Extracto

células madre mesenquimales derivadas de médula ósea (MSC) son capaces de migrar a los tumores, en los que promueven la tumorigénesis y metástasis del cáncer. Sin embargo, sigue siendo en gran parte desconocida del fenotipo molecular de las MSC reclutados en el microambiente del tumor y los programas genéticos que subyacen a su papel en la progresión del cáncer. Mediante el uso de un sistema de co-cultivo recipiente de pared giratorio en tres dimensiones en el que las MSC humanas se cultivaron solo o en estrecho contacto con las líneas celulares LNCaP, C4-2 o cáncer de próstata PC3, establecimos
en

in vitro
pares coincidentes de los derivados normales y asociadas al cáncer de MSC para estudiar la respuesta del estroma de MSCs con el cáncer de próstata. Hemos observado que las MSC asociado a cáncer de próstata adquirido un mayor potencial de diferenciación adipogénica y exhibió una capacidad más fuerte para promover la migración de células de cáncer de próstata y la invasión en comparación con MSCs normales tanto
in vitro
y en modelos animales experimentales. La adipogénesis mejorada y las propiedades pro-metastásicos fueron conferidas por los altos niveles de secreción de IL-6 por las MSC asociados con el cáncer y fueron reversibles mediante la inhibición funcional de la IL-6. También se encontró que la IL-6 es un gen diana directa para el micro ARN let-7, que fue regulado por disminución en las MSC asociados con el cáncer. La sobreexpresión de let-7 a través de la transfección de let-7 precursores disminución de IL-6 expresión y reprime la actividad potencial y la metástasis de promoción de adipogénica de las MSC asociados con el cáncer, que era consistente con la inhibición de la IL-6 la actividad de luciferasa 3'UTR . Por el contrario, el tratamiento de MSCs normales con let-7 inhibidores resultó en efectos similares a los observados con IL-6. Tomados en conjunto, nuestros datos demuestran que las MSC co-evolucionar con células de cáncer de próstata en el microambiente del tumor, y la regulación a la baja de let-7 por el MSC asociado al cáncer favorece la expresión de IL-6 expresión. Esta regulación positiva activa la adipogénesis y facilita la progresión del cáncer de próstata. Estos resultados no sólo proporcionan información clave sobre las bases moleculares de las interacciones tumor-estroma sino también allanar el camino para nuevos tratamientos para el cáncer de próstata metastásico

Visto:. Sung SY, Liao CH, Wu HP, Hsiao WC, Wu IH, Jinpu, et al. (2013) Pérdida de let-7 microARN favorece la expresión de IL-6 en células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea del estroma que provocó una respuesta reactiva a cáncer de próstata. PLoS ONE 8 (8): e71637. doi: 10.1371 /journal.pone.0071637

Editor: Ching-Ping Tseng, Universidad Chang Gung, Taiwán

Recibido: 18 de abril de 2013; Aceptado: 30 de junio de 2013; Publicado: 19 Agosto 2013

Derechos de Autor © 2013 Sung et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas NSC 101-2314-B-039-007, NSC 99-2320-B-039-029-MY3 y NSC 99-2632-B-039-001-MY3 del Consejo Nacional de Ciencia de Taiwán, conceder DOH102 -TD-C-111-005 del Departamento de Salud de Taiwán, y la Fundación de cáncer de la Universidad a través de SINF del MD Anderson Cancer Center, EE.UU.. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

el hueso es el segundo sitio más común de metástasis del cáncer humano [1], y también contribuye directamente a la mortalidad por cáncer de próstata y la morbilidad, con más del 85% de los pacientes que mueren de cáncer de próstata con metástasis óseas [2] , [3]. La calidad de vida de pacientes con cáncer de próstata puede verse comprometida de manera significativa por las metástasis óseas, mediante el desarrollo de dolor de huesos, fracturas óseas asociadas con el cáncer y compresión de la médula, la médula de metástasis-evocó neuropatía craneal de la base de los síndromes cráneo, la anemia y la infección [4] , [5]. A pesar de las graves complicaciones de cáncer de próstata metástasis ósea, ha habido pocos avances en el campo terapéutico para prevenir o disminuir estas lesiones [6]. Es fundamental que una sólida comprensión de la fisiopatología del proceso de metástasis ósea del cáncer de próstata se ha desarrollado para proporcionar la base para la creación de estrategias para prevenir o disminuir su incidencia y complicaciones asociadas.

Las investigaciones han proporcionado pruebas de que el tumor microambiente interacciones son cruciales en la oncogénesis y la progresión del cáncer, como se describe por primera vez en 1889 por Paget que propuso que la siembra de las células cancerosas metastásicas depende del microambiente órgano host (el concepto de "semillas y el suelo") [7]. Aunque la mayoría de las células huésped en el estroma poseen ciertas capacidades supresoras de tumores, la progresión de los carcinomas a tumores malignos de alto grado se acompaña de profundos cambios histológicos en el estroma asociado al tumor. Estos cambios incluyen el cambio fenotípico estroma celular, remodelación de la matriz extracelular y la inducción de la angiogénesis [8], [9]. El desarrollo de un microambiente estromal alterada en respuesta a un carcinoma es una característica común de muchos tumores y es probable que promueve tumores. Durante el proceso de la invasión del cáncer de próstata, por ejemplo, las células cancerosas epiteliales tienen la capacidad de promover la llamada respuesta estroma "reactivo" a través de la transdiferenciación de fibroblastos normales al fenotipo de miofibroblastos reactiva. A diferencia de los fibroblastos normales, miofibroblastos reactivos coche más cambios genéticos y la expresión de genes en células de cáncer de próstata, lo que permite el crecimiento y supervivencia del tumor y la diseminación a órganos distantes con efectos letales [10] - [13]. Perfiles de expresión génica de muestras clínicas reveló alteraciones genéticas simultáneas e independientes de las del estroma y el cáncer de células epiteliales [14], [15], lo que confirma la coevolución de cáncer y del estroma respuestas celulares. estudios clinicopatológicas también han demostrado un papel crítico para el estroma reactivo en el resultado postoperatorio de pacientes [16] - [18]. La comunicación intercelular intrincada entre los elementos epiteliales y estromales sugiere la importancia de las vías epigenéticas en la facilitación de la progresión del cáncer de próstata en lugar de un proceso directo simplemente atribuido a las células cancerosas por sí solos.

En modelos de ratón, así como en los seres humanos han informado que las células del estroma del tumor pueden derivarse de células progenitoras derivadas de la médula ósea que se pueden movilizar en la circulación, migrar hacia los tumores, incorporar en el microambiente tumoral y contribuir al crecimiento de diversos tumores [19] - [21]. células madre mesenquimales derivadas de médula ósea (MSC) son células precursoras mesenquimatosas multipotentes que contribuyen al mantenimiento y regeneración de una variedad de tejidos conjuntivos, incluyendo el hueso, adiposo, cartílago y músculo [22]. Recientemente, MSCs circulantes se han demostrado para integrar en y persistir en el estroma del tumor [23], proporcionando una plataforma novedosa para selectivo
in vivo
administración de agentes contra el cáncer para tumores invasivos y metástasis [24] - [27] . Las interacciones entre los MSCs y las células tumorales no se limitan a homing pero también parecen inducir más efectos adversos. Muchas observaciones indican que, en el microambiente tumoral, MSCs tienen varias funciones crecimiento del tumor, incluyendo la promoción de la expresión de factores de crecimiento [28], la promoción de la formación de vasos del tumor [29] y la creación de nichos de células madre del cáncer [30]. Sin embargo, sigue siendo desconocida, principalmente el fenotipo molecular de las MSC reclutados en el microambiente del tumor y los programas genéticos que subyacen a su propiedad en la progresión del cáncer. La comprensión de cómo se alteran las MSC de nuevo ingreso durante la progresión tumoral y cómo influyen recíprocamente progresión neoplásica puede conducir al desarrollo de nuevas terapias dirigidas a reducir la formación de metástasis.

En el presente estudio, hemos centrado en definir si las MSC de médula ósea "co-evolucionar" con las células epiteliales de cáncer de próstata a través de la interacción recíproca de tumor estromal. Los mecanismos moleculares de roles y específicas de las MSC reactivos en la progresión del cáncer de próstata también fue dilucidada.

Materiales y Métodos

Ética Declaración

Se llevaron a cabo los estudios en animales en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y uso de Animales de laboratorio de los Institutos nacionales de Salud. El protocolo fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Medicina China (IACUC#101-76-N). Toda la cirugía se realizó bajo Zoletil (tiletamina-zolazepam) anestesia a una dosis de 20 mg /kg por inyección intraperitoneal. Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento.

Líneas celulares y cultivo celular

Todos los medios de cultivo celular y reactivos fueron adquiridos de Invitrogen (Carlsbad, CA). Las líneas celulares de cáncer de próstata LNCaP, PC3 C4-2 y se utilizaron en estudios previos [13], [31] y se cultivaron en medio suplementado con suero T 5% fetal bovino (FBS). MSCs hueso humano derivadas de médula (hMSC) y células epiteliales de próstata humanos normales (PrEC) adquiridos a Lonza (Rockland, ME) se mantuvieron en MSCGM ™ y PrEGM ™, respectivamente, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Lonza). La línea celular derivada de la médula MSC 3A6 hueso humano [32] se mantuvo en medio DMEM-LG suplementado con 10% FBS. Para tridimensional (3-D) cocultivo, 1 × 10
7 3A6 células se cultivaron solos o mezclados con números iguales de LNCaP, C4-2 o células PC3 en un recipiente de pared giratorio sistemas (RWV) (Synthecon, Houston , TX) siguiendo el protocolo establecido previamente [33] con modificaciones menores. Brevemente, se añadió la suspensión de células individuales a los buques que luego fueron cubiertas con 10 ml de medio compuesto por medio de T y DMEM-LG (01:01). La rotación de los vasos se estableció inicialmente en 15 a 20 rpm y luego se aumentó a mantener los agregados de células en suspensión libre. El medio se cambió cada 3 días. Para aislar las células 3A6 de tumoroids quiméricos 3-D, los agregados de células fueron cosechadas de la RWV y disociadas con tripsina 0,25% después de 2 semanas de co-cultivo. 3A6 células fueron seleccionados por la selección de antibióticos con 800 mg /ml de G418 durante 1 semana.

La diferenciación de las MSC

3A6 células MSC se sembraron en placas de 6 pocillos a una densidad de 10
4 células /cm
2 para la inducción de la diferenciación osteogénica y adipogénica en condiciones de cultivo específicas. Para la diferenciación osteogénica, las células fueron cultivadas en medio de diferenciación osteogénica compuesto de DMEM-LG con FBS, 10 nM de dexametasona, ácido ascórbico 10% 50 mg /ml, y 10 mM β-glicerofosfato durante 14 días y después se sometieron a rojo de alizarina S tinción, como se describe anteriormente [32]. Para la diferenciación adipogénica, las células se cultivaron en medio de diferenciación adipogénica compuesto de DMEM-LG suplementado con 10% de SFB, 100 nM de dexametasona, 0,45 mM 3-isobutil-1-metilxantina, 10 mg /ml de insulina, y 50 mg /ml indometacina para 21 días, y después se sometieron a tinción con Oil Red O. La formación de los adipocitos se controló por la aparición de gotitas de lípidos con un microscopio. Para cuantificar la tinción, Aceite Rojo-O se extrajo con isopropanol que contiene 4% Nonidet P-40 y se mide como absorbancia a una longitud de onda de 510 nm. Todos los productos químicos fueron adquiridos de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).

-PCR cuantitativa en tiempo real

Total RNA celular y enriquecieron las especies pequeñas de ARN que contienen microARN (miARN) fueron aisladas de culta células utilizando el kit mirVana miARN Aislamiento (Ambion, Austin, TX) siguiendo el protocolo del fabricante. cDNA fue sintetizado a partir de ARN pequeño enriquecido y el ARN total recocido con tallo-bucle revertir cebadores de la transcripción (RT) y cebadores aleatorios, respectivamente, y a transcripción inversa con transcriptasa MMLV (Invitrogen) inversa. PCR cuantitativa se realizó usando el kit TaqMan maestro LightCycler 480 con miRNA- o cebadores específicos del gen y la correspondiente sonda Biblioteca universal de la sonda (Roche Ciencias Aplicadas, Mannheim, Alemania). Los cebadores de tallo-bucle RT, los cebadores de PCR y sondas fueron diseñados y secuencias se muestran en la Tabla S1. La reacción de PCR en tiempo real se llevó a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se describe en un estudio anterior [34]. U6 pequeños ARN nucleares y de choque térmico de 90 kDa proteína 1, beta (HSPCB) fueron utilizados como genes de limpieza para normalizar la expresión de cada gen y miARN, respectivamente.

citoquinas anticuerpos de la matriz y ELISA

los niveles de expresión de diversas citoquinas en el medio acondicionado se midieron utilizando una matriz de citoquinas Human Antibody C Series 2000 kit (RayBiotech, Norcross, GA) como se describe anteriormente [27]. interleuquina humana 6 (IL-6) niveles de proteína en el medio condicionado se cuantificaron utilizando kits de ELISA comerciales (eBioscience, San Diego, CA) según las instrucciones del fabricante.

Oligonucleótido Transfección

3A6 células eran sembraron a 2 × 10
placas /pocillo en 5 de 6 pocillos y se incubaron las células durante la noche. Las células fueron transfectadas con cualquiera de pre-miRNAs (control negativo pre-MIR y pre-miR-let-7c) (Ambion, Austin, TX) o los inhibidores de la LNA ™ miARN (control negativo anti-MIR y anti-miR-let-7 ) (Exiqon, Vedbaek, Dinamarca) a una concentración final de 10 nM o 30 nM, respectivamente, utilizando el reactivo de transfección DharmaFECT (Dharmacon, Lafayette, CO) según las instrucciones del fabricante.

vectores indicadores y de ensayo de luciferasa

los oligonucleótidos de la elemento de reconocimiento putativo let-7c, ya sea de tipo salvaje o la secuencia mutante, en los nucleótidos 316 a 322 de la región 3 'no traducida (3'-UTR) de la IL-6 humana gen se diseñaron con flanqueando los sitios HindIII y SpeI y sintetizada. Después del recocido los oligonucleótidos sentido y antisentido, los fragmentos de ADN resultantes se clonaron en el vector PMIR-INFORME-Luc (Ambion) después HindIII y SpeI digestión. Los plásmidos resultantes PMIR-INFORME-Luc se mezclaron con pCMV-β-gal (galactosidasa) en una relación molar 05:01 y fueron co-transfectadas con el pre-miRNAs en células HEK 293. Después de 24 h de incubación, los extractos de células se prepararon para la luciferasa y β-gal ensayos de actividad utilizando el sistema de ensayo de luciferasa y β-galactosidasa Enzyme sistema de ensayo (Promega, Madison, WI). La actividad luciferasa relativa se calculó dividiendo las unidades de luz relativas de luciferasa por el valor correspondiente para la actividad β-gal presente en cada muestra.


in vitro
migración y la invasión de ensayo

hMSCs o 3A6 derivados (2 × 10
5 células) se cultivaron en la cámara inferior de los cultivos polarizados con RPMI-1640 sin suero (Invitrogen). Después de 24 h de incubación, las células cancerosas 2 × 10
5 de la próstata en suero libre de RPMI-1640 se añadieron a la cámara superior que contiene un filtro de policarbonato de 8-m-poro que se revistió con (invasión) o sin (migración) Matrigel (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Después de 16 h de incubación, las células en la superficie inferior de la membrana se tiñeron con violeta cristal y se contaron bajo un Zeiss Axiovert 200 microscopio de fluorescencia (Carl Zeiss MicroImaging, Thornwood, NY) con un objetivo de 10x.

Estudios en animales

Seis semanas de edad ratones desnudos macho (BALB /cAnN.Cg-Foxn1nu /CrlNarl) se obtuvieron del Laboratorio Nacional Centro de Animales (Taipei, Taiwán). 1 × 10
6 células PC3, ya sea solos o mezclados con igual número de 3A6
RWV o 3A6
células PC3 en 100 l de PBS, se inyectaron por vía subcutánea en los flancos de los ratones (
n =
10 en cada grupo). mediciones de volumen del tumor se tomaron semanalmente. Los ratones fueron sacrificados 10 semanas después de la inoculación de células, y los tumores estaban emocionados por el examen histopatológico.

La inmunohistoquímica

Se detectó la proteína específica en las secciones del tumor utilizando un sistema de detección de polímero Novolink (Leica Microsystems, Newcastle Upon Tyne , Reino Unido) siguiendo las instrucciones del kit como se ha descrito anteriormente [35]. Los anticuerpos monoclonales de ratón contra ki-67 y CD31 se compraron de Leica Microsystems y se diluyeron 1:100 y 1:200, respectivamente. Para detectar los lípidos, los portaobjetos de tejido se deshidrataron con propilenglicol absoluta de 5 min y se tiñeron con solución de rojo O Aceite 0,5% durante 48 h. Muestras de tejido fueron contra el teñidas con hematoxilina.

Análisis estadístico

Todos los datos se presentan como la media ± SD a menos que se especifique lo contrario. Las diferencias entre grupos se analizaron usando de Student de dos colas
t-test
o ANOVA de una vía para comparaciones múltiples. Un
p-valor
inferior a 0,05 se definió como estadísticamente significativo.

Resultados

Establecimiento de parejas de normal y MSC asociada al cáncer de próstata quimérico Tumoroids Bajo 3- D RWV Condiciones

de acuerdo con varios informes anteriores que las MSC poseen intrínseca capacidad migratoria preferencial a algunos tumores epiteliales, hemos demostrado la capacidad de migración de las MSC derivadas de médula ósea humana hacia las células del cáncer de próstata, pero no en las células epiteliales normales de la próstata en un
in vitro
co-cultivo de células modelo en la (Fig. 1A). Para comprender más a fondo si las MSCs derivadas de médula ósea humana reclutados "co-evolucionan" con células de cáncer de próstata en el microambiente tumoral, una línea de células MSC humana inmortalizada 3A6 [32] se cultivó solo o con LNCaP dependiente de andrógenos, su independiente de andrógenos sublínea C4-2, o hueso metastásico PC3 células de cáncer de próstata en condiciones de cultivo RWV 3-D previamente establecidos, recapitulando el
in vivo
tumor microambiente [13]. Hemos encontrado que las células, ya sea en monocultivo o en condiciones de cocultivo, forman 3-D agregados similares a esferas espontáneamente (Fig. 1B). Cabe destacar que, mientras que 3A6 cocultivo con células LNCaP (3A6 /LNCaP) o C4-2 (3A6 /C4-2) formado agregados más grandes que el monocultivo 3A6 (3A6 /3A6), un número notablemente reducido y el tamaño de los agregados se observaron en el cultivo grupo de 3A6 y PC3 células (3A6 /PC3). Para identificar los tipos de células que están presentes en los agregados, algunos de los agregados celulares se sometieron a análisis histomorfológico. tinción intensa del núcleo de la célula de la cromatina rico (Fig 1C;. H & amp; E) y la inmunorreactividad positiva de la epitelial marcador de células E-cadherina (Fig 1C;. IHC) se detectaron en los agregados cosechados de 3A6 /LNCaP, 3A6 /C4- 2 y 3A6 grupos culturales /PC3 pero no en los agregados de células 3A6 crecido solo. Este hallazgo confirmó el crecimiento 3-D de tumoroids quiméricos que constan de células de cáncer de próstata y las MSC en estas condiciones de cocultivo.

(A) respuesta migratoria de las MSC humanas para el medio, las células normales de la próstata epiteliales (PrEC) y de próstata líneas celulares de cáncer (DU145, PC3 y LNCaP). Las células migradas a través de la membrana de los cultivos polarizados se tiñeron con violeta cristal 8 h después de la siembra celular. Se fotografió la superficie inferior de la membrana (100x), y una imagen representativa de cada condición se muestra en la parte superior. Los datos cuantitativos se representan como la media ± SD del número de células por campo de gran aumento (100x) en experimentos por triplicado. (B) macroscópica (superior) y vista microscópica (parte inferior) de los agregados celulares bajo condiciones de cultivo 3-D RWV de 3A6 células solas (3A6 /3A6) o mezclado con LNCaP (3A6 /LNCaP), C4-2 (3A6 /C4- 2) o PC3 (3A6 /PC3) células. (C) La detección de componentes celulares mixtos en los tumoroids próstata cultivadas en 3-D de H & amp; E y tinción inmunohistoquímica de la E-cadherina (E-Cad) en secciones agregados celulares

más aislado. las células 3A6 a partir de agregados de monocultivos y cada uno de los tumoroids próstata quiméricos (3A6 /LNCaP, 3A6 /3A6 C4-2 y /PC3). Las resultantes 3A6 derivados que representan las líneas de células genéticamente normales pertinentes del MSC y de próstata asociados con el cáncer de MSC fueron designados como 3A6 y 3A6
LNCaP, 3A6
C4-2 y 3A6
PC3
RWV, respectivamente. La pureza de estos derivados de 3A6 se confirmó mediante la evaluación de los marcadores de superficie de MSC, incluyendo CD105, CD166, CD44 y CD29. No se encontraron diferencias significativas en los niveles de expresión en comparación con las células parentales 3A6 que se cultivaron en placas de plástico entre los 15 pasajes (figs. 2A, 2B y en la Tabla S2). La ausencia de contaminación de las células de cáncer de próstata también se demostró por la falta de E-cadherina células que expresan (Fig. 2C). Estas líneas celulares normales apareadas y de próstata asociados con el cáncer de MSC se utilizaron para la caracterización adicional.

(A) de flujo de análisis de citometría de antígenos de superficie celular de 3A6 parental y sus derivados aislados a partir de 3-D agregados de células cultivadas RWV. Los histogramas muestran los perfiles de fluorescencia de 3A6 derivados teñidas con anticuerpos frente a los antígenos indicados y el anticuerpo de control de isotipo correspondiente (línea de color negro). Los niveles de expresión de antígenos individuales se cuantificaron como la relación de la fluorescencia de canal medio del anticuerpo de control y el anticuerpo específico. Las barras de error indican SD de mediciones por triplicado. (B) Análisis de inmunotransferencia de la expresión de CD105 en los derivados de 3A6. los niveles de proteína EF1-α se muestran a variar en cantidades de carga. análisis (C) por citometría de flujo del marcador epitelial E-cadherina en 3A6 derivados y sus socios de cocultivo correspondientes de líneas celulares de cáncer de próstata. Las líneas negras representan controles de isotipo.

cáncer de próstata influye en el compromiso de linaje de las MSC derivadas de médula-Barrow después del contacto Coculture

En primer lugar, investigó si el cáncer de próstata tiene el potencial para dirigir los destinos de diferenciación del hueso MSC derivadas de médula después del contacto físico a largo plazo. Se encontró que el 3-D cultivó 3A6 derivados, con independencia de que se aislaron de los agregados de células homotipica o tumoroids próstata quiméricos, mantiene las propiedades de MSC y fueron capaces de diferenciarse en los osteoblastos y adipocitos en la cultura en los medios de diferenciación adecuada (Fig. 3) . Sin embargo, una mayor tendencia hacia la diferenciación adipogénica, que se indica por la acumulación de lípidos mejorado (Fig. 3A, Fig. S1A) y mayor expresión de específicos de adipocitos marcadores adiponectina (ADIPOQ) y la proteína de desacoplamiento 1 (UCP1) (Fig. 3B) era encontrado en los tres derivados 3A6 cáncer asociado con la inducción supremo visto en 3A6
PC3 en comparación con células normales 3A6
RWV o parentales 3A6. Por otro lado, a pesar de rojo de alizarina tinción S de mineralización de la matriz (Fig. 3C, Fig. S1B) concomitante con genes-osteoblastos específica de la fosfatasa alcalina (ALP) y la osteocalcina (OC) (Fig. 3D) la expresión mostró un aumento menor en el la actividad osteogénica de los derivados 3A6 asociados con el cáncer, se encontró una tendencia inversa entre diferenciación osteogénica y adipogénica entre estas líneas celulares. No hubo diferencia significativa en la tasa de crecimiento entre 3A6
RWV y derivados 3A6 asociados con el cáncer (Fig. S2), que se puede descartar la posibilidad de que el potencial de diferenciación cambiada es una consecuencia de la capacidad de proliferación alterado de las células.

3A6 derivados se cultivaron en medio osteogénico o adipogénica para evaluar su capacidad de diferenciarse en diferentes líneas. células 3A6 parental cultivadas en ausencia de medio de diferenciación (-DM) se utilizaron como control no inducido. tinción representativa de (A) de aceite rojo O tinción para determinar el contenido gotas de lípidos después de 21 días de diferenciación y (C) de color rojo de alizarina S para detectar la mineralización ósea 14 días después de la siembra en medios osteogénica-inducción. Ampliación: 100x. (B) análisis de QRT-PCR de la expresión de marcadores adipogénesis común y genes marcadores (D) de los osteoblastos. Los valores se expresan como cantidades de ARNm normalizados con respecto al gen de mantenimiento HSPCB, y las barras de error representan SD de tres experimentos independientes. *
P Hotel & lt; 0,05; **
P
. & Lt; 0,001 entre 3A6 normales
RWV y derivados 3A6 asociados con el cáncer

MSC asociados con el cáncer ejercer una mayor capacidad para acelerar el crecimiento del cáncer de próstata y la progresión que las MSC normales

a continuación analizaron y compararon el efecto biológico correspondiente al potencial metastásico de pro-3A6 normal con 3A6 asociada al cáncer en el cáncer de próstata. La capacidad migratoria e invasiva de LNCaP, C4-2 y las células de cáncer de próstata PC3 en respuesta a las señales del 3A6 asociada al cáncer correspondiente
LNCaP, 3A6
C4-2 y 3A6
PC3, respectivamente, o el 3A6 normales
RWV células, se evaluó a través de ensayos de cámara de Boyden. Como se muestra en la Figura 4, los tres derivados 3A6 asociados con el cáncer ejercieron efectos pro-metastásicos significativamente más altos mediante la promoción de la migración de células de cáncer de próstata (Fig. 4A) y la invasión (Fig. 4B) con un incremento medio de 2 y 3 veces en la número de células que se mueven hacia la cámara inferior, respectivamente, en comparación con la de las células normales RWV 3A6
.

Migración (a) y (B) la invasión de las células de cáncer de próstata indicados hacia la normal de 3A6
RWV y los derivados 3A6 asociados con el cáncer correspondientes se analizaron por transwell ensayo después de 8 h y 20 h de incubación, respectivamente. Los datos se representan como la media ± SD del número de células por campo de gran aumento (100x) en experimentos por triplicado. **
P Hotel & lt; 0,001. La imagen representativa de cada condición se muestra en la parte inferior.

A fin de validar el comportamiento promotor de tumores avanzados de MSC asociados con el cáncer de próstata en el cáncer de
in vivo
, se inyecta por vía subcutánea PC3 células solas o mezcladas con cualquiera 3A6 normales
RWV (3A6
RWV /PC3) o 3A6
células PC3 asociados con el cáncer (3A6
PC3 /PC3) en ratones desnudos y se evaluó el impacto de 3A6 células sobre los tumores PC3. En un estudio paralelo, 3A6
RWV y células PC3 3A6
fueron inyectados solo, y el resultado confirmaron la propiedad no tumoral de 3A6 derivados (datos no mostrados). Aunque tanto 3A6
RWV y 3A6
PC3 no tuvo ningún efecto sobre el crecimiento celular PC3
in vitro gratis (Fig. S3), se observó un aumento significativo en el volumen del tumor en 3A6
PC3 /PC3 pero no 3A6
xenoinjertos RWV /PC3 (Fig. 5A). La mayoría de los tumores PC3 en ausencia de 3A6 se mantuvo circunscrita, mientras que los tumores PC3 cultivadas junto con 3A6
RWV o 3A6
PC3 muestra un patrón de crecimiento infiltrante, con la invasión en el estroma circundante y el músculo subyacente (Fig. 5B, H & amp; E). Las células tumorales de proliferación e invasivos fueron confirmados por ki-67 expresión y se asociaron con una alta densidad de microvasos (Fig. 5B, CD31). Estas características invasivas son más obviamente ven en las 3A6
xenoinjertos PC3 /PC3. Notablemente, 1 de 10 ratones que recibieron el 3A6
PC3 /xenoinjertos PC3 desarrollados metástasis pulmonares (Fig. 5C), mientras que no hay metástasis se observaron en ya sea el grupo con tumores de células PC3 solos o aquellos con células PC3 mezclado con normal de 3A6
RWV células. Además, en consonancia con el
in vitro
constatación de que los derivados 3A6 asociados con el cáncer tienen potencial de diferenciación adipogénica más alta que lo normal 3A6
RWV, aceite rojo O tinción reveló una mayor cantidad de acumulación de lípidos en las secciones de tumor de 3A6
PC3 /PC3 en comparación con la de 3A6
RWV /PC3 (Fig. 5B, O rojo aceite).

Los ratones desnudos se implantaron por vía subcutánea con células de cáncer de próstata PC3, ya sea solo (PC3) o mezclado con 3A6 normales
RWV (PC3 + ​​3A6
RWV) o 3A6 asociada al cáncer
células PC3 (PC3 + ​​3A6
PC3) en el flanco (
n = 10
para cada grupo). (A) la cinética de crecimiento de los tumores se midieron más de 10 semanas de seguimiento y se presentan como los cambios veces en comparación con la semana 1 después de la implantación de células. *
p Hotel & lt; 0,05 frente al grupo de control PC3. (B) del panel Representante de la histológico H & amp; E tinción, tinción inmunohistoquímica para el marcador de proliferación celular Ki-67 y vascular marcador CD31 y tinción con rojo O Aceite de vacuolas lipídicas (rojo) de secciones de tumores subcutáneos. metástasis (C) pulmonares observadas por histológico H & amp; E tinción de secciones de tejido (40x) de 3A6
PC3 co-inoculados animales PC3. área del tumor era un círculo e indicó.

IL-6 contribuye a la estroma reactivo fenotipo de los MSC asociados con el cáncer

Para identificar los factores candidatos responsables de las actividades del estroma de reactivos asociados con el cáncer MSC, los arrays de anticuerpos humanos de citoquinas fueron utilizados para comparar los perfiles de expresión de citoquinas de medio acondicionado recogidos de 3A6 normales
RWV y células PC3 asociados con el cáncer 3A6
LNCaP, 3A6
C4-2 y 3A6
. Entre 174 citoquinas se ensayaron, IL-6, fue significativamente mayor en los tres de los derivados 3A6 asociados con el cáncer en comparación con 3A6
RWV (Fig. 6A). Los datos cuantitativos obtenidos de un ensayo ELISA (Fig. 6B) confirmó la IL-6 niveles elevados de proteína en 3A6
LNCaP, 3A6
C4-2 y 3A6
células PC3 que corresponde a los aumentos de 145%, 204% y 1,403%, respectivamente, por encima de la de 3A6
RWV (112 pg /ml).

(A) perfil de expresión de citocinas del medio acondicionado obtenido a partir de la normal de 3A6
RWV y el cáncer de próstata -asociado 3A6
LNCaP, 3A6
C4-2, y 3A6
PC3 se analizó mediante el uso de una matriz de citocina humana de anticuerpos C Serie 2000. La autorradiografía de un conjunto de matrices VI que contiene IL-6 puntos (rectangulares cajas) se presenta. (B) Detección cuantitativa del nivel de expresión de IL-6 por el ensayo ELISA. Los datos representan la media ± desviación estándar de determinación por triplicado. (C) la respuesta quimiotáctica de las células PC3 inducidas por IL-6 humana recombinante (rIL-6). Los datos se representan como la media ± SD del número de células por campo de gran aumento (100x) en experimentos por triplicado. *
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vs medio libre de suero
solo.. (D) Inhibición de la migración de células PC3 hacia 3A6
PC3 medio condicionado por el anticuerpo anti-IL-6. El medio condicionado de 3A6
células PC3 se trataron previamente con la concentración indicada de anti-IL-6 anticuerpo de ratón y después se cargó en la cámara inferior de cultivos polarizados. El tratamiento con 30 mg /ml de IgG de ratón (mIgG) era un control negativo. *
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vs
IgG de ratón.. (E) La inducción de la adipogénesis de 3A6
células RWV por la IL-6 humana recombinante, y la inhibición (F) de la adipogénesis de 3A6
células PC3 por anti-IL-6 de anticuerpos a la concentración indicada. Las células se tiñeron con aceite rojo O para visualizar las gotas de lípidos después de 21 días de incubación. La imagen representativa (100x) de cada condición se muestra en la parte superior. Las células teñidas se cuantificaron utilizando un método de extracción de tinte y los datos se representan como la media ± SD de tres experimentos independientes. **
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vs
grupo de control IgG de ratón

Hemos examinado si la IL-6 está implicada en la inducción de la migración de las células del cáncer de próstata.. por 3A6 asociada a cáncer. Se encontró que exógeno humano IL-6 (rIL-6) indujo un (6C Fig.) Creciente en la migración transwell de células PC3 dependiente de la dosis. Además, el número de células PC3 que migró hacia el 3A6
PC3 medio acondicionado en la cámara inferior fue inhibida por 23% y 36% cuando el medio condicionado se pre-trata con un anticuerpo neutralizante de IL-6 a concentraciones de 10 g /ml y 30 mg /ml, respectivamente (Fig. 6D).

también se evaluó el papel de la IL-6 en la adipogénesis mejorada de las MSC asociado al cáncer. Se indujeron normales 3A6
células RWV de diferenciarse en células adipogénicas con o sin adicional rIL-6. *
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