Extracto
En esta exploración estudio de campo cercano microscopía óptica (SNOM) se ha utilizado en conjunción con el etiquetado de puntos cuánticos para interrogar a la composición biomolecular de las membranas celulares. La técnica supera los límites de difracción óptica que se encuentra en la microscopía de fluorescencia estándar y también produce información topográfica vital. La técnica se ha aplicado para investigar la adhesión célula-célula en las células epiteliales humanas. Esto se ha realizado a través de inmunofluorescencia etiquetado de la célula-célula de proteínas de adhesión E-cadherina. Además, un protocolo de doble etiquetado ha sido optimizado para facilitar un estudio comparativo de los mecanismos de adhesión y el efecto de la expresión de proteína de adhesión aberrante tanto en las células epiteliales sanas y cancerosas. El estudio muestra claras diferencias en la morfología y el fenotipo de las células sanas y cancerosas. En las células epiteliales de próstata sanos (PNT2), E-cadherina se encuentra predominantemente en torno a la periferia de la célula y dentro de las extensiones filopodial. La presencia de la E-cadherina parecía ser mejorada cuando se estableció contacto célula-célula. En contraste, el examen de las células de adenocarcinoma de próstata metastásico (PC-3) no reveló etiquetado E-cadherina alrededor de la periferia de las células. Esta falta de funcionalidad de E-cadherina en las células PC-3 coincidió con No se encontraron unas marcadas diferencias en la morfología y las células PC-3 para formar asociaciones célula-célula estrechas con sus vecinos. Hemos demostrado que con una metodología de preparación de muestras totalmente optimizado, etiquetado punto cuántico multiplexado en conjunción con las imágenes SNOM puede aplicarse con éxito para interrogar a la localización biomolecular dentro de las membranas celulares delicados
Visto:. Walker K-AD, Morgan C, Doak SH, Dunstan PR (2012) Quantum Dots para la detección de multiplexado y caracterización de células de cáncer de próstata mediante un escaneado de campo cercano microscopio óptico. PLoS ONE 7 (2): e31592. doi: 10.1371 /journal.pone.0031592
Editor: Joel M. Schnur, George Mason University, Estados Unidos de América
Recibido: August 1, 2011; Aceptado: January 11, 2012; Publicado: 9 Febrero 2012
Derechos de Autor © 2012 Walker et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. HEFCW son reconocido por la inversión en equipo (www.hefcw.ac.uk). EPSRC son reconocidos por proporcionar financiación estudiante de investigación de doctorado (www.EPSRC.ac.uk). Gracias a la Fundación & amp Médico de San David; Próstata Reino Unido (número de concesión: G2009 /27) para soportar los aspectos de este trabajo (www.prostateaction.org.uk). SH Doak es apoyado por una beca académica RCUK (www.rcuk.ac.uk). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
adhesión celular juega un papel importante en el mantenimiento de la arquitectura de los tejidos y órganos y es vital para su correcto funcionamiento. adhesión célula-célula anormal tiene implicaciones en la aparición de muchas enfermedades y enfermedades. Un esfuerzo concertado se ha hecho por muchos investigadores para determinar la relación entre la adhesión celular y la capacidad metastásica de muchos tipos de cáncer [1], [2].
E-cadherina es uno de los principales mediadores de la célula-célula adhesión en los tejidos epiteliales y se ha examinado extensamente para determinar su papel en la progresión del cáncer y la metástasis. Se ha demostrado que la pérdida de expresión o función E-cadherina está vinculada a un aumento potencial invasivo [3], potencial metastásico [4] y más pobre pronóstico del paciente [5], [6]. Esta relación es particularmente relevante para los cánceres de próstata que tienen una propensión a metastatizar y formar tumores secundarios (principalmente esquelético), resultando en un mal pronóstico del paciente [7], [8]. A pesar de los esfuerzos se han realizado importantes en la comprensión del papel de la E-cadherina en la progresión del cáncer de próstata, los investigadores no han llegado a un consenso [9], [10]. Una comprensión más detallada de los mecanismos de adhesión podría conducir al desarrollo de nuevos tratamientos para el cáncer como se indica por los estudios preliminares realizados por Zhou
et al.
[11] y Mao
et al.
[ ,,,0],12].
Aunque aplicada rutinariamente a través de las ciencias de la vida, técnicas de microscopía de fluorescencia convencional están limitados por el límite de difracción óptica. Acceso a la información más allá del límite de difracción de una amplia gama de tipos de muestras se ha hecho posible después de la aparición de las técnicas de microscopía de sonda de barrido (SPM). SPM permite el examen de la metrología de una muestra con resolución nanoescala y de escaneado de campo cercano microscopía óptica (SNOM) es un ejemplo de que es particularmente adecuado para interrogar a las interacciones y funciones de materiales biológicos [13] - [15]. SNOM tiene la capacidad para sondear simultáneamente la topografía y examinar las características ópticas en las escalas que normalmente no se pueden lograr mediante microscopía de fluorescencia convencional mediante la explotación de las propiedades de las ondas evanescentes. Un típico SNOM montaje experimental se ilustra en la Figura 1. Si bien se han producido avances rápidos (véase la revisión de Galbraith y Galbraith [16]) en el campo de la microscopía óptica de super-resolución con el desarrollo de técnicas tales como el agotamiento de la emisión estimulada (STED), activado por la microscopía de localización (PALM) y las imágenes de fluorescencia con una precisión de un nanómetro (Fiona) [17], el uso de ópticas cerca de los campos de superficie o membrana investigaciones usando microscopía de fluorescencia de reflexión total interna (TIRFM) tiene también cada vez más frecuentes [18], [19]. Por su naturaleza, TIRFM restringe el Z-gama iluminado y por lo tanto ofrece una mejor resolución de la microscopía confocal. SNOM tiene las ventajas de TIRFM pero además genera una óptica de campo cercano que también se limita espacialmente de dimensiones nanométricas en x e y. Además, su sonda se combina con un mecanismo de retroalimentación topográfico que permite que se revele de forma simultánea los cambios estructurales de la muestra junto con su respuesta óptica.
En este trabajo se reporta el uso de un protocolo de doble etiquetado optimizado para llevar una estudio comparativo de los mecanismos de adhesión tanto en células epiteliales sanas y cancerosas. El objetivo del estudio ha sido un examen de alta resolución usando SNOM sobre la función de la proteína E-cadherina en dos líneas celulares. Además de la E-cadherina, la proteína de unión estrecha ZO-1 se seleccionó como un control de formación de imágenes adecuado tal como se expresa en la membrana de plasma en el límite de célula-célula. Por lo tanto, los anticuerpos contra las proteínas de adhesión E-cadherina y ZO-1 se utilizaron para etiquetar indirectamente las células epiteliales normales de la próstata PNT2 y células de adenocarcinoma de próstata PC-3. La técnica SNOM examina el diferencial sub-localización celular de moléculas de adhesión célula-célula en alta resolución y se ha realizado en paralelo con los estudios de expresión génica para dar indicaciones generales sobre la función y expresión.
Materiales y Métodos
cultivo celular células p> próstata epiteliales, PNT2, y células de adenocarcinoma de próstata, PC-3, se obtuvieron de la Colección Europea de cultivos celulares (Salisbury, Reino Unido). Las células se mantuvieron en medio RPMI 1640 (Gibco, Paisley, UK) suplementado con 10% de suero fetal bovino, 1% de L-glutamina, 60 unidades /ml de penicilina y 60 mg /ml de estreptomicina a 37 ° C /5% de CO
2. Las células se subcultivaron cuando alcanzaron aproximadamente el 80% de confluencia.
En la imagen, las células fueron cultivadas en estériles de 25 mm cubreobjetos de vidrio circulares. Las células se fijaron a temperatura ambiente usando 3,7-4% ultra pura formaldehído libre de metanol (Parque Scientific Ltd., Northampton, UK) en PBS durante 15 minutos, seguido de tres lavados de 5 minutos en glicina PBS /100 mM y se deshidrataron a través de una serie de etanol. Las muestras se almacenaron a 4 ° C hasta que sea necesario para el etiquetado de fluorescencia.
extracción de RNA y la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (PCR)
Las células se cultivaron hasta la confluencia en 75 cm
3 matraces . El ARN celular total se extrajo usando el kit de extracción RNeasy (Qiagen, Crawley, Reino Unido) y el ADN residual se retiró por tratamiento con ADN libre ™ (Ambion, Cambridgeshire, Reino Unido) según las instrucciones del fabricante. Se sintetizó ADNc a partir de ARN 1 g usando cebadores aleatorios y la síntesis de ADNc kit de transcripción inversa de alta capacidad (Applied Biosystems, Warrington, Reino Unido). En tiempo real las reacciones de PCR se realizaron en el termociclador iCycler iQ térmica (laboratorios Bio-Rad, Hemel Hempstead, Reino Unido), utilizando la metodología de detección de SYBR Green. Los conjuntos de cebadores fueron diseñados para ser exón-exón abarca el fin de minimizar la posibilidad de que cualquier contaminación de ADN genómico se amplifica. Los conjuntos de cebadores utilizados también fueron probados para asegurar que todos ellos demostraron la eficiencia de amplificación iguales. Todas las reacciones se realizaron por triplicado con 2 l de ADNc, 12.5 l iQ SYBR Green Supermix (laboratorios Bio-Rad, Hemel Hempstead, Reino Unido) y 0,2 M adelante y atrás primers, en un volumen de reacción final de 25 microlitros. condiciones de amplificación de PCR fueron 95 ° C durante 3 minutos, seguido de 40 ciclos de 94 ° C durante 30 segundos, 60 ° C durante 30 segundos y 72 ° C durante 30 segundos. Doblar expresión se normalizó a PNT2. E-cadherina y ZO-1 se amplificó utilizando los cebadores que se muestran en la Tabla 1. También se muestran las secuencias de los cebadores para β-actina y HPRT, que se utilizaron como controles endógenos.
Western Blot
La proteína total se extrajo utilizando tampón RIPA (Sigma Aldrich, Dorset, Reino Unido). Treinta microgramos de proteína se ejecutan en un 7,5% geles de Tris-glicina (laboratorios Bio-Rad, Hemel Hempstead, Reino Unido). Las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Amersham Pharmacia Biotech, Amersham, UK). Las membranas se bloquearon con leche en polvo 5% sin grasa en tween /TBS (todos de Sigma Aldrich, Dorset, Reino Unido) para inhibir la unión no específica y se incubaron durante la noche a 4 ° C utilizando anti-ZO-1 anticuerpo de ratón (Invitrogen, Paisley, Reino Unido ) en 1:250 y conejo anticuerpo anti-e-cadherina (New England Biolabs, Hertfordshire, Reino Unido) a 1:1000. β-actina (1:1000) se utilizó como control para la carga de proteínas. Las membranas se lavaron libres de anticuerpo primario y se incubaron con peroxidasa de rábano picante /anticuerpos conjugados secundarios anti-ratón anti-conejo (1:1000) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las proteínas se visualizaron usando el kit de detección chemiluminescene Immun-Star WesternC (laboratorios Bio-Rad, Hemel Hempstead, UK) y se cuantificaron usando un programa informático específico y Cantidad Uno (laboratorios Bio-Rad, Hemel Hempstead, Reino Unido).
inmunofluorescencia
Todas las etapas se realizaron en condiciones ambientales salvo que se indique lo contrario. Immunolabelling se lleva a cabo generalmente dentro de las 24 horas de la fijación. Todos los pasos de los protocolos de etiquetado de inmunofluorescencia fueron optimizados de los procedimientos básicos descritos por los fabricantes; incluyendo las condiciones de permeabilización, etapas de bloqueo, la concentración de los reactivos, condiciones de incubación y etapas de lavado. La optimización se completó para cada línea celular utilizada en este estudio. experimentos de control negativo se llevaron a cabo junto con el etiquetado de fluorescencia para asegurar la selectividad de los marcadores fluorescentes. No se encontraron controles negativos para producir cualquier patrón de marcación distinta o tener cualquier rendimiento de fluorescencia significativa. Para las células de doble etiqueta PNT2 contra E-cadherina y ZO-1, los cubreobjetos se lavaron con PBS, permeabilizaron con 0,1% Triton-X durante 10 minutos y se incubaron con Image-iT señal FX potenciador (Invitrogen, Paisley, Reino Unido) durante 30 minutos . Los cubreobjetos se enjuagaron después y posteriormente incubadas con 31 mg /ml de ratón anti-ZO-1 anticuerpo (Invitrogen, Paisley, Reino Unido) durante 2 horas a 37 ° C. Para etiquetar ZO-1 con los puntos cuánticos, los cubreobjetos se incubaron con 30 nM Qdot 525 de cabra anti-IgG de ratón conjugado (Invitrogen, Paisley, Reino Unido) durante 1 hora. Rabbit anticuerpo primario anti-cadherina E (Abcam, Cambridge, Reino Unido) se aplica entonces a las células a una concentración de 18 mg /ml y cubreobjetos se incubaron durante 2 horas a 37 ° C. Para etiquetar E-cadherina con puntos cuánticos, Qdot 605 de cabra anti-conejo se aplicó a una concentración de 20 nM y se dejó durante 1 hora (Invitrogen, Paisley, UK). Antes de las imágenes, los cubreobjetos se enjuagaron en PBS para eliminar el exceso de puntos cuánticos no unidos. Para facilitar la formación de imágenes SNOM, las muestras se aclararon adicionalmente en agua, se deshidrataron a través de una serie de etanol y se seca al aire. Para dual etiquetado de las células PC-3 se requiere un protocolo ligeramente diferente. Para reducir la tinción de fondo, los cubreobjetos se bloquearon con PBS mM de glicina /100 antes de la aplicación de los anticuerpos y el orden de aplicación fue de E-cadherina anticuerpo primario, Qdot anticuerpo anti-conejo 605 cabra, ZO-1 anticuerpo primario y Qdot 525 cabra anti -mouse anticuerpo secundario (20 nM concentración se utilizó para Qdot 525, todas las demás concentraciones y tiempos de incubación fueron como para las células PNT2). Las muestras fueron observadas utilizando microscopía de fluorescencia antes de la imagen SNOM para verificar que el etiquetado había tenido éxito. Las muestras se obtuvieron imágenes de un plazo de 48 horas de preparación.
imágenes SNOM
Las imágenes se obtuvieron usando SNOM una Aurora 3 (Veeco Instruments, Cambridge, Reino Unido), utilizando sondas de fibra óptica con recubrimiento de aluminio con frecuencia de resonancia 80-110 kHz y la abertura de aproximadamente 50-100 nm, según lo especificado por los fabricantes (Veeco Instruments, Cambridge, Reino Unido). A 488 nm Ar
+ láser se utiliza para la transmisión de señales de excitación y se recogieron con un 40 ×, 0,65 NA objetivo colección. Las señales se pasan a través de un 488 nm borde Raman (de paso alto) filtro óptico para eliminar la luz del láser. Para la imagen de la localización de las proteínas ZO-1 (marcada con puntos cuánticos que emiten verdes), la luz restante se hace pasar por un filtro de paso de banda óptica nm 525, para eliminar la fluorescencia roja, y se centró en un diodo de avalancha de fotos (APD). Para la imagen de la localización de las proteínas E-cadherina (marcada con puntos cuánticos que emiten rojo), se utilizó un filtro de paso de banda óptica nm 609. En este artículo las señales de APD que surgen debido a la fluorescencia se presentan y los tiempos típicos de integración APD fueron 20 ms /píxel, con resolución de imagen de 300 x 300 píxeles.
El análisis estadístico
Para probar la supuesto de que los datos se distribuyen normalmente, se realizaron parcelas normales para cada grupo. Una de las muestras estadísticas de Kolmogorov-Smirnov dieron como resultado valores de p & gt; 0,05 indicando los datos se distribuyen normalmente. por lo tanto, el análisis se llevó a cabo utilizando la prueba de ANOVA paramétrico. Dunnett análisis post hoc se realizó para comparar las líneas celulares de cáncer con el control de la línea de células no cancerosas y análisis post hoc de Tukey se realizó para múltiples comparaciones de grupos. Un
p-valor
. & Lt; 0,05 fue considerado significativo
Resultados
se obtuvo Expresión Análisis
Los datos de expresión génica a través de la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (PCR) y para la e-cadherina, revelaron una disminución estadísticamente significativa (-7,25 veces) en la expresión en PC-3 (
p
= & lt; 0,001) en comparación con PNT2. Para ZO-1, a pesar de que la expresión estaba regulada hacia abajo en PC3 en comparación con PNT2 (-1,20 veces) esto no se consideró significativo (Figura 2).
Los niveles de expresión se han normalizado en contra de dos genes de limpieza y el cambio en se ilustra la expresión relativa a PNT2. * Indica una diferencia significativa (P & lt; 0,05). Comparado con PNT2
Western blot reveló que la regulación a la baja de E-cadherina también fue evidente a nivel de proteínas. Densitometría reveló un 2,6 doblar hacia abajo la regulación de la E-cadherina en la línea celular PC-3 en comparación con PNT2. Los niveles de proteína de ZO-1 también fueron regulados hacia abajo (-1.05 veces) en relación con PNT2, apoyando a los datos de expresión de genes (Figura 3).
Un importante regulación hacia abajo de la E-cadherina se observa al mismo tiempo las diferencias en la expresión de la proteína ZO-1 entre las líneas de células es menos significativo. Tenga en cuenta, β-actina se utilizó para el control de carga.
doble etiquetado células PNT2
Para lograr la separación del filtro de las señales de fluorescencia producida por las muestras de doble etiquetado, era importante utilizar los puntos cuánticos que emiten en longitudes de onda claramente separadas, por lo tanto, la selección de los puntos cuánticos con longitudes de onda de emisión de 605 nm y 525 nm. PNT2 muestras fueron examinadas usando SNOM y se generaron las imágenes que se presentan en la Figura 4. información Topografía se puede ver en la figura 4A, que fue adquirida para demostrar que la extensa protocolo dual etiquetado no resultó en cambios en la estructura de la muestra. Como puede verse en la figura 4A, la estructura celular se mantuvo bien conservado y características se distinguen claramente.
Imágenes revelan la topografía (A y E) y de fluorescencia (B, C y D) respuesta. Imágenes (B) y (C) se obtuvieron con diferentes filtros para distinguir entre la fluorescencia espectralmente rojo y verde, la identificación de lugares ZO-1 y E-cadherina, respectivamente. La región en caja en (A) se escaneó a una resolución más alta para generar la imagen detallada E-cadherina fluorescencia (D) y la topografía de acompañamiento se muestra en (E). regiones con un círculo (C) y la flecha /punta de flecha (D) en las agrupaciones más destacado de E-cadherina.
Las correspondientes imágenes ópticas fueron adquiridas la imagen topografía se muestra en la Figura 4A para revelar la ubicación de zo- 1 y e-cadherina (que se muestra en las figuras 4B y 4C, respectivamente). La expresión de genes reveló ZO-1 se expresa en las dos líneas celulares y por lo que para los fines de este estudio se utilizó como control positivo. A pesar de un ruido comparativamente bajo de señal a fondo de ~5.6, Figura 4B demuestra que las proteínas ZO-1 están adecuadamente ubicados en la periferia celular en las células PNT2.
Cuando se examina la E-cadherina (Figura 4C), se logran mejoradas considerablemente los niveles de señal a ruido de más de ~ 33. La calidad superior de las imágenes obtenidas es probablemente debido a la naturaleza más brillante de los puntos cuánticos de color rojo en comparación con verde. La figura 4C muestra la E-cadherina se encuentra principalmente a lo largo de los límites de las celdas PNT2 con niveles particularmente altos de fluorescencia se concentran en regiones específicas (en el círculo en la figura 4C).
Con el fin de examinar las regiones con alta actividad fluorescente con más detalle, la región en caja en la Figura 4A se escaneó posteriormente a mayor resolución. La imagen de la topografía resultante (Figura 4E) revela una red de filopodios a partir de células que han establecido contacto vecina. La imagen de fluorescencia adquiridos simultáneamente se muestra en la Figura 4D. Una fila de fluorescencia correspondiente a la posición E-cadherina se puede ver corriendo paralela al borde de una celda (véase la flecha en la Figura 4D). filas adicionales de fluorescencia también están presentes a lo largo de la longitud de la gran filopodium en el centro de la imagen (identificado por la punta de flecha). Estos resultados confirman que la localización de la E-cadherina puede ser examinado con éxito en muestras que han sido teñidas doble.
Análisis Estructural de células PC-3
Para comparar la morfología de las células sanas y cancerosas , se obtuvieron inicialmente imágenes de microscopía de campo brillante. células confluentes PNT2 se muestran en la Figura 5A, mientras que las células PC-3 se muestran en la Figura 5B. Las células PC-3 tiene una apariencia muy diferente: algunas células PC-3 presentan una morfología esférica, mientras que otros parecen más alargada y similar a fibroblastos, a menudo poseen lamelipodia alargada
Antes de immunolabelling de PC. -3 células, su morfología, se examinó el uso de alta resolución adquisiciones SNOM topografía. Las imágenes mostradas en la Figura 6 confirman directamente las observaciones de la Figura 5. Algunas células aparecen de forma esférica como se demuestra en la Figura 6A, mientras que otros exhiben una morfología más similar a fibroblastos con una larga, la ramificación protuberancias citoplasmáticas (como se indica por las flechas en las Figuras 6C y 6D) . Estos salientes son significativamente más largo que el filopodios observa típicamente en las células sanas y se encuentra a menudo a extender a longitudes mayores de 25-30 micras, es decir, más allá del rango de tamaño de las exploraciones de topografía. Además, las mediciones muestran su diámetro sea mucho más ancho que el filopodios más fina, algunas de las cuales se puede distinguir que sobresale de la lamellipodia como se indica por puntas de flecha en las Figuras 6C y 6D. Estas protuberancias más grandes tienden a disminuir a medida que aumenta la longitud sin embargo, en su punto más ancho, se comprobó que medir hasta 2,1 micras y alcanzar alturas de hasta aproximadamente 300 nm. Las mediciones en los salientes finos observados en estas imágenes revelaron anchuras que oscilan entre 120 a 340 nm. núcleos de las células (indicado por N) se distinguen claramente en las figuras 6A y 6B. Las regiones encuadradas en las figuras 6A y 6B representan áreas que fueron has posteriormente. Esto permitió un contraste superior entre las características de la misma altura y se expone mucho más detalle.
imagen (A) es un ejemplo típico de un no confluente PC-3 muestra. El cuadrado de puntos indica una región que ha sido estudiado con más detalle, que se puede ver en la imagen (C). En estas imágenes las células PC-3 exhiben protrusiones citoplasmáticas, indicados por la flecha en la imagen (C). Imágenes (B) y (D) muestran una distribución más confluente de células PC-3. Una región enfocado se perfila en la imagen (B) y la imagen (D) es el zoom resultante. La mayor resolución revela claramente asociaciones célula-célula sueltos a lo largo de la frontera entre las células; este límite se indica mediante la etiqueta M. En la imagen (D) las protuberancias citoplasmáticas están de nuevo marcadas con una flecha. Otras etiquetas utilizadas en las cifras incluyen puntas de flecha para indicar los lugares filopodios y la etiqueta N está poniendo de relieve el núcleo de la célula.
En contraste con las células confluentes PNT2, no aparecen células PC-3
para formar muy cerca asociaciones con las células vecinas. Esto se demuestra por las imágenes que se muestran en la Figura 6B y 6D. Las lagunas de hasta 2,1 m alrededor de la periferia de las células se observan y se ha establecido ningún sello a lo largo de la frontera entre las células adyacentes (el límite célula-célula se indica mediante la etiqueta M en la figura). Filopodial numerosas extensiones finas pueden ser vistos para sobresalir a través de estas brechas; Sin embargo pocos parecen interactuar con los de las células opuestas. Esto es muy diferente a las células PNT2 donde se observaron filopodios a partir de células adyacentes a entrelazarse en toda la región intercelular. Cuando las células alcanzaron PNT2 alta confluencia, las células fueron completamente sellados juntos y sin huecos podrían ser distinguidos.
doble etiquetado células PC-3
Con el fin de evaluar la localización subcelular de E- proteína cadherina en células PC-3, se llevó a cabo de nuevo el etiquetado dual. adquisiciones típicos SNOM de células de doble etiquetado PC-3 se muestran en la figura 7. La imagen topográfica se muestra en la Figura 7A y revela una sola célula cuyo núcleo (con la etiqueta por N) se distingue claramente. Las mediciones muestran que la altura máxima de esta célula se alcanza sobre la región nuclear que equivale a aproximadamente 890 nm. El lamellipodium (marcado por L) puede ser vista y se encontró que abarcan una superficie de aproximadamente 90 m
2. Una gran protuberancia celular es visible en la celda y se identifica por la etiqueta P en la imagen. Las mediciones indican una anchura de 6,2 ± 0,1 micras, con su punto de origen.
Imágenes revelan topografía de células (A) y de fluorescencia (B, C, D y E). El núcleo se identifica por N, lamellipodium por L y saliente por P. ZO-1 localización se muestra en las imágenes (B y D), mientras que el etiquetado E-cadherina se muestra en (C y E). Las regiones encuadradas en (B y C) corresponden a las regiones acercarse mostradas en (D y E), respectivamente. La flecha en (D) pone de relieve el etiquetado periferia superior del ZO-1.
correspondientes adquisiciones de fluorescencia SNOM se muestran en las Figuras 7B y 7C y se obtuvieron utilizando diferentes filtros de paso de banda óptica para distinguir entre zo- 1 y e-cadherina, respectivamente. Un área ampliada posterior (resaltada en la Figura 7B y 7C) fue generada por el software para permitir que la periferia de la célula para ser resuelto en mayor detalle. Figuras 7D y 7E revelan el etiquetado relativa de ZO-1 y E-cadherina, respectivamente.
Como ya se observó con las células PNT2, las relaciones de señal a ruido obtenidos con los puntos cuánticos verdes en la Figura 7B son notablemente menos en comparación con la alcanzada por los puntos cuánticos de color rojo en la figura 7C. La relación señal-ruido de la Figura 7B es ~7.2. La correlación de la imagen de fluorescencia ZO-1 (Figura 7B) con la topografía (Figura 7A) revela fluorescencia sobre la región de la célula que se corresponde con el núcleo. Sin embargo, la fluorescencia puede también ser identificado claramente a lo largo de la periferia de la protuberancia celular y se identifica mediante las flechas en la imagen que se muestra en la Figura 7D. Mientras que la ZO-1 era principalmente una herramienta para el control, esta re-distribución de la fluorescencia en la región nuclear (similar a la E-cadherina) se ha observado en estudios anteriores [20], [21].
la Figura 7C muestra la adquisición SNOM obtenido a examinar la localización de las proteínas de E-cadherina en células PC-3 mediante el registro de la respuesta de fluorescencia de campo cercano, en el etiquetado de puntos cuánticos que emiten rojo. Aunque la imagen muestra una fuerte respuesta de fluorescencia de la muestra, el nivel de señal a ruido (~14.6) se reduce notablemente en comparación con la observada cuando se examina E-cadherina en las células PNT2. Por otra parte, las señales de fluorescencia son evidentes predominantemente alrededor del perímetro del núcleo y también se encuentran para extender alguna manera a lo largo de la longitud de la protuberancia. Esto se puede ver más claramente en la figura 7E, que representa un zoom de la región en caja en la Figura 7C. A pesar de esta respuesta, no parece haber ningún patrón de marcación E-cadherina significativo alrededor de la periferia de la célula en las regiones que confieren contacto célula-célula, como se ha visto con la línea celular PNT2. Esto da una clara indicación de la falta de localización de la proteína correspondiente en las células PC-3.
Discusión
Tras las investigaciones anteriores de los mecanismos de adhesión en la línea de células epiteliales sanas PNT2 [22], una metodología de doble etiquetado se ha desarrollado para facilitar el estudio de las moléculas de adhesión en otras líneas celulares. Una amplia optimización de los protocolos era necesario con el fin de generar muestras fluorescentes de alta calidad y para asegurar que inmunomarcaje con precisión refleja la distribución de las proteínas en la membrana celular. Se tomaron muchos aspectos de preparación en cuenta en dicho procedimiento con el fin de conseguir el marcaje eficaz con alta respuesta de la señal y baja etiquetado fondo, como se detalla en Materiales y Métodos.
análisis
La expresión de genes reveló una regulación a la baja significativa en E- cadherina expresión en la línea celular PC-3 en comparación con la línea celular de control, PNT2. Este fue validado a nivel de proteínas por Western Blot y está de acuerdo con otros estudios que muestran expresión de la proteína E-cadherina se redujo regulado en células PC-3 [23]. ZO-1 la expresión de proteínas en ambas líneas celulares se encontró que era sólo ligeramente alterado y por lo tanto podría actuar como una señal de control adecuada. Por lo tanto se consideró un enfoque doble etiquetado necesario para las investigaciones de la localización de la E-cadherina utilizando SNOM como la detección ZO-1 sería asegurar la detección óptica en nuestro instrumento SNOM fue óptima, en particular en el caso de que las señales de E-cadherina no podía ser detectado. Para hacer frente a las dificultades encontradas durante la doble etiquetado de PC-3, las proteínas de la E-cadherina se immunolabelled con más brillante (debido a su mayor rendimiento cuántico) de color rojo los puntos cuánticos que emiten. Se requiere optimización de los protocolos para asegurar que el etiquetado eficaz se consigue con una respuesta precisa de la señal. Esto era más difícil de lograr en la línea celular PC-3, como la expresión de E-cadherina se reduce y un protocolo de etiquetado mal desarrollada podría ser simplemente una etiqueta en un E-cadherina mal. Esto a su vez se presentaría como el reflejo de un cambio de expresión. A partir de esta extensa optimización, doble etiquetado se logró con éxito y por lo tanto facilita el estudio de la localización de E-cadherina y proteínas ZO-1 en dos líneas de células epiteliales de próstata utilizando la imagen de SNOM alta resolución.
Análisis de la doble células epiteliales sanas PNT2 etiquetados revelaron que la e-cadherina se encuentra predominantemente a lo largo de la periferia de la célula y parecía mejorada en las regiones donde se estableció contacto célula-célula. Esto fue demostrado por los grupos puntiformes de la E-cadherina que se observaron cuando filopodios establecido contacto y la adhesión célula-célula iniciada como se muestra en la Figura 4C. No se encontraron células PNT2 para formar la apariencia típica de adoquines que se ve característicamente en los tejidos epiteliales normales. Esto fue consistente con estudios previos, en los que sólo se examinó la localización de las proteínas E-cadherina [22]. Como era de esperar, también se encontraron ZO-1 proteínas a ser localizados alrededor de la periferia de las células PNT2. Esto se demostró claramente en la Figura 4B a pesar de la calidad de las imágenes de fluorescencia ZO-1 que son inferiores a los obtenidos para la E-cadherina, debido a las diferencias de rendimiento cuánticos de los puntos cuánticos utilizados.
El estudio se extendió a examinar las células cancerosas PC-3. Inicialmente, la morfología de estas células metastásicas se analizó a través de la adquisición de imágenes de topografía SNOM. Se encontraron células PC-3 que difieren en estructura a las células epiteliales sanas en numerosas formas. En primer lugar, se encontró que su forma general a ser más irregular con algunas células suponiendo una morfología similar a fibroblastos en comparación con el aspecto más de adoquines de las células sanas. En segundo lugar, las células PC-3 fueron a menudo difíciles de imagen debido a sus características abruptas. Las células PC-3 poseían comúnmente protuberancias citoplasmáticas largas además de la filopodios observado rutinariamente en las células sanas. Por último, el examen de las muestras más confluentes reveló que las células PC-3 forman asociaciones sueltas con las células vecinas con pocas filopodios oponerse a interactuar. Las lagunas se observaron con frecuencia alrededor de la periferia de las células (como se demuestra en la Figura 6D), en contraste con los cierres herméticos que se observaron durante el examen de las células PNT2. La morfología de las células PC-3 observados en este estudio usando SNOM confirma observaciones anteriores hechas por Lang
et al.
[24] utilizando un microscopio de contraste de fases y microscopía electrónica de barrido.
Cuando la imagen con SNOM , dibujo comparaciones cuantitativas de los niveles de expresión basados en el número de cuentas registradas se hace difícil cuando se han utilizado diferentes sondas SNOM. Sin embargo, la utilización de la relación señal-ruido en lugar de los recuentos absolutos ayuda para dar cuenta de las diferencias que puedan surgir con un cambio de sonda SNOM. Se realizó un análisis posterior de la localización subcelular de E-cadherina y ZO-1 proteínas en las células PC-3. adquisiciones de fluorescencia SNOM revelaron la presencia de ZO-1 en la periferia de protuberancias celulares, además de ser observado en la región nuclear. Aunque no es el objetivo principal de este estudio, esta observación confirma los hallazgos de otros informes donde se ve la deslocalización de ZO-1 [21]. De hecho ZO-1 acumulación en el núcleo de la célula, además de sitios de contacto célula-célula se ha observado anteriormente [20].