Extracto
ZBRK1, una proteína con dedos de zinc que interactúa con el cáncer de mama 1 (BRCA1) y KRAB -ZFP asociada a la proteína 1 (KAP1), se ha sugerido para servir como un supresor de tumores a través de la represión de la metástasis tumoral /invasión. Hasta la fecha, los mecanismos moleculares detallados de cómo los genes BRCA1 y KAP1 participan en la transcripción mediada por ZBRK1 la represión, la metástasis y la invasión, así como la relevancia clínica asociada siguen sin estar claros. En este estudio, hemos demostrado que tanto el N- y C-terminales de los dominios ZBRK1 son importantes para la inhibición de la proliferación celular y el crecimiento independiente de anclaje en el cáncer cervical. Específicamente, el dominio KRAB N-terminal de ZBRK1 muestra un papel más importante en la inhibición de la metástasis y la invasión a través de la modulación de la función KAP1 de una manera transcripcionalmente dependiente. La pérdida de ZBRK1 resultado en un aumento de la expresión KAP1, que aumentó la migración y la invasión de células de cáncer cervical tanto en el
in vitro
y
in vivo
. Además, se observó una correlación inversa de los niveles de expresión entre ZBRK1 y KAP1 siguiente progresión tumoral de carcinoma in situ a los especímenes invasivos /metastáticos cáncer cervical. Tomados en conjunto, los resultados actuales indican que una pérdida de ZBRK1 contribuye al aumento de expresión de KAP1, potenciando su papel para mejorar la metástasis y la invasión
Visto:. Lin LF, Li CF, Wang WJ, Yang WM, Wang DD-H, Chang WC, et al. (2013) Pérdida de ZBRK1 contribuye al aumento de KAP1 y promueve KAP1 mediada por metástasis y la invasión en el cáncer cervical. PLoS ONE 8 (8): e73033. doi: 10.1371 /journal.pone.0073033
Editor: Yves St-Pierre, INRS, Canada |
Recibido: 3 Abril de 2013; Aceptado: July 16, 2013; Publicado: 22 Agosto 2013
Derechos de Autor © 2013 Lin et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por NSC subvención 101-2320-B-006-020-MY3 y la Universidad Nacional Cheng Kung subvención hito C007 (Taiwán). Fondo para la publicación de Acceso Abierto fue proporcionado por la concesión NSC 101-2320-B-006-020-MY3. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
La malignidad del cáncer se debe a su capacidad de invadir y metastatizar tejidos vecinos y distal, lo que resulta en fallos orgánicos locales y sistémicos. La metástasis es un proceso complejo que requiere a menudo las células tumorales de romper con el tumor canceroso, invadir a través de la matriz extracelular, y someterse a intravasación en el torrente sanguíneo o el sistema circulatorio linfático, seguido de la extravasación y la entrada a órganos distantes, lo que permite el crecimiento de micrometástasis [1]. Muchos aspectos de este complicado proceso son actualmente desconocidos, tales como las expresiones de genes de los supresores metastásicas bien caracterizados.
Más de 700 proteínas con dedos de zinc han sido identificados en los seres humanos. proteínas dedo de zinc se unen a secuencias específicas de ADN y cambiar o eliminar genes. Cerca de un tercio de las proteínas dedo de zinc de mamíferos tiene un motivo muy conservadas cuadro asociado-Kruppel (KRAB). Las funciones de las proteínas dedo de zinc-KRAB difieren significativamente entre especies en la regulación de la expresión de genes, especialmente para los que participan en las actividades de represión transcripcional. ZBRK1 humana es un represor transcripcional que contiene un dominio N-terminal KRAB, ocho dedos de zinc C2H2 consecutivos, y un dominio de represión de la transcripción C-terminal BRCA1-dependiente (CTRD) [2]. ZBKR1 tiene el potencial para regular diferentes genes aguas abajo mediante la interacción con un grupo diverso de proteínas. Por ejemplo, se informó de que ZBRK1 puede inhibir la expresión del gen 1 angiopoyetina través de la interacción con corepressors transcripcionales, CtIP y BRCA1 [3]. Además, KAP1 interactúa con ZBRK1 a través del dominio KRAB N-terminal de ZBRK1. ZBRK1 y KAP1 también contribuyen a la eficacia de la replicación a través de oriLyt BBLF2 /3 interacción [4]. Hasta la fecha, los mecanismos detallados y funciones celulares relacionados de las interacciones del ZBRK1 con estas proteínas permanecen sin explorar
La secuencia de aminoácidos primaria de KAP1 contiene varios motivos conservados:. Un dedo RING, B-boxes, una espiral de la bobina región, un dedo PHD y un dominio de bromo. El dedo RING, B-cajas, y enrollado de la bobina se denominan colectivamente el dominio RBCC, que se ha demostrado que es suficiente para la homo-oligomerización y la represión KRAB módulo de unión a [5,6]. Varios estudios indican que KAP1 une a las proteínas que contiene KRAB-y facilita la represión transcripcional mediada por proteínas que contiene KRAB. Por otra parte, KAP1 también funciona como un andamio molecular para regular la estructura de la cromatina, mediada a través de la interacción con Mi-2a, un componente de la desacetilasa NuRD histona complejo [7], metiltransferasa SETDB1 [8] o la proteína heterocromatina 1 (HP1) miembros de la familia [9 , 10]. Recientemente, se informó de KAP1 para contribuir a la inhibición de la apoptosis mediada por E2F1-[11] y se correlaciona estrechamente con mal pronóstico en el cáncer gástrico [12]. Además, KAP1 se describió como que juega un papel en la proteína de fibroblastos específico 1 mediada por epitelio-mesenquimal transición [13]. A pesar de estos esfuerzos recientes en la aclaración de sus funciones celulares y los mecanismos moleculares asociados, los papeles de KAP1 en la tumorigénesis siguen siendo en gran parte desconocido.
Nuestro estudio anterior sugiere que ZBRK1 actúa como un supresor de metástasis y que la pérdida de ZBRK1 aumenta la transcripción MMP9 en el cáncer cervical [14]. En el presente estudio, encontramos que la expresión ectópica de KAP1 en células HeLa aumenta significativamente la migración /invasión celular. Este estudio proporciona la primera evidencia directa de demostrar que KAP1 tiene la capacidad para promover la metástasis tumoral, tanto
in vitro
y
in vivo
. Además, ZBRK1 suprime este proceso mediante la contratación de BRCA1 través de la interacción C-terminal y la inhibición de la actividad transcripcional KAP1. Además, en las muestras de cáncer de cuello uterino que hemos validado, los niveles de expresión de ZBRK1 inversamente correlacionada con la pérdida de KAP1. En conjunto, estos resultados sugieren que ZBRK1 sirve para inhibir la metástasis tumoral y la invasión del cáncer cervical mediante la modulación de KAP1.
Resultados
KAP1 y BRCA1 interactuaron con los dominios N- y C-terminales, respectivamente , de ZBRK1
Anteriormente, hemos encontrado que ZBRK1 actúa como un supresor de tumores, la inhibición de la proliferación, migración, invasión y metástasis de células de cáncer [14]. Como se mencionó anteriormente, KAP1 y BRCA1 interactúan con los dominios N- y C-terminales, respectivamente [15,16], de ZBRK1. Estábamos especialmente interesados en la comprensión de las contribuciones funcionales de estas interacciones a la supresión de tumores. Se evaluó primero la especificidad de unión de KAP1 y BRCA1 de tipo salvaje o ZBRK1 truncado utilizando un ensayo de inmunoprecipitación. El resultado mostró que KAP1 y BRCA1 de hecho específicamente interactúan con los dominios N- y C-terminales, respectivamente, de ZBRK1 en células HeLa (Figura S1 y la Figura 1a).
A, La interacción in vivo entre ZBRK1 y KAP1. Los lisados de células HeLa que expresan de forma estable EGFP (G), EGFP-ZBRK1 (GZB) o ZBRK1s truncadas EGFP-fusionado (GZBDK y GZBDZ) se inmunoprecipitaron usando un anticuerpo anti-GFP Ab (Roche). Las proteínas inmunoprecipitadas se eluyeron por primera ebullición en tampón de muestra SDS y después separar en un gel de SDS-PAGE 10%, seguido por análisis de inmunotransferencia con un anticuerpo anti-KAP1 (Bethyl Laboratories) para detectar KAP1 o con un anticuerpo anti-GFP Ab para detectar GFP . B, truncados N- o C-terminal de ZBRK1 pierde la capacidad de inhibir el crecimiento.
la izquierda, se sembraron números iguales de células HeLa estables que expresan EGFP (G), EGFP-ZBRK1 (GZB) o ZBRK1s truncadas EGFP-fusionado (GZBDK y GZBDZ) para evaluar el crecimiento por tinción con cristal violeta. Se determinó el número de células viables en los tiempos indicados.
derecho, la expresión de ZBRK1 y sus mutantes en células HeLa se analizó por Western blot. C, truncados N- o C-terminal de ZBRK1 pierde la capacidad de inhibir la proliferación. Un ensayo de formación de foco se realizó utilizando diversas líneas celulares HeLa estables.
Columnas
, se centran números;
bares, media ± DE. **
p Hotel & lt; 0,01 en comparación con las células control (G) del estudiante utilizando
t-test
;
NS
, no tiene importancia en comparación con las células control (G).
Tanto el N- y C-terminales de ZBRK1 proliferación de células cancerosas suprimida, pero sólo el N-terminal de ZBRK1 celular inhibida Migración
Para hacer frente a las funciones celulares de ZBRK1, hemos creado varias líneas estables de células HeLa ectópica expresan EGFP (G), fusionado-EGFP de larga duración ZBRK1 (GZB), o una deleción ZBRK1 EGFP fusionada de la región N-terminal KAP1 vinculante (GZBDK) o la región de unión BRCA1-(GZBDZ) (Figura 1B, panel derecho) C-terminal. Un aumento en ZBRK1 resultados en la inhibición de la proliferación [14], por lo que evalúa primero la eficacia de inhibición del crecimiento de estas líneas celulares HeLa estables. En comparación con las células GZB expresan, tanto GZBDK- y células perdidas inhibición del crecimiento GZBDZ-expresión. El resultado sugiere que tanto KAP1 y las interacciones BRCA1 fuera necesario para la inhibición del crecimiento mediada por ZBRK1 (Figura 1B, panel izquierdo). Las mismas líneas celulares estables se utilizaron para evaluar adicionalmente los efectos de la KRAB y dominios CTRD de ZBRK1 sobre la proliferación celular utilizando un ensayo de formación de foco. Similar a la observación en el panel derecho de la Figura 1B, GZBDK y GZBDZ que expresan las células HeLa no tienen ningún efecto sobre la proliferación celular en comparación con líneas celulares que expresan ZBRK1-(Figura 1C).
En la herida de ensayo de curación, la Las células que expresan ectópica GZB aparece un efecto de la migración atenuada, que era consistente con nuestro informe anterior. En particular, las células que expresan GZBDK no tuvieron ningún efecto sobre la migración celular, mientras que las células que expresan GZBDZ habían atenuado moderadamente la migración de células (Figura 2A). Se observó un fenómeno similar en un ensayo de migración de células cámara de Boyden (Figura 2B). Por otra parte, nuestro estudio anterior sugiere que ZBRK1 puede reprimir la capacidad de invasión de las células del cáncer [14], lo que nos llevó a evaluar las contribuciones de las regiones N- y C-terminales de ZBRK1 a la celda invasión. Cuando se evaluó el efecto invasión usando cámaras de Boyden contienen Matrigel, las células que expresan GZBDK-perdieron el efecto (Figura 2C). Este hallazgo sugiere que el dominio KRAB N-terminal de ZBRK1 es crítica para la inhibición de la migración celular y la invasión.
A,
la izquierda, un ensayo de migración de cicatrización de heridas se realizó con células HeLa que expresa EGFP (G), EGFP-ZBRK1 (GZB) o ZBRK1 mutado (GZBDK o GZBDZ). Imágenes representativas de la herida de sellado se recogieron en el día de la laceración y el día después de la herida cero.
derecha, el nivel de la migración celular en el rasguño de la herida se cuantificó como el porcentaje de curación de heridas.
Columnas
, promedio de tres mediciones independientes;
bares, media ± DE. * P & lt; 0,05. B, las células HeLa que expresan GZBDK alivia la capacidad inhibidora de la migración celular. Las células fueron sembradas en transwells, y se determinó el nivel de la migración celular. C, las células HeLa que expresan GZBDK alivia el efecto inhibidor de invasión celular. Las células se sembraron en una capa de gel matriz BD, y el nivel de invasión de células se determinó utilizando CyQUANT NF colorante (Invitrogen), como se describe en los Materiales y Métodos. La trama muestra los resultados estadísticos de los tres experimentos independientes.
Barras
, media ± DE. * P & lt;. 0,05
KAP1 promueve la migración celular y la invasión
Como se muestra en la Figura 2C, las células que expresan ZBRK1 con una deleción del dominio KRAB pierden la capacidad de suprimir la proliferación celular, la migración y la invasión. Este hallazgo sugirió que KAP1 puede ser importante para la proliferación, la migración y la invasión de las células cancerosas. Para probar esta hipótesis, se generaron células HeLa que expresan ectópica KAP1 (G-KAP1) (Figura 3A, panel derecho) y se realizó la proliferación celular, la curación de heridas y ensayos de células de migración /invasión. Como se demuestra por el ensayo de proliferación celular, las células HeLa que expresan ectópica KAP1 mostraron un ligero incremento en su tasa de crecimiento de una manera dependiente de la dosis (Figura 3A, panel izquierdo; comparar la expresión KAP1 entre clones 1 y 3).
in vitro
la migración celular y la invasión ensayos En demostrado que las células que expresan ectópica KAP1 tienen un efecto curativo más conveniente y la actividad invasión más alta que la línea celular de control (Figura 3B-D). Estos resultados sugieren que KAP1 puede promover la migración de células de cáncer y la invasión.
A,
derecho
, células HeLa fueron transfectadas establemente con EGFP-KAP1 construcciones de expresión. KAP1 ARNm y los niveles de proteína se evaluaron mediante transcripción inversa-PCR y Western Blot.
izquierda, la expresión KAP1 apenas induce la proliferación celular. Números iguales de EGFP (G) o EGFP-KAP1 (G-KAP1#1 o G-KAP1#3) las células HeLa se sembraron, y se determinó el número de células viables a los tiempos indicados. B, El ensayo de migración de cicatrización de heridas se realizó con el control y células que expresan KAP1-estables. La brecha libre de células (es decir, la "herida") se ha creado usando un inserto de cultivo. Imágenes representativas de sellado de heridas se recogieron el día 0 y el día siguiente (día 1).
derecha, el nivel de la migración celular en el hueco cuantificado como el porcentaje de sellado de la herida.
Columnas
, el promedio de tres mediciones independientes;
bares, media ± DE. ** P & lt; 0,01; * P & lt; 0,05. C, KAP1 mejora la migración de las células cancerosas. Las células se sembraron en una cámara transwell, y se determinó el nivel de la migración celular. D, KAP1 aumenta la invasividad de las células cancerosas. Las células se sembraron en una capa de gel matriz BD, y el nivel de invasión de células se determinó usando el tinte CyQUANT NF, como se describe en los Materiales y Métodos.
Columnas
, el promedio de tres mediciones independientes;
bares, media ± DE. ** P & lt; 0,01; * P & lt;. 0,05
ZBRK1 reprime KAP1 transcripción a través de la supresión de su actividad promotora
Varios informes sugirieron que ZBRK1 regula negativamente la transcripción de la
GADD45
,
ANG1
y
p21
genes [3,15,17]. Curiosamente, se observó que la expresión KAP1 se atenuó en células que expresan ZBRK1 ectópico (Figura 4A, panel izquierdo). Como una confirmación adicional, la atenuación de ZBRK1 resultó en un aumento en KAP1 ARNm de estado estacionario y los niveles de proteína (Figura 4A, panel derecho). Para evaluar si el cambio se debió a la inhibición de la actividad promotora KAP1 o regulación postranscripcional, se analizó la tasa de rotación KAP1 ARNm después del tratamiento con actinomicina D, un inhibidor de la transcripción. La vida media medida de KAP1 mRNA fue de aproximadamente 2 h, y no hubo una diferencia clara observada entre la línea parental y las células que expresan ZBRK1 ectópico (Figura S2). El resultado indicó que la reducción de KAP1 mRNA en respuesta a la expresión ectópica de ZBRK1 era probablemente debido a la represión de la actividad del promotor KAP1, pero no a través de la regulación postranscripcional.
A,
A la izquierda, ZBRK1 inhibe transcripciones KAP1 en células HeLa. El ARN total y lisados de EGFP (G) y las células EGFP-ZBRK1 (GZB) HeLa se recogieron por RT-PCR y análisis de transferencia Western.
Derecho
, el ZBRK1 la pérdida de la función de mejora transcripciones KAP1. ZBRK1 células que expresan estables fueron incubadas con ARNhc lentiviral contra ZBRK1 o el control. El RNA total de las células infectadas se analizaron mediante RT-PCR. GAPDH humano sirvió como control. B, ZBRK1 inhibe el reportero KAP1.
Top of, representación esquemática de las construcciones de reportero de luciferasa que contienen el promotor KAP1 con el tipo salvaje o mutantes motivos de unión ZBRK1-. Las secuencias del tipo salvaje (WT) y mutante (mut) ZBRK1-unión se muestran motivos. Las células HeLa se co-transfectadas EGFP-ZBRK1 (GZB) con el reportero del promotor pGL3 (pGL3p), de tipo salvaje o mutantes KAP1 vinculante motivo reporteros KAP1 ZBRK1. Los lisados de los transfectantes se recogieron después de 12 h para el ensayo de luciferasa. El pliegue del cambio relativo en la actividad de luciferasa de las diversas construcciones de reportero KAP1 se muestra después de la normalización con el reportero KAP1 de tipo salvaje.
Barras
, media ± DE. C, ZBRK1 se une al promotor KAP1
in vivo
. Los cromatinas reticulados formaldehído esquilada, extraídos a partir de células HeLa que expresan de forma estable EGFP (G) o EGFP-ZBRK1 (GZB), se inmunoprecipitaron con los anticuerpos indicados: IgG de control (GG), ZBRK1 (-Z) y GFP (-G) . Se llevó a cabo la amplificación por PCR con cebadores específicos dirigidos a la
KAP1
promotor, tal como se describe en los Materiales y Métodos. La figura representa los productos de PCR obtenidos usando los cebadores específicos para la región promotora KAP1, como se muestra en el panel superior. D, España
A la izquierda, el mutante ZBRK1 C-terminal suprimido invierte el efecto supresor sobre transcripciones KAP1. Los niveles de expresión de KAP1 en las células HeLa de forma exógena que expresan EGFP (G), EGFP-ZBRK1 (GZB), EGFP-ZBRK1 con el dominio KRAB deleción (GDK), EGFP-ZBRK1 con CTRD eliminación dominio (GDZ) o EGFP-ZBRK1 tanto con KRAB y CTRD deleción (GDKZ). Un ensayo de RT-PCR se llevó a cabo con cebadores específicos de genes indicados.
derecho, BRCA1 es importante para la inhibición mediada por ZBRK1 de la actividad de reportero KAP1. Las células HeLa se co-transfectadas con el reportero KAP1 y EGFP (G), GZB, GDK, GDZ, GDKZ, KAP1 o vectores de expresión de BRCA1. Los lisados de los transfectantes fueron cosechadas después de 12 h de transfección para el ensayo de luciferasa. Los datos mostrados son la media ± SD.
Para evaluar si ZBRK1 suprime la expresión KAP1 través de la regulación de la región promotora del gen KAP1, la región promotora, -690-33, de la KAP1 gen fue clonado en el vector básico pGL-2 para los ensayos de reportero. El resultado de los ensayos de reportero demostró que ZBRK1 puede reprimir la actividad del indicador KAP1 (Figura 4B). Es importante destacar que la sobreexpresión de ZBRK1 no pudo reprimir la actividad de la luciferasa del reportero KAP1 cuando el motivo de unión ZBRK1-putativo fue mutado (Figura 4B). A continuación realizó un ensayo de unión
in vivo
ADN para determinar si ZBRK1 puede unirse directamente al promotor KAP1. Un chip de ensayo se realizó utilizando muestras de extractos de entrecruzamiento de estable EGFP (G) y las células EGFP-ZBRK1 (GZB) HeLa para detectar la unión de ZBRK1 endógeno y ectópica expresó EGFP-ZBRK1 a la región promotora del gen KAP1. El resultado del ensayo ChIP-PCR mostró que ZBRK1 puede unirse directamente a la región que contiene el motivo de unión ZBRK1-putativo sobre el promotor KAP1 (Figura 4C). Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que ZBRK1 puede reprimir la transcripción KAP1 a través de la unión directa al promotor KAP1.
ZBRK1 puede interactuar con KAP1 y BRCA1 a través de la KRAB y dominios CTRD, respectivamente, y sirve como un represor transcripcional. Se evaluaron las contribuciones de KAP1 y BRCA1 a mediada por la represión de genes ZBRK1 KAP1. El resultado de un ensayo de RT-PCR mostró que los niveles de transcripción KAP1 se atenuaron en el ZBRK1 (GZB) y ZBRK1 KRAB-truncado (GDK) transfectantes pero no en el ZBRK1 truncado CTRD (GDZ) o los dos KRAB- y CTRD- ZBRK1 truncada (GDKZ) transfectantes (Figura 4D, el panel izquierdo, y la figura S3). Además, un ensayo de indicador se realizó para evaluar aún más la potente participación de KAP1 y BRCA1 en la represión mediada por ZBRK1 de la actividad de reportero KAP1. De acuerdo con los resultados de RT-PCR, se observó la pérdida del efecto represivo de los transfectantes GDZ y GDZK (Figura 4D, panel derecho; comparar los carriles 2 y 3 con los carriles 1, 4 y 5). Por otra parte, la expresión ectópica de BRCA1, pero no KAP1 reprimen la actividad del reportero KAP1 (Figura 4D, panel derecho; comparar los carriles 6 y 7). Estos resultados sugieren que la expresión KAP1 se correlaciona inversamente con los niveles ZBRK1 y que la interacción entre los genes BRCA1 y ZBRK1 es esencial para la represión mediada por ZBRK1 del reportero KAP1.
KAP1 niveles se correlacionan inversamente con los niveles ZBRK1 en muestras de cáncer de cuello uterino
Nuestro estudio anterior demostró que ZBRK1 se redujo en muestras de cáncer de cuello del útero [14]. Sin embargo, los niveles relativos de ZBRK1 y KAP1 en muestras clínicas no estaban claros. Aquí, mostramos que el nivel endógeno de ZBRK1 es alta en el tejido cervical normal y disminuye a medida que progresa el tumor, particularmente en muestras de cáncer de cuello uterino altamente invasivos y metastásicos (Figura 5A y 5B, panel izquierdo). Por el contrario, el nivel de KAP1 era baja en las muestras normales, pero más alta en muestras de cáncer de cuello uterino altamente invasivos y metastásicos (Figura 5A, panel derecho). En comparación con los niveles de expresión de ZBRK1 y KAP1 en las mismas muestras, un aumento de la expresión de KAP1 se correlacionó con una expresión reducida de ZBRK1 (p = 0,015).
A, todas las muestras tumorales de 50 pacientes con diferentes estadios del cáncer de cuello uterino se obtuvieron a partir de tejidos extirpados quirúrgicamente. expresión ZBRK1 y KAP1 se detectó en el epitelio no tumoral (A, B), en el carcinoma in situ (C, D) e invasivo (E, F) y carcinoma metastásico nodal (G, H) mediante inmunohistoquímica. B, una imagen representativa de ZBRK1 demuestra una gradual disminución significativa, mientras que KAP1 tenía significativamente elevada expresión. Los niveles de expresión de ZBRK1 o KAP1 en CIS normales,, cáncer invasivo y cáncer metastásico se calcularon utilizando análisis de varianza (ANOVA); p & lt; 0,001 se consideró significativo. ZBRK1 y KAP1 niveles de expresión entre las fases del tumor se compararon mediante la prueba de Chi-cuadrado, para lo cual se utilizaron dos caras pruebas de significación. Un valor de p & lt; 0,05 se consideraron significativos.
ZBRK1 atenúa inducida por KAP1 invasión y metástasis
En las figuras 3 y 4, que demuestran que la pérdida de potencia la expresión ZBRK1 KAP1 y la capacidad de KAP1 para promover la migración de las células del cáncer y
in vitro
invasión y metástasis. Estos descubrimientos nos motivaron a confirmar aún más si ZBRK1 puede atenuar la invasión y la metástasis
in vivo inducida por
KAP1. Análisis histológicos ilustrado que el número de lesiones micrometastásicas se redujo notablemente en los pulmones de ratones inyectados con células HeLa-agotado KAP1 y el aumento en los pulmones de ratones inyectados con células HeLa que expresan ectópica KAP1 (Figura 6A y 6B). Los resultados sugieren que KAP1 juega un papel funcional en la promoción de la metástasis celular y la invasión. Estos datos apoyan aún más la sugerencia de que la pérdida de aumento de la expresión KAP1-desencadenó ZBRK1 contribuye a la metástasis y la invasión del cáncer cervical.
hematoxilina y eosina (H y E) tinción de HeLa metástasis de pulmón derivada de células después de 4 se muestra semanas -6. Seis ratones NOD-SCID eran cola venosa (A) o subcutánea (B) inyectado con parental, KAP1 que expresan (G-KAP1) o shRNA lentiviral contra KAP1 (shKAP1) que expresan las células HeLa. se muestran las secciones de tinción E de tejidos pulmonares de tumores metastásicos; imágenes representativas de H & amp. Ampliación: 40 X 200 y Análisis de X. ambos grupos indicaron que la expresión KAP1 afecta significativamente el potencial metastásico de células HeLa
Discusión
Ha sido bien documentado que exhibe ZBRK1 supresor. actividad para la metástasis del cáncer; Sin embargo, las implicaciones y las contribuciones de las proteínas que interaccionan con ZBRK1 en este intrincado proceso sigue siendo difícil de alcanzar. Específicamente, el dominio KRAB N-terminal y el dominio BRCT C-terminal de ZBRK1 son responsables de KAP1 y BRCA1 interacciones, respectivamente. En este estudio, hemos demostrado que el dominio KRAB de ZBRK1 rige predominantemente la migración de células de cáncer; mientras que la capacidad de la ZBRK1 para suprimir el crecimiento celular parece requerir interacciones con tanto KRAB y dominios CTRD. Curiosamente, la expresión exógena de KAP1 exhibió un efecto marginal sobre la proliferación celular (Figura 3A), lo que implica que KAP1 puede no ser la única proteína que interactúa con el N-terminal de ZBRK1. Debido a la participación débil de KAP1 en el control de la proliferación celular, BRCA1 se ha especulado que ser el responsable de la regulación de la proliferación de las células cancerosas a través de su interacción con ZBRK1 [18,19], una conjetura que necesita ser investigado más a fondo.
nuestro trabajo previo ha identificado una serie de posibles genes abajo de ZBRK1 [14], sin embargo, los efectos coordinados y separados de los genes BRCA1 y KAP1 en la regulación génica mediada por ZBRK1 siguen sin estar claros. Para ello, los análisis globales de ARNm se realizaron utilizando ARN total cosechado de GZB, GZBDK y líneas de células HeLa estable GZBDZ. Con base en los resultados de perfiles, además de KAP1, se identificaron 21 genes de respuesta y categorizados por su capacidad de respuesta al dominio KRAB N-terminal (genes APP, CDH2, S100A6 y CLDN3), C-terminal de dominio CTRD (genes ODC1, VIM y NFE2L2 ) y ambos extremos N- y C-terminales (MMP9, y los genes SH3GLB2 MAPK4K) (Tabla S1). la validación de RT-PCR (Figura S3) apoyó esa KAP1 y BRCA1 independiente o colectivamente, pueden participar a las regulaciones de genes mediada por ZBRK1 en las células.
En los especímenes de cáncer de cuello uterino primarios, los niveles KAP1 están inversamente correlacionados con los niveles ZBRK1 lo largo de diferentes tumores etapas. Brevemente, la expresión de ZBRK1 fue significativamente reguladas por en el cáncer cervical altamente invasivo y metastásico en comparación con el cáncer cervical no metastásico. Por el contrario, el nivel de KAP1 fue baja en condiciones normales y aumenta a medida que progresa el cáncer (Figura 5). Sabemos que este cambio en los niveles de transcripción puede resultar de la actividad promotora y /o modificaciones post-transcripcional /degradación. Se determinó que ZBRK1 podría unirse directamente al promotor de la KAP1 para reprimir su expresión. Por otra parte, la vida media del ARNm de KAP1 no difirió significativa de la de las células que expresan ZBRK1 ectópico (Figura S2). En conjunto, estos resultados indicaron que el gen KAP1 era un objetivo corriente abajo de ZBRK1. También descubrimos que la expresión de ARNm KAP1 se reduce en las células que expresan ectópica ZBRK1 y GZBDK pero no GZBDZ. Fue coherente nuestra observación de que la actividad del indicador KAP1 fue baja en células que expresan ectópica BRCA1, pero no KAP1. Este hallazgo sugiere fuertemente que la inhibición de la transcripción de KAP1 ZBRK1 estaba regulado por la crítica por la interacción ZBRK1 /BRCA1.
KAP1 es un represor transcripcional bien estudiado que se une a los dominios KRAB de proteínas con dedos de zinc [20]. Nosotros mostramos aquí que KAP1 puede interactuar con ZBRK1 para promover la migración de las células cancerosas por
in vitro Opiniones y análisis clínicos. Por otra parte, hemos demostrado que ZBRK1 asume un papel represivo en la atenuación de la invasión del cáncer inducido por KAP1. Estos resultados nos llevó a explorar si la manifestación de una mayor movilidad-KAP1 se debe a la pérdida de la represión por parte del promotor KAP1 ZBRK1 o la falta de ZBRK1 /KAP1 interacción proteína-proteína. Ectópica expresión de ZBRK1 en célula que expresa KAP1 promotor impulsado por CMV no alteró la capacidad de KAP1 para promover la migración celular y la invasión (Figura S4), lo que sugiere que la interacción proteína-proteína entre ZBRK1 y KAP1 tiene un efecto mínimo en la mediada por KAP1 la migración de las células cancerosas.
ha habido una serie de evidencias indirectas vistos en estudios recientes que sugieren que el papel de KAP1 promover la tumorigénesis, además de la migración de las células cancerosas. En primer lugar, un factor de transcripción proximal (CBF-A) forma un complejo con KAP1 y FTS-1 que activa reguladores transcripcionales de la transición epitelial-mesenquimal. Además, hay evidencia que indica que el motivo de reconocimiento de ARN (RRM) en CBF-A puede interactuar con el dominio de PHD KAP1 [21]. En segundo lugar, la interacción de CBF-A a KAP1 unido al elemento promotor FTS-1 puede ser un activador proximal de EMT [13]. Estos resultados sugieren que KAP1 también juega un papel en la metástasis. En tercer lugar, la interacción del KAP1 con MDM2 p53 contribuye a la regulación funcional [22], lo que sugiere KAP1 también juega un papel en el cáncer mediante la inhibición de p53. Estos hallazgos plantean dos cuestiones importantes: ¿Cuál es el papel de ZBRK1 en estas intrincadas regulaciones y cómo está regulada por KAP1 ZBRK1 y BRCA1? El laboratorio está actualmente trabajando activamente en las respuestas a estas preguntas.
Se han realizado algunos estudios preliminares que investigan cómo determinantes epigenéticos pueden reprogramar la expresión de genes con respecto a la metástasis del cáncer. Por ejemplo, la proteína del grupo Polycomb EZH2 cataliza modificaciones de las histonas, promueve la metilación del ADN, y es un marcador predictivo de crecimiento invasivo en próstata y de mama cánceres metastásicos [23,24]. Además, la activación del complejo remodelador de la cromatina β-catenina-reptin conduce al silenciamiento del gen supresor de metástasis
KAI1
[25]. KAP1 fue identificado previamente como un andamio molecular para regular la estructura de la cromatina a través de su interacción con Mi-2a, un componente de la desacetilasa de histonas NuRD complejo [7]; metiltransferasa SETDB1 [8]; y heterocromatina protein1 (HP1) la familia [9,10], haciendo KAP1 el primer potencial normal epigenético que promueve la metástasis de las células. Este descubrimiento justifica la identificación de los componentes en el complejo mediada por KAP1 que participa en la promoción de la metástasis.
En este trabajo, hemos demostrado que KAP1 tiene la capacidad para promover la metástasis de las células cancerosas sin afectar a la proliferación de células cancerosas. Por otra parte, KAP1 puede promover la invasión y la metástasis de las células cancerosas. También hemos descubierto una nueva función de ZBRK1 como un represor transcripcional del gen KAP1. De relevancia clínica, se observó que los niveles de expresión de ZBRK1 se redujo significativamente, mientras que los niveles de KAP1 se incrementaron significativamente en agresivos muestras de cáncer de cuello uterino. Tomados en conjunto, nuestros resultados indican que ZBRK1 sirve como un supresor de la metástasis del cáncer mediante la modulación de los genes relacionados con metástasis a través de la represión de la transcripción de KAP1.
Materiales y Métodos
Pacientes y muestras tumorales
la junta de revisión institucional de Chi Mei Medical Center (Tainan, Taiwan) había aprobado el estudio mediante el uso de tejido fijado con formalina de cáncer de cuello uterino para este estudio (IRB100-11-009). Disponible bloques de tejido incluidos en parafina fueron recuperados de 10 carcinomas in situ (CIS) [26], 15 carcinomas invasivos, y las metástasis nodales de otros 10 carcinomas invasivos, así como muestras epiteliales cervicales 10 no tumorales. La junta de revisión institucional aprobado nosotros para obtener muestras de nuestra (Chi-Mei Medical Center) Biobanco. Como regla general, todas las muestras deben estar inscritos solamente con acuerdos de los pacientes y con el consentimiento informado completado. Dado que las muestras se desconectan con su información personal identificable, el consentimiento informado además no puede estar disponible y no es necesario.
Cultivo de células y líneas celulares estables Establecimiento
líneas celulares de cáncer de cuello uterino se mantuvieron en completa medio que contenía DMEM, 5% de suero bovino fetal (FBS), 100 g /ml de estreptomicina y 100 unidades /ml de penicilina.