de PCR : exon5, 'exon8, 5'-GCAACAGATAACTCAGATTGCC-3' 5'-3-CTCTGGAATCCAGTGTTTCTTT cebador inverso:. exon5, 5'-3 CCAATAAATTCTCAGATCCAGG 'exon8, 5'-GTTCTTCATCAGCTGTACTCCT-3'
Para analizar la mutación por deleción, gen Akt se amplificó usando los cebadores directos siguiente PCR: 'cebador inverso: 5'-GCGCCACAGAGAAGTTGTT-3' 5'-3-GGGTCTGACGGGTAGAGTGT
Selección de pacientes
Hemos seleccionado NSCLC primario. que albergan mutaciones de EGFR, tales como el exón 19 delE746-A750 y el exón 21 L858R mutación puntual de los registros de estado de mutación del EGFR del Departamento de diagnóstico de patología del hospital Universitario de Kurume, de Kurume, Japón. Estos registros de estado de mutación de EGFR habían sido determinadas por secuenciación directa de ADN o ensayo pinza PNA-LNA PCR [27], [28].
Las muestras citológicas de los pacientes de cáncer
Las muestras celulares se obtuvieron a partir pleural efusión (5 casos), los ganglios linfáticos aspiración con aguja fina citología (2 casos), derrame pericárdico (1 caso), y el líquido cefalorraquídeo (3 casos), de acuerdo con un estudio previo [28]. El derrame pleural y líquido cefalorraquídeo se centrifugaron a 1500 rpm durante 10 min, y se retiró el líquido sobrenadante. El sedimento se colocan en un portaobjetos de vidrio, y se fijó en el 95% de etanol durante la noche. Citología por aspiración con aguja de los ganglios linfáticos se realizó utilizando una aguja desechable de calibre 23 unida a una jeringa de plástico de 10 ml, y la diapositiva se fijó durante la noche en 95% de etanol.
La inmunotinción para Activación de mutaciones del EGFR
análisis de inmunotinción se realizó mediante el uso de anticuerpos específicos anti-EGFR delE746-A750 (6B6), el mutante específico de EGFR L858R (43B2), y el total de EGFR (D38B1) anticuerpos (Cell Signaling Technology) como se ha descrito anteriormente [27].
Ética Declaración
El estudio de muestras clínicas fue aprobado por el Comité Ético de la Universidad de Kurume.
a, B, crecimiento exponencial y PC9 células PC9 /ER1 fueron expuestas a diferentes dosis de wortmanina (a) y LY294002 (B) durante 5 horas, y seguido por análisis de transferencia de Western. C. Las células PC9 y PC9 /ER1 fueron tratados con siRNA PIK3CA o scramble (SC) siRNA durante 48 h, y seguidos por Western blot.
Resultados
Establecimiento de Erlotinib- y líneas celulares resistentes a gefitinib y PC9 de 11-18 células
Para aislar líneas celulares resistentes a erlotinib a partir de células que albergan PC9 delE746-A750, y de 11-18 células que albergan L858R, ambas líneas celulares se cultivaron en etapas dosis crecientes de erlotinib de 0,05 a 10 mM, durante aproximadamente 6 meses, como se describe anteriormente [21]. Entonces, las células se seleccionan independientemente de cada línea celular erlotinib resistente de cada plato de plástico, para ampliar una línea clonal erlotinib resistente celular, PC9 /ER1, a partir de células PC9, y dos líneas de células resistentes a erlotinib, 11-18 /ER1- 7 y 11-18 /ER2-1, de 11-18 células, respectivamente. Por otra parte, las líneas celulares resistentes a gefitinib se aislaron también de forma independiente y se expandieron clonalmente (11-18 /11-18 GEF10-1 y /GEF20-1) de 11-18 células. curvas de respuesta a la dosis de líneas celulares resistentes a los medicamentos y su homólogo de los padres al erlotinib o gefitinib mostraron adquisición de resistencia a estos fármacos en varias sublíneas resistentes (Figura S1).
A, crecimiento exponencial PC9 y PC9 células /ER1 eran expuesto a diversas dosis de erlotinib durante 5 h, y seguido por análisis de transferencia Western. B, las células C, D, PC9 y PC9 /ER1 se trataron durante 48 horas con 10 scramble nM (sc) siRNA, 2 nM o 10 nM EGFR siRNA, HER2 siRNA o HER3 siRNA, respectivamente, y seguido por análisis de transferencia de Western.
a, células PC9 /ER1 se trataron con o sin 1 erlotinib mu M, y 5 mM lapatinib durante 5 horas, y seguido análisis de transferencia de Western. B, PC9 células /ER1 fueron tratadas con 10 nM de siRNAs de genes de la familia Scrumble y EGFR, y se expusieron a erlotinib (1 M) o BIBW2992 (1 M) durante 5 horas, y seguido de Western blot.
a, células PC9 /ER1 se transfectaron con del EGFR (E746-A750) ADNc, y seguido de incubación durante varios días. El análisis de transferencia Western se realizó con anticuerpos que reconocen del EGFR y EGFR total. B, la dosis de las curvas de respuesta de transfectantes mutante maqueta y activado EGFR de ADNc de PC9 /ER1 se determinó por ensayo de citotoxicidad. Cada valor es la media de platos triplicados ± SD. C, 11-18 /ER1-7 células fueron transfectadas con L858R EGFR cDNA, y seguido por análisis de transferencia de Western con un anticuerpo específico de EGFR L858R. D, las curvas de respuesta a la dosis de mutantes transfectantes maqueta y activados EGFR cDNA de 11-18 /ER1-7. Cada valor es la media de platos triplicados ± SD.
9 PC-células /ER1 mostraron resistencia a 160-250 veces superior al erlotinib y gefitinib, 5 veces mayor resistencia a lapatinib como máximo, y alrededor de 2.000 veces mayor resistencia a BIBW2992 (Tabla 1). 11-18 /ER1-7, 11-18 /ER2-1, 11-18 /GEF10-1 y 11-18 /GEF20-1 células mostraron 20-110 veces la resistencia más alta al erlotinib y gefitinib y 7 veces más alta resistencia a la lapatinib y BIBW2992 como máximo (Tabla 1). Por otra parte, todas estas células resistentes mostraron sensibilidades similares a SU11274 y cisplatino como sus homólogos parentales (Tabla 1).
La expresión de los receptores del factor de crecimiento y su estado de Activación en líneas celulares resistentes a Erlotinib Establecida desde PC9 las células y 11-18
Western blot mostró la diferencia más notable en la fosforilación de EGFR y sin cambio marcado en estado de fosforilación de HER3, c-Met, Akt y ERK1 /2 entre el PC9 y células /ER1 PC9. Por otra parte, relativamente menor fosforilación de EGFR se observó en 11-18 /11-18 ER1-7 y /ER2-1 células que 11-18 células (Figura 1A).
siguiente estado de activación en comparación de múltiples receptores de tirosina quinasas, incluyendo c-Met, Axl, PDGFR y IGF1R que se sobreexpresa en tumores con mutaciones de EGFR entre sublíneas resistentes a erlotinib y sus homólogos mediante el uso de la tirosina quinasa (RTK) array receptor fosfo [29]. Sin embargo, no hubo diferencia en el estado de activación de estos receptores del factor de crecimiento incluyendo c-Met entre las líneas celulares sensibles y resistentes a fármacos (Figura S2).
Anticuerpo
Total EGFR manchado las cuatro muestras histológicas y citológicas. anticuerpo A750 anti-delE746 manchada sólo las células de cáncer con la mutación delE746-A750 (A, caso 1) (ver Tabla 2), y el anticuerpo de EGFR L858R manchada solamente las células cancerosas con las mutaciones L858R (B, caso 9) en tanto histológica y muestras citológicas. Sin tinción fue evidente tanto por los anticuerpos EGFR delE746-A750 y EGFR L858R en las células cancerosas sin las mutaciones activadoras del EGFR en muestras citológicas (C: Caso 6 y D: 11 casos)
Akt. la fosforilación es No bloqueado por erlotinib en erlotinib resistentes a las líneas celulares
a continuación examinó el efecto de erlotinib en la fosforilación de EGFR, Akt y ERK1 /2 en líneas celulares resistentes a erlotinib y sus homólogos parentales (Figura 1B y 1C). En las células PC9, EGFR, Akt y ERK1 /2 fosforilación fueron todos inhibió de una manera dependiente de la dosis por erlotinib. Sin embargo no había casi ninguna inhibición de la fosforilación de Akt en células /ER1 PC9 por erlotinib, pero ERK1 /2 fosforilación se inhibió de manera similar a las células PC9 (Figura 1B). Por otra parte, se encontró que la fosforilación de EGFR a ser suprimida de forma equivalente en 11-18, 11-18 /ER1-7, y 11-18 /ER2-1 células por erlotinib. Sin embargo, en comparación con 11-18 células, la fosforilación de Akt en 11-18 /11-18 ER1-7 y /ER2-1 células no se inhibió por erlotinib. Por el contrario, ERK1 /2 fosforilación era altamente sensibles a erlotinib en todo 11-18, 11-18 /ER1-7 y 11-18 /ER2-1 células (Figura 1C). Adquisición de erlotinib resistencia confiere así PI3K constitutiva de fosforilación /Akt en células resistentes de PC9 y 11-18 células.
pérdida completa de la Activación del mutante de EGFR (delE746-A750) de genes en células PC9 /ER1 Erlotinib resistentes
a continuación, el próximo examinado el estado de EGFR en células /ER1 PC9. El análisis de transferencia de Western usando anti-delE746-A750, L858R, y los anticuerpos totales EGFR mostró la pérdida completa de la expresión de EGFR mutante de proteínas en células PC9 /ER1 (Figura 2A). A continuación, se comparó el perfil genético de tipo salvaje y mutante de EGFR entre PC9 células PC9 y /ER1. El análisis de la secuencia directa del exón 19 del gen EGFR reveló la pérdida completa de sólo la secuencia mutante en células /ER1 PC9 (datos no mostrados). A continuación, el análisis de PCR se realizó en el exón 19 del gen EGFR mediante el uso de tipo salvaje y mutación cebadores específicos. PC9 células contenían ambas secuencias de tipo salvaje y la supresión de mutación, lo que indica alelos heterocigotos para la de tipo salvaje y mutante de EGFR, mientras que sólo había una secuencia de tipo salvaje en células PC9 /ER1 (Figura 2B). Exon 19 del gen EGFR se amplifica aún más, y el análisis de estas muestras de ADN en el gel mostró consistentemente la presencia de sólo la secuencia de tipo salvaje en el exón 19 del gen EGFR en células PC9 /ER1, aunque las células PC9 contenían tanto el eliminación y la secuencia de tipo salvaje (Figura 2C). En su conjunto, las células /ER1 PC9 mostraron una pérdida completa del gen EGFR mutante por la adquisición de resistencia a los medicamentos al erlotinib.
La proliferación celular y la supervivencia de las células cancerosas de pulmón humano que albergan activan el EGFR mutante (PC9 y 11-18 células ) dependen estrechamente de EGFR impulsada por PI3K /Akt, y esta proliferación /supervivencia es altamente susceptible a erlotinib y otra EGFR TKIs. En primer lugar, hay una pérdida parcial o completa de mEGFR alelo del gen en líneas celulares resistentes a los medicamentos, y luego ganancia de adicción a HER2 /HER3 y PI3K /Akt señalización (células PC9 /ER1). Sin embargo, se requiere un análisis más definitivo sobre las líneas celulares resistentes de 11-18 11-18 porque las líneas celulares resistentes sólo muestran la pérdida parcial de mEGFR.
Pérdida parcial de la Activación del mutante de EGFR (L858R) en el gen Erlotinib- o gefitinib resistentes a las líneas celulares de 11-18
Asimismo, comparó los niveles de expresión de EGFR de tipo salvaje y mutante de EGFR por un anticuerpo específico que reconoce la L858R EGFR mutante por Western blot. En comparación con las células parentales 11-18, la expresión de la proteína EGFR mutante L858R fue relativamente menor en comparación con los niveles de EGFR celular total (Figura 3A).
A continuación examinó si la activación del gen EGFR mutante en 11-18 /ER1- 7 y 11 a 18 /ER2-1 células se vio afectada por la adquisición de resistencia erlotinib o no. análisis de la secuencia de ADN mostró la presencia de la mutación (L858R) tanto en las células parentales y resistentes (Figura 3B, las flechas indican el nucleótido 2573), aunque la alternancia de las alturas de los picos en el nucleótido 2573 era evidente. relación alterada de tipo salvaje a mutante del gen EGFR también se observó por análisis SSCP-LUGAR [23], [24], como se ejemplifica en la figura 3C. Este ensayo mostró dos picos independientes, una para de tipo salvaje y otro para el gen de EGFR mutante, tanto en 11-18 y las células resistentes a erlotinib. Sin embargo, la relación de la altura del pico (Rh) de las dos líneas celulares resistentes era claramente diferente. Con la adopción de la estrategia de mezcla, es decir, la mezcla de los ADN de HUVECs llevar a 2 copias de gen de EGFR de tipo salvaje con el de las células resistentes, el cambio en el número de copias del alelo podría ser cuantificada como se describe en Materiales y Métodos. Los resultados indicaron una disminución del 50% del gen EGFR mutante sin aparente cambio de la de tipo salvaje de copias del gen EGFR (Figura 3C).
También se examinó si la selección por resistencia a los medicamentos a gefitinib también indujo cambios similares de disminución de la expresión del gen EGFR activación. Dos líneas celulares gefitinib resistente, 11-18 /11-18 GEF10-1 y /GEF20-1, mostraron un aumento de expresión de la proteína EGFR con relativamente disminución de la expresión de HER2 y pHER2 en comparación con sus 11-18 células parentales (Figura S3A). En comparación con las células parentales 11-18, la fosforilación de Akt en 11-18 /11-18 GEF10-1 y /GEF20-1 no fue afectada por gefitinib cuando la fosforilación de EGFR y ERK1 /2 se inhibió de manera similar por gefitinib (Figura S3B) . El análisis de transferencia Western con el anticuerpo anti-L858R mostró disminución de la expresión del EGFR mutante y la expresión similar de la EGFR totales en dos líneas celulares resistentes en comparación con 11-18 células (Figura S3C). A continuación, se realizó un análisis de la secuencia de ADN y encontramos un pico de altura alterna en el nucleótido 2573 en las células resistentes a gefitinib (Figura S3D). análisis PLACE-SSCP también reveló una disminución de copias del gen EGFR mutante sin cambios aparentes en de tipo salvaje de copias del gen EGFR, y el análisis cuantitativo que indica una disminución del 50% del gen EGFR mutante en células gefitinib resistentes (Figura S3E). A partir de estos análisis de Erlotinib- o gefitinib resistente a líneas de células, adquisición de resistencia a los fármacos puede ser mediada a través de una disminución de copias del gen EGFR mutante.
Desmontables de HER2 o HER3 sensibiliza al Constitutiva de activación de Akt a Erlotinib en PC9 /las células ER1
hubo una pérdida casi completa del gen EGFR mutante en PC9 /ER1 mientras que sólo hubo una pérdida parcial del gen EGFR mutante en líneas celulares resistentes a erlotinib derivado de 11-18. Asimismo, analizaron más detalladamente cualquier mecanismo subyacente adquisición de resistencia a erlotinib en PC9 /ER1. Se examinó el efecto de los inhibidores de PI3K, wortmanina y LY294002 sobre la activación de Akt en células PC9 y PC9 /ER1 (Figura 4A y 4B). Ambos inhibidores de PI3K inhibidos de manera similar la fosforilación de Akt, lo que indica que activado Akt es igualmente susceptible a ambos inhibidores en PC9 /ER1 y células PC9. También confirmó la supresión específica de la activación de Akt en células tanto PC9 /ER1 PC9 y cuando son tratados con PIK3CA siRNA (Figura 4C). Además, el análisis de la secuencia reveló que no había ninguna mutación en los puntos calientes de PIK3CA, PTEN y el gen Akt (datos no mostrados). La activación de Akt constitutiva en PC9 /ER1 no parece ser debido a PI3K alterado /Akt vía de sí mismo.
finalmente Examinamos qué moléculas entre EGFR, HER2 o HER3 podría ser responsable de la activación de Akt constitutiva en erlotinib resistente células /ER1 PC9. Encontramos fosforilación de HER3 no fue suprimido por erlotinib en PC9 /ER1 comparación con PC9 (Figura 5A). A continuación, examinó si desmontables de EGFR, HER2 o HER3 por sus afines siRNAs podría modular la activación de las proteínas de la familia de Akt y EGFR. Desmontables de EGFR resultó en marcadamente disminución de la activación de Akt sólo en las células PC9 pero no en PC9 /ER (Figura 5B). Por otro lado, desmontables de HER3 podría suprimir la activación de Akt en tanto PC9 y PC9 /ER (Figura 5D). Además activación de HER3 fue claramente suprimida por HER2 caída sólo en PC9 /ER (Figura 5B). Estos resultados sugieren que HER3 junto con la señalización de HER2 son responsables de la activación constitutiva de PI3K /Akt en la resistencia adquirida a erlotinib en PC9 /ER.
Además, examinó si lapatinib, un inhibidor dual de quinasa de EGFR y HER2, podría suprimir la activación de Akt en PC9 /ER1. El tratamiento con lapatinib inhibe la fosforilación de Akt y HER3 mientras erlotinib no lo hizo (Figura 6A). A continuación examinó el efecto de erlotinib o un inhibidor de quinasa pan-tirosina de toda la familia EGFR, BIBW2992 [30], sobre la fosforilación de Akt en PC9 /ER1 cuando se volvían cada EGFR, HER2 o HER3 (Figura 6B). La fosforilación de HER2, HER3 y Akt fue suprimida por todo BIBW2992 solo. Por otra parte, la fosforilación de Akt se inhibió por erlotinib, ya sea con HER2 o HER3 desmontables. Por otra parte, HER2 caída dio lugar a una marcada inhibición de la fosforilación de HER3, lo que sugiere que las células PC9 /ER1 ganan adicción a HER2 /HER3 señalización (Figura 6B).
Finalmente examinamos si la expresión de la activación de EGFR mutante podría restaurar la sensibilidad a los fármacos a erlotinib en líneas celulares resistentes a los fármacos, PC9 /ER1 y 11-18 /ER1-7. La transfección transitoria de del (E746-A750) cDNA EGFR inducida mayor expresión de EGFR mutante activado en PC9 /ER1 (Figura 7A). La sobreexpresión de la expresión del (E746-A750) EGFR cDNA se sobrepuso a la resistencia a los fármacos erlotinib en PC9 /ER1 (Figura 7B). Por otra parte, la transfección de otro mutante activado L858R EGFR cDNA también indujo la expresión potenciada (Figura 7C) y restaura la sensibilidad de drogas a erlotinib en 11-18 /ER1-7 células (Figura 7D).
Pérdida de Activación del EGFR mutante en refractarios de células no pequeñas de cáncer de pulmón
Figura 8 muestra imágenes representativas para IHC de tipo salvaje, delE746-A750, y la expresión de EGFR L858R en tejidos de cáncer de pulmón primarios (Figura 8, cada panel superior), y también el cáncer células de efusión pleural o líquido cefalorraquídeo en los pacientes recurrentes después del tratamiento con gefitinib (Figura 8, cada panel inferior). Como se muestra en la Tabla 2, de los 11 pacientes que recibieron gefitinib primera después de la cirugía de pulmón y luego mostró recurrencia, 8 pacientes tenían la mutación delE746-A750 y 3 tenían la mutación L858R en sus tumores primarios de pulmón. Cuatro tenían la mutación T790M en la difusión o muestras citológicas metastásicos. De 11 pacientes refractarios, 2 de los 8 casos que había albergado el delE746-A750 mostraron pérdida de la mutación de EGFR activación, y 1 de los 3 casos que había albergado L858R mostró la pérdida de la mutación de activación (Tabla 2). En un caso (caso 6), se observaron tanto T790M mutación y la expresión de EGFR de tipo salvaje. No hubo desacuerdo entre la expresión de anticuerpos-EGFR mutación específica y detección de mutaciones de EGFR mediante análisis de secuencias utilizando el ensayo pinza PNA-LNA PCR en todas las muestras analizadas en este estudio.
Discusión
Activar mutaciones de EGFR, tales como delE746-A750 y L858R, hacen que las células de cáncer de pulmón EGFR estrechamente par con la proliferación celular o la supervivencia [5], [6], [15].