Extracto
Aplicaciones
aberrantemente activadas señalización /β-catenina vía es importante en el desarrollo de carcinoma hepatocelular (HCC). expresiones de genes aguas abajo que implican produce el /β-catenina cascada de Wnt a través de proteínas del factor de células T (TCF). Aquí, se muestra el potencial oncogénico de humanos TCF-4 isoformas basado en la expresión de un único motivo SxxSS conservada.
Métodos
Hemos investigado el par isoforma TCF-4J y K se caracteriza por la presencia (K) o ausencia (J) del motivo SxxSS. Los perfiles de expresión de ARNm se examinaron en 47 pares de HCC humano y tejidos de hígado no cancerosos adyacentes por RT-PCR. Proliferación, los ensayos de esfera y análisis de inmunotransferencia se realizaron en condiciones de normoxia e hipoxia. Se exploró la capacidad de las células que sobreexpresan HCC TCF-4J (células J) y K (células K) para crecer como tumores sólidos en ratones desnudos.
Resultados
de expresión de TCF-4J fue significativamente upregulated HCC en comparación con los tumores de hígado y peritumoral normal correspondiente y se expresó preferentemente en los HCC pobremente diferenciados. Por el contrario, TCF-4K se downregulated en esos mismos tumores HCC. TCF-4J-overexpressing células de HCC (células J) reveló una ventaja de supervivencia en condiciones de hipoxia, alta tasa de proliferación y formación de agregados /esferas en comparación con la sobreexpresión de TCF-4K (células K). Las células hipóxicas J tenían altos niveles de expresión de HIF-2α y EGFR como posibles mecanismos para promover la tumorigénesis. El aumento de la estabilidad de HIF-2α en condiciones de hipoxia en las células J se asoció con una disminución del nivel de proteína de von Hippel-Lindau (VHL), una conocida ligasa E3 de HIF-aS. En un modelo de xenoinjerto, las células J desarrollaron rápidamente tumores en comparación con células K. Los tejidos tumorales derivadas de células J exhiben altos niveles de expresión de HIF-2α y EGFR en comparación con el lento desarrollo y los tumores derivados de células K pequeños.
Conclusiones
Nuestros resultados sugieren que el TCF-4J específica isoforma, que carece de un motivo de reglamentación SxxSS, tiene robusto potencial de iniciación de tumor bajo condiciones de hipoxia
Visto:. Koga H, Tsedensodnom O, Tomimaru Y, Walker EJ, Lee HC, Kim KM, et al. (2012) Pérdida de la SxxSS con motivos en un T-Cell Factor Humano-4 isoforma confiere resistencia a la hipoxia cáncer de hígado: Un conmutador oncogénicos en la señalización Wnt. PLoS ONE 7 (6): e39981. doi: 10.1371 /journal.pone.0039981
Editor: Vincenzo Coppola, Universidad Estatal de Ohio Comprehensive Cancer Cente, Estados Unidos de América
Recibido: 30 Enero, 2012; Aceptado: 30-may de 2012; Publicado: 29 Junio 2012
Derechos de Autor © 2012 Koga et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por los Institutos nacionales de la Salud (CA-123544 a JRW). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
La vía de señalización /β-catenina desempeña un papel crucial en la determinación del destino de las células madre y la renovación celular en tejidos adultos [1], [2]. desregulación genéticos y /o epigenéticos de esta vía conduce a la acumulación nuclear aberrante de β-catenina donde se une con el factor-4 de las células T (TCF-4) para formar un complejo transcripcional [3]; este evento conduce la expresión de genes como c
myc
,
ciclina D1
, y
EPCAM
[4], [5], [6] que contribuye a una maligna fenotipo.
el carcinoma hepatocelular (CHC) es la tercera causa más común de mortalidad en todo el mundo el cáncer [7]. Aberrantemente activadas de señalización Wnt /β-catenina debido a la sobreexpresión de los componentes aguas arriba de esta vía, tales como Frizzled receptores (FZD) y ligandos Wnt es un evento temprano común en la patogénesis molecular de esta enfermedad [8], [9], [10] . Sin embargo, la participación de los canónicos Wnt TCF-4 proteínas efectoras en este proceso aún no se ha examinado.
El gen TCF-4 humana (
TCF7L2
) se compone de 17 exones y tiene varias sitios de splicing alternativo en los exones 13-17 y el exón 4 [11]. Los sitios de corte y empalme alternativos en el dominio central de TCF-4 también pueden generar isoformas con o sin la LVPQ conservadas y motivos SxxSS situados en el extremo del exón 7 y el comienzo del exón 9, respectivamente [11], [12]. Recientemente, hemos identificado y caracterizado 14 (12 de los cuales son únicos) TCF-4 isoformas derivadas de líneas celulares de HCC humanos [13]. Entre tales isoformas, tres pares estructuralmente idénticos (TCF-4J y K; TCF-4G y H; TCF-4A y B) se observaron que difieren solamente por la presencia (K, A, y H) o ausencia (J, B, y G) de un motivo SxxSS. En este contexto, dos pares de isoformas (TCF-4A y B, y TCF-4H y G) son formas cortas, mientras que la TCF-4 K y J son formas largas debido a la inclusión de una cola C-terminal (exón 13-17 ) [13]. Estudios previos sugieren que el motivo SxxSS puede modular la actividad transcripcional de TCF-4 [12]; sin embargo, tanto la base de células y
in vivo
consecuencias funcionales de la expresión motivo SxxSS así como la actividad reguladora de genes subsiguiente no se han determinado.
Nuevas pruebas indican que tanto embrionarias (ES) , madre pluripotentes (iPS) células inducibles [14] de adultos y prefieren condiciones de hipoxia para el crecimiento y la supervivencia [15]. La hipoxia genera diversas señales celulares a través de la estabilización de los factores inducibles por hipoxia (HIF-aS) como HIF-1α y HIF-2α. Estudios recientes revelan que HIF-aS interactúan con β-catenina y, por lo tanto, puede regular la expresión de genes impulsado por TCF-4 no sólo en vástago /progenitores sino también las células tumorales que experimentan condiciones de hipoxia durante el rápido crecimiento [16], [17]. Estos resultados implican que Wnt /β-catenina /TCF-4 de señalización puede ser regulada directamente por el sistema de detección de oxígeno profesional en el núcleo. Por ejemplo, estabilizado HIF-2α, socio de β-catenina y encuentra a menudo en el núcleo hipóxico del tumor, upregulates la expresión del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y puede contribuir al crecimiento del tumor [18]. En HCC humano, los HIF-aS están involucrados en el proceso de múltiples pasos de desdiferenciación del tumor a través de la promoción de la angiogénesis [19]. De acuerdo con ello, se determinó si las diferentes propiedades funcionales de TCF-4 isoformas asociadas con el fenotipo maligno HCC fueron regulados en el contexto de un mecanismo dependiente de motivos SxxSS en condiciones de privación de oxígeno.
Materiales y métodos
Ética Declaración
se obtuvo la aprobación ética completa para todas las colecciones de muestras humanas, ya sea del Comité de Ética del Centro Médico Asan o el Comité de Ética de la Universidad de Kurume. Todas las muestras se obtuvieron con consentimiento por escrito. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices del NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el Comité de Bienestar de los Animales Vida útil del Hospital de Rhode Island, Providence, RI (número de permiso A3922-01).
La detección de TCF-4 isoformas en HCC tumores mediante RT-PCR
preparaciones de TCF-4A humana, B, J y K-myc plásmidos se han descrito anteriormente [13]. dos análisis independientes de RT-PCR se realizaron con 47 pares de HCC humanos (Tablas 1 y 2) como se describe anteriormente [13].
Líneas celulares y cultivos
líneas celulares humanas Hep3B, Huh7, HepG2, y HEK293 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). FOCUS línea celular se obtuvo del Dr. Bastos (Centro de Investigación de hígado, del Hospital de Rhode Island, RI). células HAK-1A y 1B HAK-fueron proporcionados por el Dr. Yano (Escuela Universitaria de Medicina de Kurume, Japón). La línea celular de hepatocitos derivados inmortalizado oums-29 fue una especie de regalo de los Dres. Namba y Kobayashi (Universidad de Okayama, Japón). Hep3B, Huh7, HepG2, y líneas de células de interés se encuentran el virus de la hepatitis B (VHB) relacionados con la PI células de HCC. células HAK-1A y 1B son HAK-virus de la hepatitis C (VHC) relacionados con la PI líneas celulares de HCC. Todas las células se han descrito y utilizado en estudios previos (Hep3B [20], Huh7 [21], HepG2 [20], HEK293 [22], FOCUS [23], y HAK-1A y 1B HAK-[24]). Para generar transfectantes estables, células HAK-1A se transfectaron con el plásmido vector de TCF-4 o vacío USO DEL TRANSPORTE-LT1 Reactivo (Mirus Bio Co., Madison, WI) y seleccionados por G418.
Hipoxia inducción
condiciones hipóxicas (1% de oxígeno) fueron producidos por una incubadora equipado con un sistema de regulación de la concentración de oxígeno (ASTEC, Fukuoka, Japón). Alternativamente, las células fueron expuestas a cloruro de cobalto química hipoxia-mímica (CoCl
2, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) [25].
Microscopía confocal de barrido láser
Las células , que se cultiva en 35 mm de diámetro de vidrio platos de fondo (MatTek, Ashland, MA), se fijaron con acetona /metanol frío (1:01) durante 10 min, y después se lavaron en PBS que contenía 0,05% de Tween 20 (PBS-T). reacciones no específicas se bloquearon con proteína de suero libre de Block (DAKO América del Norte, Carpinteria, CA) y después se incubaron con un anticuerpo anti-Myc-tag ratón (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) o un anticuerpo de conejo anti-HIF-2α (Abcam, Cambridge, Reino Unido) a 4 ° C durante la noche. Después de lavar en PBS-T, las muestras fueron tratadas con Alexa Fluor de cabra anti-ratón o IgG de cabra anti-conejo (H + L) de anticuerpos (Molecular Probes, Eugene, OR) durante 40 min a RT, y counterstained por Vectashield montaje medio con 4 ', 6-diamino-2-fenilindol (DAPI) (Burlingame, CA). El Zeiss LSM510 microscopio confocal de barrido láser (Carl Zeiss MicroImaging, Inc., Thornwood, NY) equipado con el software de interfaz de usuario Zen 2008 se utiliza para visualizar la tinción por inmunofluorescencia para la etiqueta Myc o HIF-2α y localización nuclear fue proporcionada por DAPI. Los controles negativos se obtuvieron incubando las células con IgG de ratón no específico o IgG de conejo como se describe anteriormente.
análisis de inmunotransferencia e inmunoprecipitación
Los anticuerpos primarios utilizados fueron contra de Myc-tag, β- catenina, actina, γ-tubulina, lamina A /C, HIF-1α, c-myc, y ubiquitina (Santa Cruz Bio, Santa Cruz, CA), TCF-4, EpCAM, y von Hippel-Lindau (VHL) (Cell Signaling Technology, Beverly, MA), HIF-2α (Abcam, Cambridge, Reino Unido), y la queratina-19 (K-19) (DAKO, Carpinteria, CA). Un conejo de TCF-4 derivada mAb (Cell Signaling Technology, Cat#2569) reconoce que rodea a la Leu330 de TCF-4 humana y detecta endógenos TCF-4 proteínas, incluyendo tanto las isoformas cortas y largas. Para la inmunoprecipitación, los extractos celulares se prepararon como se describe anteriormente [26]. lisado celular total o extracto nuclear se incubaron con anticuerpos contra HIF-1α, HIF-2α, y VHL seguido de proteína recombinante G agarosa (Invitrogen, Carlsbad, CA). Las inmunotransferencias se sondaron con anticuerpos frente a la ubiquitina, HIF-1α, HIF-2α, y VHL y se detectaron con marcado con HRP anti-ratón o anti-IgG de conejo (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, Reino Unido) usando ECL kit avanzada (Amersham). Las señales positivas fueron capturados por el analizador de imágenes LAS-1000plus (Fujifilm, Tokio, Japón), y se determinó la intensidad de las bandas de proteínas utilizando la versión 3.45 Image Gauge (Fujifilm).
Ensayo de proliferación celular
Las células se sembraron en placas de 24 pocillos a una densidad de 2,5 × 10
3 /pocillo. Un ensayo colorimétrico (CellTiter 96® Aqueous One Solution Ensayo de proliferación celular; Promega, Madison, WI) se realizó a los días 0, 1, 3, 5, y 7, y las señales se midieron usando Spectra Max M5 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).
Crecimiento independiente de anclaje (Esfera de ensayo)
suspensiones de una sola célula se pusieron en placas de fijación Ultra Low 6 pocillos (Corning, Lowell, MA). Después de 27 días, el número de agregados de células /esferas por pocillo se cuantificó y se fotografió bajo el Zeiss Axiovert 200 M microscopio de fluorescencia (Carl Zeiss MicroImaging). El área de los agregados de células se midió usando el software MetaMorph 6.0 (Molecular Devices)
Evaluación de la Estabilidad de la proteína
Las células se expusieron a 5 mg /ml de cicloheximida (CHX; Sigma-Aldrich). 0 o 60 minutos a la última fase de la 48 h CoCl
2 tratamiento. lystes celulares totales fueron utilizados para el análisis de inmunoblot para evaluar HIF-1a y HIF-2α niveles de expresión después de la síntesis de proteínas fue inhibida por CHX.
Modelo xenoinjerto de tumor en ratones desnudos
derivados de HAK-1A se utilizaron clones estables; células HAK-1A de los padres no forman tumores en ratones desnudos, y son por lo tanto adecuados para la evaluación de la transformación maligna después de la transfección estable con TCF-4 isoformas [24]. Las células (1 × 10
6) fueron inyectados por vía subcutánea en la parte posterior de 5 semanas de edad BALB /c ratones desnudos (n = 12) (Taconic Farms, Cranbury, NJ). El tamaño del tumor se midió dos veces por semana, y el volumen del tumor (mm
3) se estimó utilizando la longitud ecuación x (anchura)
2 × 0,5. Cuando el diámetro más largo alcanzó 10 mm, los ratones se sacrificaron y los tumores se prepararon para el análisis posterior.
inmunohistoquímica de tumores de xenoinjerto
secciones de tejido
embebidos en parafina fueron desparafinados-y se calienta en citrato 10 mM tampón a 120 ° C durante 5 min para la recuperación de antígenos. Las secciones fueron pre-bloqueados por Protein Bloque libre de suero (Dako) y se incubaron con anticuerpos primarios para HIF-2α (Abcam) y EGFR (D38B1 XP ™) (Cell Signaling Technology). Después del lavado, las secciones fueron incubadas con EnVision anticuerpos secundarios marcados con complejos de HRP-polímero (DAKO) y se visualizaron por 0,1% 3-3 '' - diamino-bencidina-tetrahidrocloruro. Los núcleos celulares se contratiñeron con hematoxilina. Espécimen incubadas con el ratón o IgG de conejo se establecieron como los controles negativos.
Análisis estadístico
La significación estadística se realizó mediante la prueba de la U de Mann-Whitney utilizando el software GraphPad Prism 4.0 (San Diego, CA) .
P Hotel & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo. coeficiente de correlación de Pearson se utilizó para calcular la correlación entre la expresión de TCF-4J y K.
Resultados
Diferencial perfil de expresión de TCF-4J y 4K en TCF-HCC tejidos humanos
la expresión de TCF-4 isoformas con o sin el motivo SxxSS puede influir en su actividad transcripcional [12], [13], [27]. Por lo tanto, a fin de determinar si tres pares de isoformas (TCF-4A y B; TCF-4G y H; y TCF-4J y K) exhibieron diferentes perfiles de expresión que pueden sugerir la regulación SxxSS dependiente en los tumores de HCC humanos. Se midieron los niveles de ARNm relativos de estos TCF-4 isoformas en 27 pares de tumores de HCC y el tejido hepático adyacente obtenida de enfermedad crónica relacionada con el VHB (26/27) correspondientes. Se hicieron comparaciones a tres muestras de hígado normales por semi-cuantitativos de RT-PCR (Fig. 1A, Fig. S1A y C, y en la Tabla 1) como se describe anteriormente [13]. expresión TCF-4J se upregulated significativamente en los tumores de HCC comparación con el tejido peritumoral y el hígado normal. Entre las muestras pareadas de 27, el 85% había aumentado de expresión de TCF-4J en el CHC en comparación con el tejido peritumoral avenido. Por el contrario, TCF-4K se downregulated significativamente en los tumores en comparación con hígado normal y el tejido peritumoral (Fig. 1A). Además, se observó un perfil de expresión similar de estos TCF-4 isoformas en una segunda cohorte de pares de tejido no afectado HCC-adyacentes de individuos donde 85% (17/20) de los tumores estaban relacionados con la infección crónica por HCV (Fig. 1B, Tabla 2). Sin embargo, este patrón de expresión diferencial no se observó en los otros dos pares de isoformas cortas (TCF-4A y B, G y H) (Fig. S1). TCF-4A, una forma corta de K fue significativamente downregulated en tumor HCC relacionado con el VHB en comparación con el hígado normal, así como peritumoral tejido. Además, el nivel de expresión de TCF-4B, una forma corta de J, se encontró que era similar entre lo normal, tumor, y peritumoral tejidos (Fig. S1A). Por otra parte, el otro par de TCF-4 isoformas (G y H) también reveló diferencias de sus niveles de expresión entre tumor normales, HCC, y tejidos peri-tumorales (Fig. S1c). En los tejidos HCC relacionados con el VHC, sin embargo, las cuatro isoformas (TCF-4A y B, G y H) se downregulated significativamente en ambos tejidos peritumoral y tumorales en comparación con hígado normal; además no se encontraron diferencias entre las muestras tumorales y peritumoral (Fig. S1B y D). Estos resultados indican que la influencia de SxxSS motivo en la generación de un fenotipo maligno HCC puede estar asociada con el largo (TCF-4J y K), no isoformas cortas (TCF-4A y B, G y H).
(A) análisis comparativo de TCF-4J y K de ARNm de los niveles de expresión en 27 tumores de HCC relacionado con el VHB (T) del tejido peritumoral adyacente (pT) y hepáticas normales histológico (N) por RT-PCR. Los valores se normalizan a GAPDH. rectángulos rojos denotan pobremente diferenciado HCC (PD). WD, bien diferenciado; MD, moderadamente diferenciado. Los resultados estadísticos de todos los tejidos o HCC PD se expresan como media ± desviación estándar (panel derecho). (B) Otros 20 tumores HCC WD HCC incluyendo cinco de un centro clínico diferente. Diecisiete individuos tenían enfermedad hepática crónica relacionada con el VHC, y el resto tenían infección crónica por VHB. Ver también las Tablas 1 y 2. (C) niveles de expresión de TCF-4J y K mRNA en líneas celulares humanas HepG2 (G2), Hep3B (3B), Huh-7 (H7), FOCUS (FO), HAK-1A (1A ), HAK-1B (1B), oums-29 (OU), y HEK293 (293). (D) la correlación inversa entre la TCF-4J y la expresión K en todo el CHC (panel izquierdo) y HCC PD (panel derecho). Tenga en cuenta la correlación inversa débil en todos los casos (
r = 0,297
), mientras que el incremento en correlación inversa HCC PD (
r = 0,437
). *
p Hotel & lt; 0,01; **
p
. & Lt; 0,05
A continuación, analizamos la correlación entre las características clínico-patológicos y la expresión de estas isoformas TCF-4 (Tabla 3, Tabla S1). Los resultados sugieren que sólo el grado (s) de la diferenciación del tumor significativamente correlacionado con TCF-4J y K los niveles de expresión (Tabla 3). De hecho, el nivel de TCF-4K se redujo significativamente en pobremente diferenciado (PD) tumores de HCC, que estaba en contraste con alto nivel de TCF-4J que se encuentra en esos mismos tumores HCC (Fig. 1A y B, Tabla 3). Estos estudios sugieren que la expresión regulada por incremento de TCF-4J puede ser una característica común de HCC PD. En apoyo de esta hipótesis, la TCF-4J fue altamente expresado en tanto relacionado con el VHB (HepG2, Hep3B, Huh7, y FOCUS) y relacionada con el VHC (HAK-1A y 1B) HAK-líneas celulares (Fig. 1C). Esta isoforma se expresó también en oums-29 y HEK293. En contraste, el nivel de expresión de TCF-4K fue muy baja en los tumores de HCC PD y líneas celulares excepto por HAK-1B y HEK293 (Fig. 1A, B, y C). Por el contrario, los dos pares de isoformas cortas (TCF-4A y B, o G y H) no demostraron una correlación entre las características clínico-patológicos y su expresión del motivo SxxSS (Tabla S1).
análisis posteriores demostraron que la expresión de TCF-4J en el CHC fue significativamente inversamente correlacionada con la TCF-4K (figura 1D, panel izquierdo;.
p = 0,0031
, coeficiente de correlación
r = 0,297
). La correlación inversa entre la TCF-4J y los niveles de expresión de K fue más evidente en la EP HCC (figura 1D, panel derecho;.
p = 0,0077
,
r = 0,437
). Así, la pérdida del motivo SxxSS en las largas isoformas de TCF-4 debido a un evento de corte y empalme se asoció con un fenotipo PD HCC.
localización subcelular de TCF-4J y K isoformas en la célula HCC HAK-1A línea
Para entender mejor cómo la expresión del motivo SxxSS puede promover el fenotipo maligno de CHC
in vitro
, lo primero que examinó la localización de TCF-4J y K en líneas celulares de HCC HAK-1A después de la transfección transitoria. Como se muestra en la Fig. 2, la expresión celular se observó predominantemente en el núcleo como se evaluó por microscopía confocal y los estudios de fraccionamiento núcleo /citoplasma, lo que sugiere que la expresión exógena de TCF-4J y proteínas K se localizará al compartimiento de núcleo.
(A) Organización del "corto" (A, B) y las isoformas "larga" (J, K); TCF-4B y J carecen del motivo SxxSS. microscopía (B) confocal de escaneo láser demuestra la localización nuclear de TCF-4J y TCF-4K (verde). Los núcleos se contratiñeron por DAPI. (C) Nuclear (Nuc) /citoplasmática (cito) de fraccionamiento seguido de análisis de inmunotransferencia confirma la localización nuclear de TCF-4J y isoformas K. Lamina (lamina A /C) y γ-tubulina se utilizaron como marcadores nucleares y citoplasmáticos, respectivamente.
TCF-4J-overexpressing células de HCC tienen una ventaja proliferativa bajo condiciones hipóxicas Condiciones
durante el proceso de múltiples pasos de hepatocarcinogénesis, surgen HCC células menos diferenciadas del centro de nódulos tumorales HCC que revelan un aspecto histológico "nódulo-en-nódulo" en un examen patológico de secciones de tejido [28]. El área central tumor genera estrés hipóxico a las células tumorales y promueve la apoptosis [18], [29]. Sin embargo, puede haber una población hipoxia resistentes de células de HCC que sobreviven en estas condiciones severas para promover el crecimiento del tumor a través de la angiogénesis y la invasión vascular acelerada. Estos dos fenómenos están regulados por HIF-1α y HIF-2α [30], [31]. Por lo tanto, la hipótesis de que la alta expresión de TCF-4J en HCC PD era un posible reflejo de un fenotipo resistente a HCC hipoxia inducida. Para probar esta idea, se establecieron clones de células estables que sobreexpresan TCF-4J (células J) y TCF-4K (células K), y se hicieron comparaciones a los clones de células transfectadas con el vector vacío (células EV), así como a la HAK parental células -1 bis. En la microscopía de contraste de fase, la apariencia morfológica de estos clones fue similar y comparable a las células parentales (Fig. 3A), que estaba en contraste con el clon de células dediferenciado derivado de HAK-1A-1B HAK [24].
(A) Fase microscopía de contraste de los padres HAK-1A (1A) y clones estables 1A derivados, incluyendo el clon de vector transfectadas vacío (EV2), los clones transfectados-TCF-4J (J1 y J15), y los clones transfectados-4K-TCF (K2 y K5). El aspecto morfológico de la línea de alta malignidad, HAK-1B (1B) de células, un tipo de célula clonal dediferenciado, de 1A, se presenta también para la comparación. Bar = 50 micras. (B) El análisis por inmunotransferencia de clones celulares estables. Las señales positivas para la etiqueta Myc se muestran en la J1, J15, K2 y K5. células HepG2 (G2) se sabe que expresan tanto de longitud completa (92 kDa) y truncada β-catenina (75 kDa), mostraron una banda inferior para β-catenina HepG2 (β-Cat) también se utilizó como control positivo para EpCAM y la expresión de K-19. HEK293 se utilizó como control negativo para la K-19. las tasas de (C) el crecimiento de células de clones estables en las condiciones de hipoxia generados por CoCl
2 (150 mM) durante 7 días. La tasa de crecimiento se representa como el pliegue-aumento en comparación con el día 0. (D) El crecimiento celular de clones estables en normoxia (20% O
2) o condiciones hipóxicas (1% O
2) Las células se expusieron a cualquiera 20% o 1% de oxígeno durante 5 días. Tenga en cuenta que la reducción del crecimiento de células en contidions hipóxicas fue menor en las células J (13%) en comparación con el EV (22%) y K (27%) de las células. ensayo de crecimiento (E) independiente del anclaje (ensayo de esfera). De contraste de fases vistas microscópicas de agregados celulares representativas se muestran en 0, 75, y 150 mM de CoCl
2. Bar = 300 micras. Tenga en cuenta la notable diferencia en la tasa de crecimiento de la colonia y la apariencia a 150 M de CoCl
2. *
p Hotel & lt; 0,05; **
p
. & Lt; 0,01
señalización /β-catenina vía menudo se correlaciona con alteraciones moleculares similares a las células madre [32], [33]. En este sentido, la expresión de EpCAM, un marcador de células madre de cáncer de hígado putativo (CSC) y un gen diana aguas abajo del producto β-catenina /TCF-4 [6], no se upregulated en estas células. Sin embargo, la expresión de K-19, un marcador de linaje biliar para un fenotipo agresivo HCC [34], se aumentó en las células J pero no en K, EV, o células HAK-1A parentales (Fig. 3B).
de acuerdo con nuestro informe anterior en células Huh7 [13], las células J tenía una tasa de crecimiento basal aumentado en comparación con las células de control K y EV. Las células fueron resistentes J bajo inducidos químicamente, las condiciones de hipoxia severa (150 M CoCl
2), proliferaron significativamente más rápido que las células K o EV (Fig. 3C). Este hallazgo fue apoyado además cuando las células fueron expuestas a 1% de oxígeno durante 5 días (Fig. 3D). El crecimiento celular en la hipoxia (1% de oxígeno) se redujo en células EV y K en comparación con la proliferación celular en normoxia (20% de oxígeno) por 22 y 27%, respectivamente, mientras que las células J desmostrarse solamente una reducción del 13% en el crecimiento celular. Por otra parte, la resistencia robusta a la hipoxia severa en las células J también se exhibió en un ensayo de esfera. En este contexto, las células J forman las más grandes agregados de células en todos los COCl
2 concentraciones empleadas. potencial de las células J 'de anclaje independiente de crecimiento fue más evidente con la hipoxia severa inducida por 150 M CoCl
2 (fig. 3E).
Pérdida de la SxxSS Motif contribuye a los niveles de expresión de HIF aS
sobre la base de las características de hipoxia resistente exhibidas por las células J, se determinó si estas células expresan HIF-aS en condiciones de hipoxia. Tanto HIF-1α y la expresión de HIF-2α en las células J y K se exploraron desde HIF-2α recientemente se ha demostrado que es una molécula clave que promueve la supervivencia de células madre cancerosas en condiciones de hipoxia [35], [36], [37]. Como era de esperar, HIF-1α y la expresión de HIF-2α se indujeron con hipoxia moderada (75 mM CoCl
2) en EV, J y K células; sin embargo, bajo condiciones de hipoxia graves (150 M CoCl
2), sólo las células J mantienen estos altos niveles de proteínas (Fig. 4A). Estabilizado HIF-2α, que se encuentra a menudo en el núcleo hipóxico del tumor, upregulated la expresión de EGFR que puede contribuir al crecimiento del tumor [18], y la activación de la vía de señalización de EGFR se asoció con el desarrollo de HCC K-19-positivas [ ,,,0],38]. En las células J, la expresión de EGFR y K-19 se asoció con un aumento del nivel de HIF-2α (Fig. 4A). La respuesta HIF consistente también se observó en 1% de células J expuestos al oxígeno (Fig. 4B). Además, el 150 mM CoCl
2-indujo la expresión de HIF-2α se localiza en los núcleos de las células J tal como se evaluó por tinción de inmunofluorescencia (Fig. 4C).
(A y B) El análisis por inmunotransferencia de vacío células TCF-4K-overexpressing (K) transfectadas con vector (EV), TCF-4J-overexpressing (J), y. Las células se trataron con 0 y 150 mM CoCl
2 (A) o cultivan en la tensión de oxígeno 1% durante 48 horas (B). Los lisados celulares se sometieron a detectar HIF-aS y de expresión de TCF-4 proteínas isoforma etiqueta Myc. Los niveles de expresión se representaron como una relación a la actina (panel derecho). (C) La microscopía confocal para la localización nuclear de la proteína HIF-2α. Las células fueron tratadas con 0 M (normoxia) o de 150 micras (hipoxia) CoCl
2 y se tiñeron con un anticuerpo anti-HIF-2α anticuerpos (verde). DAPI se utilizó para la tinción nuclear. (D) El análisis por inmunotransferencia de lisados de células totales de las células tratadas con 0 ó 150 mM CoCl
2 durante 48 horas. A y B representan las células que sobreexpresan HAK-1A TCF-4A ( "forma corta" de TCF-4K) y TCF-4B ( "forma corta" de TCF-4J), respectivamente (véase la Figura 2A). Tenga en cuenta el sólido aumento de la expresión de HIF-1α y HIF-2α en las células B.
También determinamos si la regulación al alza de HIF-aS en condiciones de hipoxia severa en las células J estaba vinculada a la pérdida del motivo SxxSS. Si ese fuera el caso, un resultado similar se encontró en el TCF-4B células (células B), el llamado "isoforma corta" de la TCF-4J (Fig. 2A) que sobreexpresa. En este sentido, los lisados de células totales fueron sometidos a análisis de inmunoblot para comparar B con células A donde TCF-4A se sobreexpresa como la contraparte "forma corta" de TCF-4K (Fig. 2A). Es importante tener en cuenta que un aumento en la expresión total de lisado celular HIF-α fue evidente en las células B (Fig. 4D) y sugiere que el motivo SxxSS puede tener un papel regulador en la modulación de HIF-aS expresión bajo condiciones de hipoxia graves generados por 150 M CoCl
2 en los dos pares de TCF-4 isoformas.
acelerada degradación dependiente de ubiquitina de HIF-aS en células K
Debido a que las proteínas HIF-aS están altamente degradados por la ubiquitina vía proteasoma dependiente, se planteó la hipótesis de que un HIF-aS mecanismo de degradación diferencial puede existir en condiciones de hipoxia severa en J y K células. Los niveles de HIF-1α y HIF-2α se aumentaron sustancialmente en células K tratados con un inhibidor de proteasomal (MG-132) en comparación con células no tratadas K; Por el contrario se observó menos de un aumento de estas proteínas en células EV y J (Fig. 5A). La acumulación de HIF-aS en las células tratadas K-MG-132 sugiere fuertemente que las células K-motif albergar SxxSS pueden degradar HIF-aS en condiciones de hipoxia de una manera dependiente de proteasoma. De hecho, se encontró que la estabilidad de proteínas de HIF-aS ser disminuido en células K (Fig. 5B). Se encontró que el nivel de proteína VHL, un conocido ligasa E3 de HIF-aS, en las células K fue mayor en comparación con las células J en el núcleo, pero no citoplasma, que coincidió con la acumulación nuclear intensa de HIF-1α y HIF-2α en J células en condiciones hipóxicas (Fig. 5C). Además, examinó la interacción entre HIF-2α y VHL en extractos nucleares y se encontró que VHL nuclear en las células K interactuaba fuertemente con HIF-2α comparación con las células J para promover la ubiquitinación HIF-2α en el núcleo (Fig. 5D). Por otra parte, las células K revelaron poli-ubiquitinación de HIF-2α comparación con las células J que apoya el concepto de degradación acelerada de HIF-α en células K (Fig. 5E). Este hallazgo implica un posible papel de la BVS nuclear en la regulación de la estabilidad de HIF-aS en las células que sobreexpresan la isoforma-TCF-4.
Las células (A) fueron tratadas con 150 mM CoCl
2 durante 36 horas seguidas por incubación con o sin MG-132 (10 M) durante 2 h. Se emplearon lisados de células totales para el análisis de inmunoblot. Relativo expresión de HIF-aS se normalizó a la actina. (B) la estabilidad de la proteína de HIF-aS se evaluó mediante análisis de inmunotransferencia, donde las células se expusieron a 5 mg /ml de cicloheximida (CHX) para inhibir la síntesis de proteínas de 0 o 60 min a la última fase de la 48 hr CoCl
2 período de tratamiento. (C) Expresión de la BVS en las células TCF-4J y K. Las células se trataron 0 ó 150 mM CoCl
2 y las fracciones nucleares y cytoplamic se preparó para el análisis de inmunoblot. El nivel de expresión de HIF-2α y BVS se normalizó por la lamina (panel inferior); BVS-C, BVS citoplasmática. (D) La interacción entre la BVS y HIF-2α en el núcleo de las células K TCF-4J y. (E) polyubiquitination de HIF-2α en fracciones nucleares y citoplasmáticas de las células K TCF-4J y. Inmunoprecipitación (IP) /inmunoblot análisis (IB) se realizó mediante el uso de anticuerpos para HIF-2α y ubiquitina (Ub); *, La cadena pesada de IgG. Tenga en cuenta la disminución de la ubiquitinación de HIF-2α y débil interacción BVS-HIF-2α en las células J, que estaba en contraste con las observaciones en las células K.
TCF-4J isoforma expresión confiere un fenotipo de Tumorígeno Las células de HCC
El potencial tumorigénico de EV, J, K y las células se evaluó en ratones desnudos. Como podría predecirse a partir de la
in vitro
hallazgos, las células J eran altamente tumorigénicas. Aunque las células K generaron tumores pequeños, aparecieron más tarde (alrededor de 40 días) después de la inyección de células tumorales y creció muy lentamente (Fig. 6A). Las células de control (EV) no produjeron tumores como se informó anteriormente [24].
(A) experimento representativo que demuestra el desarrollo de tumores de xenoinjertos y tasa de crecimiento. EV2, control; J1, célula J; K2 y K5, K clones de células. expresión (B) de la proteína de las moléculas que se indican en los tumores J1 (1-5) y los tumores K2 (13-17) mediante análisis de inmunotransferencia. Nuclear (N) y las proteínas citoplasmáticas (C) expresadas en los 150 M CoCl células tratadas J-2
(Hypo-J) se utilizaron como controles positivos. (Panel inferior) TCF-4J y expresión K mRNA se verificó mediante RT-PCR en tumores J1 y K2;