Extracto
La aparición de cáncer de próstata resistente a la castración (CRPC) contribuye a la elevada mortalidad de los pacientes diagnosticados con cáncer de próstata (CaP), que en parte podría atribuirse a la existencia y la aparición de cáncer Las células madre (CSC). Estudios recientes han demostrado que la expresión desregulada de microRNAs (miRNAs) contribuye a la iniciación y progresión del CaP. Entre varios miRNAs conocidos, let-7 de la familia parece desempeñar un papel clave en la recurrencia y progresión del CaP mediante la regulación de células madre cancerosas; sin embargo, el mecanismo por el cual let-7 de la familia contribuye a la agresividad del CaP está claro. Potenciador de Zeste homólogo 2 (EZH2), un objetivo putativa de let-7 de la familia, se demostró para controlar la función de células madre. En este estudio, encontramos pérdida de let-7 con la familia correspondiente sobreexpresión de EZH2 en muestras de tejido de CaP humanos, especialmente en los tumores de grado de Gleason más altas. La sobreexpresión de let-7 por transfección de let-7 precursores disminución de la expresión EZH2 y reprimida capacidad clonogénico y la capacidad de formación de esferas de células de CaP, que era consistente con la inhibición de la actividad de la luciferasa EZH2 3'UTR. También se encontró que el tratamiento de células de CaP con BR-DIM (DIM formulado: 3,3, diindolylmetano por Bio respuesta, Boulder, CO, abreviado como BR-DIM) hasta reguladas let-7 y las reguladas expresión EZH2, consistente con la inhibición de la auto-renovación y la capacidad clonogénico. Por otra parte, la intervención del BR-DIM en nuestra fase II de ensayos clínicos en curso en los pacientes antes de la prostatectomía radical mostró regulación al alza de let-7 en consonancia con la baja regulación de la expresión de EZH2 en muestras de tejido de CaP después de la intervención BR-DIM. Estos resultados sugieren que la pérdida de let-7 mediada por el aumento de expresión de EZH2 contribuye a CaP agresividad, lo que podría ser atenuada por tratamiento BR-DIM, y por lo tanto es probable que tenga impacto clínico BR-DIM
Visto.: Kong D, E Heath, Chen W, Cher ML, Powell I, Heilbrun L, et al. (2012) Pérdida de let-7 hasta regula EZH2 en el cáncer de próstata consistentes en la adquisición de firmas cáncer de células que son atenuados por la BR-DIM tallo. PLoS ONE 7 (3): e33729. doi: 10.1371 /journal.pone.0033729
Editor: Masaru Katoh, Centro Nacional del Cáncer, Japón
Recibido: 15 Noviembre 2011; Aceptado: 16 de febrero de 2012; Publicado: 19 Marzo 2012
Derechos de Autor © 2012 Kong et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue financiado por una subvención del Instituto Nacional del cáncer, de los Institutos nacionales de Salud (5R01CA108535-06 y 5R01CA083695-08) adjudicado a FHS. (http://projectreporter.nih.gov/reporter_searchresults.cfm?&new=1&icde=4342569&loc=2&CFID=28929570&CFTOKEN=80568291). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata (CaP) es la segunda causa de muerte por cáncer en hombres en los Estados Unidos matando a más de 32.050 hombres en 2010 [1]. En los últimos diez años, se han producido mejoras significativas en las opciones de tratamiento quirúrgico para pacientes con diagnóstico de CaP localizado. La cirugía de próstata también se ha beneficiado de los avances técnicos y tecnológicos tales como los nervios y la prostatectomía prostatectomía robótica. La terapia adyuvante, que se define como un tratamiento adicional para reducir o eliminar la enfermedad local y distante, se ofrece a los pacientes [2], especialmente los que están en alto riesgo de recurrencia (como a menudo definida por los criterios de D'Amico de PSA & gt; 20 ng /ml, Gleason 8-10, y la etapa T2c a T4) [3].
La radioterapia y la terapia sistémica, especialmente la terapia de privación de andrógenos (ADT) se consideran como opciones terapéuticas adyuvantes razonables. Los pacientes en la categoría de alto riesgo tienen una tasa de recurrencia de más de 50% dentro de su vida, lo que es inaceptable. Sin embargo, una de las preocupaciones en ofrecer terapia adyuvante a todos los pacientes en el grupo de alto riesgo es que, aunque mayor que el 50% de los pacientes se repiten, hay 38-50% de los pacientes que no [4]. Para reducir la carga de exceso de tratamiento en este grupo de pacientes, se necesitan herramientas adicionales para identificar los verdaderos pacientes de alto riesgo. Las herramientas actuales que se están estudiando incluyen nomogramas predictivos [5] y los estudios que evalúan perfiles de expresión génica, que se han identificado algunos marcadores de la agresividad del tumor [6], [7], aunque estos hallazgos no se han traducido al control del paciente.
Desde la recurrencia del tumor y la metástasis contribuyen a la alta mortalidad, los estudios han sugerido que la agresividad del CaP podría estar estrechamente vinculados con la adquisición de las células madre del cáncer (CSC) o células madre similares (CSLCs) las características del cáncer. Nuevas evidencias sugieren que la expresión desregulada de muchos microRNAs (miRNAs) incluyendo la familia let-7 contribuye a la progresión del cáncer y la recurrencia [8]. Los microARN son una clase de ARN de aproximadamente 20 a 22 nucleótidos no codificantes en tamaño. Regulan expresiones de genes post-transcripcionalmente mediante la unión a un sitio en la región no traducida 3 '(3' UTR) del ARNm diana. Ellos se han demostrado para regular el ciclo celular, y el desarrollo y progresión del cáncer [9]. Let-7 fue descubierto y estudiado bien en Caenorhabditis elegans. El humano let-7 familia se compone de let-7a, 7b-dejar, let-7c, 7d-dejar, let-7e, 7f-dejar, let-7 g, let-7i y miR-98. La familia let-7 es comúnmente visto como un supresor de tumores consistente con la baja regulación de los oncogenes como Ras [10], grupo de alta movilidad A2 (HMGA2) [11] y c-myc [12] mediante la unión a 3'UTR estos ARNm diana. Por otra parte, la disminución de let-7 se encontró expresión en muchos tipos de cáncer, incluyendo CaP [13], y se ha relacionado con un mal pronóstico del paciente en el cáncer de pulmón [14], cabeza y cuello Carcinoma de células escamosas [15], y el cáncer de ovario [16 ].
Curiosamente, let-7 miembros de la familia se han demostrado para regular la capacidad de auto-renovación de las células de cáncer de mama [17] y células de CaP mediante el control de los factores asociados a las células madre como Oct4, Sox2, y Nanog expresión [18]. Estudios recientes también han documentado que vamos-7 podrían regular la expresión de Lin28 y Lin28B, que a su vez bloquea la acumulación de madura let-7 [19]. Esta regulación de la retroalimentación juega un papel crítico en la regulación de "stemness" mediante el control de la auto-renovación [20] - [23], que es la característica celular de células madre cancerosas o CSLCs asociados con la agresividad del tumor y la recurrencia. Estos resultados sugieren que la familia let-7 podría desempeñar un papel clave en la progresión del CaP mediante el mantenimiento y la regulación de las características moleculares de las CSC o CSLCs en el CP; Sin embargo, la forma let-7 de la familia contribuye a la agresividad del CaP es desconocido.
reforzador de Zeste homólogo 2 (EZH2) es uno de los objetivos de la familia let-7 de miRNAs, y que la expresión de la EZH2 es fuertemente asociado con las características moleculares de las dos células y células madre cancerosas o CSLCs madre normales. EZH2 es un N-metiltransferasa de histona-lisina, una subunidad del complejo represivo polycomb 2 (PRC2). Se sabe que los del grupo Polycomb de proteínas de estar involucrados en la regulación de la represión de genes a través de modificaciones de la cromatina, que es esencial para el mantenimiento de las células madre embrionarias y adultas [24], [25]. PRC2 contiene subunidades EZH2, SUZ12, EED, y la DRAP y este complejo se conoce para funcionar en las células madre embrionarias y adultas para reprimir los genes de desarrollo que se activan preferentemente durante la diferenciación [26]. Por otra parte, otros estudios han demostrado que PRC2 genes diana son co-ocupado por reguladores de células madre, tales como Oct4, Sox2, Nanog y [27]. Estudios recientes también han sugerido que las proteínas del grupo Polycomb no sólo son esenciales para el desarrollo embrionario sino que también desempeña un papel crítico en la iniciación del tumor y la progresión [25]. La sobreexpresión de EZH2 ha estado estrechamente vinculada con la progresión del cáncer en parte porque PRC2 inhibe la expresión de E-cadherina, que promueve la transición epitelio-mesenquimal transición (EMT) en las células del cáncer [28], un fenómeno que es una reminiscencia de las CSC o CSLCs. SUZ12 se ha encontrado para mediar en la inhibición de E-cadherina por snail1 [29]. Más importante aún, EZH2 regula directamente la metilación del ADN, al servir como una plataforma de contratación de ADN metiltransferasa [30]. En nuestro estudio anterior, se encontró que los niveles de ARNm y EZH2 SUZ12 se incrementaron en PC3 células PDGF-D (células EMT-fenotípica) en comparación con las células PC3 Neo [18]. Estos resultados sugieren claramente que PRC2 puede contribuir a EMT características de las células PC3 PDGF-D, que son coherentes con las firmas de los CAC o CSLCs que están asociados con la progresión del cáncer y la recurrencia.
anteriores estudios preclínicos de nuestro laboratorio han demostrado que el indol-3-carbinol (I3C) que se encuentra en los vegetales crucíferos y su
in vivo
metabolito 3,3, diindolylmetano (DIM) especialmente formulado el DIM (BR-DIM o B-DIM) que han utilizado para nuestra fase I de ensayos clínicos [31], son agentes potentes en la inhibición del crecimiento de células de CaP, que fue mediada por alteraciones en la señalización celular múltiple [32]. Nuestros resultados recientes mostraron que la BR-DIM causó la regulación positiva de miR-200b y MIR-200c que normalmente se pierde en células de CaP [33]. En el presente estudio, encontramos la pérdida de expresión de let-7 familia coherente con la sobreexpresión de EZH2 en CaP células y en muestras de tejido de CaP humanos, especialmente en los tumores con alto grado de Gleason. Los resultados del análisis de correlación mostraron que la expresión let-7 se asoció inversamente con la expresión EZH2 en pacientes con tumores de grado de Gleason más altas. Aquí también ofrecemos pruebas para el papel de la BR-DIM (DIM formulado: 3,3, diindolylmetano, abreviado como sea BR-DIM o B-DIM) en la regulación de let-7 y EZH2 en células de CaP como se documenta por nuestro hallazgos preclínicos, así como los resultados de nuestro ensayo clínico de fase II en curso en pacientes con CaP recibieron BR-DIM antes de la prostatectomía radical.
Materiales y Métodos
líneas celulares y condiciones de cultivo
LNCaP, C4-2B, y CWR22RV1 se mantuvieron en RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 10 mmol /L de Hepes, 50 unidades /ml de penicilina y 50 mg /ml de estreptomicina. Las líneas celulares estables que sobre-expresan el PDGF-D y pcDNA3 vector vacío se generaron mediante transfección de células PC3 con el pcDNA3-PDGF-D: Su o el correspondiente vector vacío pcDNA3 Neo como se ha descrito anteriormente y se refiere como PC3 Neo, o PC3 PDGF-D las células [34], respectivamente, a lo largo de este manuscrito. El PC3 Neo, PC3 PDGF-D, PC3, DU145 células se cultivaron en medio RPMI 1640 con 2 mmol /L de glutamina, 10 mmol /L de Hepes (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado con 5% de suero bovino fetal (FBS), 50 unidades /ml de penicilina, y 50 mg /ml de estreptomicina. células RWPE-1 PZ-HPV-7 y se adquirieron de ATCC (Manassas, VA). Estas células se cultivaron en medio de suero de queratinocitos libre (K-SFM) proporcionado por Invitrogen (GIBCO) y se suministra con 0,05 mg /ml de extracto de pituitaria bovina (BPE) y 5 ng /ml de factor recombinante humano de crecimiento epidérmico (EGF). Se mantuvieron todas las células en un 5% de CO
2-atmósfera humidificada a 37 ° C, y genotípicamente caracterizado para apoyar la autenticidad de estas células, lo cual era consistente con su origen.
Reactivos y anticuerpos
anticuerpo contra EZH2 fue adquirido de BD Biosciences (Bedford, MA). El anticuerpo para deshidrogenasa gliceraldehído 3-fosfato (GAPDH) se adquirió de Affinity Bioreagents (Golden, CO). De cabra anti-IgG de ratón (H + L) conjugado HRP se obtuvieron de Bio-Rad (Reinach, BL). BR-DIM, DIM formulado con mayor biodisponibilidad, fue proporcionado amablemente por el Dr. Michael Zeligs (abreviado como BR-DIM o B-DIM; Bio respuesta, Boulder, CO) y se disolvió en DMSO para obtener soluciones de 50 mmol /L de acciones y se almacena a -20 ° C en alícuotas de múltiples
in vitro
estudio.
Ética declaración
tejidos de los pacientes se recogieron después de haber recibido la aprobación de la Junta de Revisión Institucional de la Universidad Estatal de Wayne (IRB). Este protocolo clínico se clasifica como exentos#4 categorías bajo la política de NIH, porque este tipo de estudios son estudios retrospectivos que utilizan muestras de archivo. El IRB renunciado a la necesidad de consentimiento para el uso de las muestras de archivo, lo cual era consistente con las directrices de NIH, y las muestras se analizaron de forma anónima. muestras de tejido CaP de nuestro ensayo en curso clínico de la BR-DIM (B-DIM) de intervención antes de la prostatectomía radical también se obtuvieron después de recibir la aprobación del Consejo de Wayne State University de Revisión Institucional (IRB) y el consentimiento informado se obtuvo de todos los sujetos de estudio. Debido a que este estudio es un ensayo clínico convencional, el proceso IRB requerido por escrito su consentimiento de los pacientes antes de devengo en el ensayo clínico, que se coordina de forma rutinaria a través de la oficina de ensayo clínico (CTO). La aprobación a través del IRB implica que cumplan con los que consienten y la acumulación sin la cual los pacientes no pueden ser incluidos en el estudio, y por lo tanto nuestro estudio cumplían todas las directrices de cumplimiento requerido de la CTO y la IRB. El número de protocolo de ensayo clínico local es 2007-128, que se puede encontrar en el trials.gov clínico NIH. (Http://clinicaltrials.gov/show/NCT00888654). En el momento de la adquisición de muestras para la investigación actual, el protocolo de estudio acumulado 20 pacientes; Sin embargo, el estudio se ha acumulado un total de 33 pacientes. Se anticipa que vamos a cerrar este estudio con 37 pacientes a principios de 2012.
Pacientes y tejido prostático recogida de muestras
Después de obtener la aprobación de la junta de revisión institucional, pre-tratamiento de archivos retrospectivos tejidos con CaP y combinados tejidos normales adyacentes se obtuvieron a partir de muestras biológicas núcleo del Instituto del cáncer Karmanos (KCI) recogidos de los pacientes sometidos a prostatectomía radical en el período 2004-2010 KCI. También se obtuvieron muestras de tejido de PCA de nuestro ensayo en curso clínico de la BR-DIM (B-DIM) antes de la intervención de prostatectomía radical de pacientes recién diagnosticados con CaP 2009-2011 en KCI y Henry Ford Health System (HFHS), Detroit, Michigan . Fijado en formol (FFPE) los tejidos incluidos en parafina se cortaron para el análisis de miRNA y el ARNm. características clínicas de los pacientes se obtuvieron de la base de datos del hospital incluyendo la raza, como se muestra en la Tabla 1. Las características patológicas se determinó a partir de la evaluación microscópica del tumor diapositivas por patólogos, tanto en KCI y en HFHS. Se obtuvo la puntuación de Gleason (grado) en cada caso a partir de la base de datos clínicos.
ensayo clonogénico
C4-2B, PDGF-D PC3 y PC3 células PDGF-D transfectadas con el let-7 de la familia durante 24 h se recogieron después de tripsinización, y se resuspendieron en el medio completo. suspensiones de células individuales se sembraron en regulares de 10 cm de diámetro platos de Petri en la densidad de las colonias de 2.000 células por placa. Después de 2-3 semanas de incubación con el cambio de medio fresco cada 3-4 días, las colonias se tiñeron con violeta cristal para un 10 min adicionales, y se lavaron con 1 x PBS. Se fotografiaron las colonias.
Soft agar ensayo
se cosecharon y se suspendieron en medio de cultivo de células C4-2B. ensayo de agar blando se realizó como se ha descrito previamente por nuestro laboratorio [18]. Las células fueron tratadas con 10 o 25 mM BR-DIM con el cambio de medio fresco con la BR-DIM cada 3 días. Después de tres semanas de crecimiento, las colonias se tiñeron por incubación con 0,5 mg /ml de MTT durante 4 horas, y luego fueron fotografiadas (40 ×). Los números de colonias se contaron bajo un microscopio de contraste de fase. Los datos se presentan como el número de colonias (% de control).
auto-renovación de ensayo de la capacidad
Las suspensiones de células individuales de células PC3 C4-2B y PDGF-D se sembraron en pocillos adherentes ultra baja de 6 placas -bien (Corning, Lowell, MA) a 2000 células /pocillo en DMEM /F12 (Invitrogen) que contenía 1 × B27 y N2 (Invitrogen). estado de células individuales se confirmó bajo el microscopio. medio fresco con 10 o 25 mM se añadió cada 3-4 días. Después de una semana, el número de prostaspheres se contaron bajo un microscopio y los datos se presentan como números de esfera por 1000 células sembradas. Prostaspheres fueron fotografiadas (40 ×) bajo un microscopio de contraste de fase.
Análisis de transferencia Western
lisados de células totales se obtuvieron mediante la lisis de las células en tampón RIPA. La concentración de proteína se determinó utilizando el ensayo de proteína BCA (Pierce, Rockford, IL). Western Blot se realizó como se describió anteriormente [35].
miARN y transfección
Las células fueron transfectadas con 40 nmol /L de let-7 miARN precursores o control negativo precursores#1 (Ambion, Austin , TX) usando el reactivo de transfección DharmaFECT3 (Dharmacon, Lafayette, CO). Después de 1 día de la transfección, se trypsonized las células, y se resuspendieron en el medio completo. suspensiones de células individuales se confirmaron con un microscopio para el ensayo clonogénico. Además, después de 3 días de la transfección, los lisados celulares se prepararon para el análisis de Western blot.
luciferasa actividad ensayo
células PC3 PDGF-D con niveles más bajos de let-7 se sembraron a una densidad de 6 x 10
3 células /pocillo en una placa de 96 pocillos y se incubaron durante 24 h. Las células fueron co-transfectadas con EZH2 3'UTR luciferasa plásmido (Origene, Rockville, MD) o plásmido de luciferasa de Renilla y controlar miARN, let-7a, 7b-dejar, let-7c, 7d y dejar-precursores utilizando el reactivo de transfección dúo DharmaFECT (Dharmacon, Lafayette, CO). Después de 48 h de incubación, la actividad de luciferasa se ensayó usando Steady-Glo Luciferase Assay System (Promega). La actividad de luciferasa de Renilla se utilizó como control para la eficiencia de transfección.
Real-time RT-PCR
Para la determinación de los niveles de ARNm, se aisló el ARN total de las células usando el RNeasy Mini Kit (Qiagen ) y el ADN se eliminó usando un kit NDase libre de RNasa (Qiagen). Un microgramo de ARN se transcribe de forma inversa en ADNc usando una alta capacidad (Applied Biosystems, Fostor, CA) de ARN a ADNc kit de acuerdo con las instrucciones del fabricante. PCR se realizó como se describe anteriormente [18]. La cantidad relativa de mRNA se normalizó a la expresión de GAPDH. Para el ensayo de los niveles de miARN, el ARN total de las células se aisló utilizando el kit de miRNeasy Mini (Qiagen) y el ADN se eliminó usando un kit NDase libre de RNasa (Qiagen). 20 ng de ARN se transcribe de forma inversa en ADNc usando un kit universal de cDNA Synthesis (Exiqon, Woburn, MA) según las instrucciones del fabricante. PCR en tiempo real se realizó utilizando cebadores específicos de genes miARN (Exiqon) para cuantificar la expresión de los genes miARN utilizando SYBR verde reactivos de RT-PCR (Applied Biosystems). La cantidad relativa de los genes miARN se normalizó a la expresión de RNU48. Para determinar los niveles de mRNA o miARN en los tejidos de pacientes de cáncer de próstata, el ARN total fue aislado a partir de tejidos FFPE utilizando miRNeasy FFPE Kit (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. ensayo de RT-PCR para la expresión de los genes miARN y el ARNm se evaluó como anteriormente. La cantidad relativa de mRNA se normalizó a la expresión de beta-actina y cantidad relativa de los genes miARN se normalizó a la expresión de RNU1A.
Microarray para el perfil de miARN en los tejidos de pacientes de cáncer de próstata
miARN microarray así como se llevaron a cabo análisis de datos siguiendo los procedimientos tal como se describe anteriormente por Kong et al [18].
Todos los datos son MIAME compatible y que los datos en bruto ha sido depositado en una base de datos compatible con MIAME. número de acceso GEO es GSE34310.
Métodos estadísticos
Los experimentos presentados en las cifras de los estudios de líneas celulares son representativos de tres o más repeticiones independientes. Los datos se presentan como la media y la desviación estándar (SD) en los gráficos de barras. Los datos de miRNA y de ARNm de muestra de tejido del paciente se transforman registro antes del análisis. Las comparaciones de las variables continuas entre dos grupos independientes se hicieron usando la prueba de suma de rangos de Wilcoxon. Para grupos relacionados emparejados (es decir, los tejidos normales y los tejidos tumorales G6 emparejadas), el signo de Wilcoxon se utilizó la prueba de rangos. Las correlaciones de Spearman se utilizaron para describir el grado de relación lineal entre dos variables. prueba estadística de significación de la correlación se basa en la aproximación que
t
distribución. Todas las pruebas estadísticas fueron de dos caras al nivel de significación de 0,05 a menos que se especifique lo contrario. Para reducir la falsa positividad, en otras palabras, controlan el error de tipo I familia de sabios, en este estudio exploratorio primera fase preliminar, se utilizó valores p ajustados a la tasa de falso descubrimiento elevador de dos etapas (FDR) método de control [36] . Una tasa de error nominal para estimar el número de verdaderos hipótesis nulas en el procedimiento de dos etapas FDR se fijó en 0,05.
Resultados
Expresión de la familia let-7 se perdió en el cáncer de próstata ( muestras de tejido del CP): perfil
para determinar los niveles de la familia let-7 en muestras de tejido de CaP, se recogieron los tejidos pre-tratamiento con CaP y especímenes emparejados adyacentes normales de tejido (utilizado como control para la comparación con los tejidos tumorales). Los resultados de la expresión de los genes miARN por perfiles de expresión mircroarray mostraron que todos los miembros de la familia let-7 (miR-98 era indetectable) disminuyeron en los tejidos de CaP en comparación con los especímenes adyacentes normales de tejido (Fig. 1A). Por otra parte, se encontró que la expresión de let-7a, 7b-deje, let-7c y 7d-deje eran medibles con precisión en comparación con otros miembros de la familia debido a que sus expresiones eran muy bajos (Fig. 1A). Por lo tanto, hemos determinado y se confirmó la expresión de let-7a, 7b-vamos, let-7c, 7d y dejar-en todos los casos, incluyendo 129 muestras de tejido de próstata y 94 muestras de tejidos normales adyacentes. Descubrimos que la expresión de la familia de let-7 en tejidos de la próstata histológicamente normales de grado de Gleason 7 o superior tumor se redujo en comparación con el tejido normal histológicamente de Gleason 6 tumores (datos no presentados), lo que sugiere que los tejidos normales histológicamente de la próstata glándula de los pacientes con tumores de grado alto no son normales. Por lo tanto, tomamos normales de la próstata de todos los pacientes diagnosticados con tumores de grado 6 para su posterior análisis y la usamos como "control de tejido normal". Hemos observado que las expresiones de la familia let-7 en grado 6 tumores no son estadísticamente diferentes en comparación con el control normal. Sin embargo, encontramos una significativa disminución de la expresión de let-7a, 7b-dejar, let7c y dejar-7d en el CaP con el grado de Gleason 7 o más tumores en comparación con el tejido normal de control (fig. 1B). Estos resultados sugieren que la pérdida de let-7 de la familia podría estar asociada con CaP agresividad especialmente debido a que los tumores de grado más bajo no eran diferentes del control de tejido normal, mientras que los tumores de grado alto eran diferentes.
(A) Microarray de perfiles se realizó para evaluar la expresión de los genes miARN utilizando ARN total extraído de tres muestras de tejido de CaP y tejidos de próstata normales adyacentes emparejados. Los resultados mostraron que el let-7a, let-7b, let-7c y let-7d fue altamente expresado en los tejidos de la próstata y su expresión se perdió en muestras humanas de tejido PCA (* P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01). (B) Los resultados de tiempo real de RT-PCR confirmó que los niveles de let-7b, 7c y dejar-dejar-7d fueron significativamente regulada hacia abajo en los tumores con alto grado de Gleason. (7a: let-7a; N: normal; TG6: tejidos tumorales de pacientes con Gleason 6. n = 39 para el normal, n = 44 para TG6, n = 52 para TG7, n = 33 para TG8, 9). (C) Una regulación significativa de la expresión de EZH2 se observó en muestras de tejido de CaP con Gleason 7 (n = 46) y superior (n = 33), pero no en el CaP muestras con Gleason 6 (n = 39) . (D) los niveles de EZH2 se correlacionaron inversamente con let-7b y 7c-permiten expresiones en muestras de tumores con grado de Gleason 7.
Expresión de EZH2 se incrementó en muestras de tejido de CaP y se correlacionó inversamente con la expresión de la familia let-7
Dado que la expresión de la familia let-7 se perdió en los tejidos con CaP de los pacientes con mayor grado de Gleason, se plantea una cuestión de cómo la familia let-7 podría regular la agresividad del CaP. Hemos buscado objetivos de la familia let-7 utilizando el software TargetScan y se encontró que EZH2 podría ser regulada por la familia let-7 porque hay un sitio de unión específico en el 3'UTR de ARNm EZH2. Por lo tanto, hemos evaluado la expresión de mRNA en tejidos EZH2 CaP. Nuestros resultados mostraron que la expresión EZH2 se incrementó en muestras de tejido de CaP con Gleason 7 y mayor en comparación con el control de tejido normal (Fig. 1C). La expresión de let-7b y 7c-dejar que se correlaciona inversamente con la expresión EZH2 con r = -0,36 (IC del 95%: -0.61 a -0.06), p = 0,0414 yr = -0.43 (IC del 95%: -0,65 a - 0,15), p = 0,0132, respectivamente (Fig. 1D). Estos resultados sugieren que la pérdida de let-7 podría ser responsable de una mayor expresión de la EZH2.
Let-7 EZH2 expresión reprimida y el crecimiento clonogénico inhibe las células de CaP
Se examinó la expresión de EZH2 en líneas celulares de CaP y inmortalizado líneas de células epiteliales de próstata, y se encontró que EZH2 se expresó en células de cáncer de próstata en niveles relativamente altos en comparación con líneas de células epiteliales de próstata inmortalizadas: PZ-HPV-7 y las células RWPE-1 (figura 2A, panel superior. ). A fin de determinar la consecuencia biológica de la expresión de la familia let-7 en la regulación de la expresión EZH2, transfectadas las células PC3 y PC3 PDGD-D con let-7 precursores, y los resultados mostraron que permiten-7 miembros de la familia podrían inhibir significativamente la expresión de EZH2 en estas dos líneas celulares (Fig. 2A, medio e inferior del panel). Estos resultados sugieren que la familia let-7 regula la expresión de EZH2. Con el fin de obtener una mayor comprensión mecanicista, hemos probado si vamos-7 podrían reprimir directamente la expresión de EZH2 mediante la unión a 3'UTR de ARNm EZH2. Nos co-transfectadas EZH2 3'UTR plásmido luciferasa y let-7 precursores, y se encontró que let-7a, 7b-dejar, let-7c, y dejamos-7b podría inhibir fuertemente la actividad de luciferasa EZH2 3'UTR en comparación con la transfección de células con control de miARN (Fig. 2B). El let-7 sitios en el 3'UTR del ARNm EZH2 unión se muestra en la Figura 2C. A continuación, prueba la consecuencia biológica de las células transfectadas con pre-let-7 de la familia y se evaluó el crecimiento clonogénico como indirecta
in vitro
medida de la agresividad del tumor. Se encontró que la sobreexpresión de let-7 familia inhibió significativamente el crecimiento clonogénico de células PC3 PDGF-D, que inicialmente mostró menor expresión de let-7 (Fig. 2D). Sin embargo, actualmente no existe un método que podría ser clínicamente útil para la regulación al alza de miRNAs perdidos. Con este fin, hemos probado nuestra hipótesis comprobando si BR-DIM podría ser útil para la regulación al alza de miRNAs.
(A) se encontró que la expresión de la EZH2 a ser mayor en las líneas celulares de CaP en comparación con las células epiteliales de próstata inmortalizado líneas: PZ-HPV-7 y RWPE-1 (panel superior) y la transfección de let-7 precursores inhibidas expresión EZH2 en PC3 y las células PC3 PDGF-D 3 días después de la transfección (en el medio y el panel inferior). (B) let-7 miembros de la familia reprimió la actividad de luciferasa EZH2 3'UTR en células PC3 PDGF-D (niveles inferiores de let-7 de la familia en estas células) co-transfectadas con let-7 y el plásmido de luciferasa EZH2 3'UTR. (C) let-7 sitios en el 3'UTR de ARNm de unión EZH2 se muestra. (D) La transfección de let-7 precursores redujo significativamente la capacidad de crecimiento clonogénico de células PC3 PDGF-D (CON: control, 7a: pre-let-7a, ** p & lt; 0,01) guía empresas
BR. -DIM tratamiento condujo a la regulación positiva de la familia let-7 y por lo tanto las reguladas la expresión de EZH2 en células de CaP
en el presente estudio, se encontró que el tratamiento BR-DIM aumentó la expresión de let-7 familia en varias líneas celulares de CaP incluyendo LNCaP, C4-2B y células PC3 (Fig. 3A y la Fig. S1A-C). Además, el tratamiento BR-DIM también condujo a la disminución de la expresión de mRNA EZH2 (Fig. 3B) y la proteína en diferentes líneas celulares de CaP y en diferentes puntos de tiempo (Fig. 3C, 3D y la Fig. S1D). Por otra parte, es más interesante, los datos de nuestro constante de fase II de ensayos clínicos mostraron que el tratamiento BR-DIM de los pacientes con CaP antes de la prostatectomía radical condujo a la mayor expresión de let-7a, 7b-dejar, let-7c, y let- 7d en las muestras de tumor después de la intervención BR-DIM (Fig. 4A-C), y estos resultados son consistentes con disminución de la expresión de EZH2 (Fig. 4D). Por lo tanto, nuestros resultados sugieren que la BR-DIM podría ser un agente importante volver a expresar los miRNAs perdidos especialmente la familia let-7, lo que reduciría el nivel de EZH2 de expresión y de compromiso células madre cancerosas o CSLCs función.
( a) ARN total fue aislado de LNCaP, C4-2B y células PC3 tratadas con 25 mM BR-DIM para 24 h y los resultados de tiempo real RT-PCR que muestran que la expresión de let-7 se aumentó después del tratamiento BR-DIM comparó con el control sin tratar (c: control de DMSO). (B) Los niveles de mRNA de la EZH2 fueron reprimidos por el tratamiento BR-DIM más malo en un dependiente de la dosis. (C y D) Los lisados celulares se prepararon a partir de células tratadas con BR-DIM durante 48 h y Western blot que muestra los niveles de la proteína EZH2, que fue reducido regulado por el tratamiento BR-DIM (PD PC3: células de PDGF-D PC3, *, p & lt; 0,05; **, p. & lt; 0,01) guía empresas
ARN se obtuvo a partir de muestras de ensayos clínicos de intervención BR-DIM donde se administró la BR-DIM a los pacientes durante 2-4 semanas antes de la cirugía . ARN también se obtuvo a partir de muestras (FFPE) tejido fijado con formalina en parafina de pacientes con CaP con tumor emparejado grado de Gleason, el estadio del tumor y la edad del paciente como grupo de control. La expresión de miRNAs y el ARNm se evaluó usando el tiempo real de RT-PCR. Los niveles relativos de ARNm de los genes miARN y se normalizaron a RNU1A1 y beta-actina, respectivamente. (A) la intervención BR-DIM condujo a la mayor tendencia en los niveles de expresión let-7a. (B y C) let-7b, 7c let-let-7d y fueron significativamente hasta reguladas por la intervención del BR-DIM. (D) la expresión EZH2 se había reducido regulado por la intervención del BR-DIM.
BR-DIM tratamiento inhibe la auto-renovación y la capacidad clonogénico de células de CaP
Para probar si la BR-DIM podría regular la capacidad de auto-renovación y la capacidad clonogénico de células de CaP, hemos realizado ensayos de formación de esferas y se encontró que el tratamiento de células PC3 C4-2B y PDGF-D con 10 o 25 mM BR-DIM reduce notablemente el número y el tamaño de prostaspheres comparación con el control sin tratar (control DMSO) (Fig. 5A). Por otra parte, el tratamiento BR-DIM también inhibe la capacidad de crecimiento clonogénico de líneas celulares de CaP células PC3 C4-2B y PDGF-D (Fig. 5B). Los resultados de ensayo de agar blando demostraron además que el tratamiento de células C4-2B con 10 o 25 M BR-DIM redujo el tamaño de las colonias y números (Fig. 5C y 5D), sugiriendo que la BR-DIM podría eliminar células tumorales especialmente las células con CSC o CSLCs características por hasta la regulación de let-7 de la familia y en consecuencia por abajo de la regulación de la expresión de EZH2.
(a) suspensiones de células individuales de células PC3 C4-2B y PDGF-D se sembraron en la ultra pozos de baja adherencia de la placa de 6 pocillos a 2000 células /pocillo en DMEM /F12 suplementado con B27 y N2 y con 10, 25 M BR-DIM y se incubaron durante 6 días. números Prostasphere se redujeron mediante tratamiento BR-DIM (panel superior).