Extracto
El desarrollo de agentes de contraste de imágenes por resonancia magnética (IRM) que se pueden aplicar fácilmente para obtener imágenes de los tejidos biológicos que estén bajo el ámbito clínico es una tarea difícil. Esto se debe predominantemente a la expectativa de un agente MR ideales pudiendo ser sintetizado en grandes cantidades, que posee la vida útil más larga, la biocompatibilidad razonable, la tolerancia en contra de su agregación en los fluidos biológicos, y alta capacidad de relajación, lo que resulta en un mejor contraste durante la exploración biológica. A pesar de un repertorio de informes que abordan varios temas antes mencionados, los resultados se informó anteriormente están lejos de ser óptima, lo que requiere de mayores esfuerzos en esta área. En este estudio, hemos demostrado la fácil síntesis a gran escala de la magnetita cuasi-cúbico debajo de los 100 nm y magnetita /sílice core-shell (Mag @ SiO2) nanopartículas y su aplicación como agente de contraste T2 biocompatible para la resonancia magnética de los tejidos biológicos. Nuestro estudio sugiere que las nanopartículas de magnetita recubiertas de sílice reportados en este estudio potencialmente pueden actuar como agentes de contraste RM las mejoras introducidas por abordar una serie de cuestiones antes mencionadas, incluyendo la vida útil más larga y la estabilidad en fluidos biológicos. Además, nuestro
in vitro
y
in vivo
estudios demuestran claramente la importancia de recubrimiento de sílice hacia una mejor aplicabilidad de agentes de contraste para imágenes T2 cáncer
Visto:. Campbell JL, Arora J, Cowell SF, Garg A, P Eu, Bhargava SK, et al. La magnetita (2011) Cuasi-cúbico /sílice Core-Shell nanopartículas como agentes de contraste de MRI Mejorado para el cáncer de imagen. PLoS ONE 6 (7): e21857. doi: 10.1371 /journal.pone.0021857
Editor: Yi Wang, Universidad de Cornell, Estados Unidos de América
Recibido: 7 Febrero, 2011; Aceptado: June 8, 2011; Publicado: 1 de julio 2011
Derechos de Autor © 2011 Campbell et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:.. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el interés en los nanomateriales magnéticos ha persistido en los últimos décadas principalmente debido a sus aplicaciones en muchos campos, como la grabación magnética de datos, la detección, la catálisis y la biomedicina [1] - [5]. nanomateriales magnéticos han atraído una atención especial en la biomedicina, debido a su gran potencial para mejorar el diagnóstico de enfermedades disponibles en la actualidad, la prevención y los enfoques terapéuticos [6]. Por ejemplo, el potencial de las nanopartículas magnéticas para entregar con precisión fármacos altamente biotóxicos a lugares específicos en el cuerpo [6], así como su utilización como bio-sondas altamente especializados para el diagnóstico por imagen ha sido demostrado por unir marcadores biomoleculares a su superficie [1 ], [7]. Con estos avances, existe una demanda creciente para desarrollar nanomateriales magnéticos biocompatibles con capacidades de imagen ultra-sensibles con el fin de que puedan ser utilizados para una amplia gama de
sobre las aplicaciones de imágenes médicas in vivo.
la resonancia magnética (MRI) es considerado como una herramienta de formación de imágenes de gran alcance debido a su alta capacidad de resolución espacial, la naturaleza no invasiva y su capacidad para evitar la radiación en contraste con las técnicas de formación de imágenes nucleares, tales como la tomografía por emisión de positrones (PET) ionizante [8] - [10]. Brevemente, MRI opera mediante el aprovechamiento de la excepcionalmente pequeño momento magnético inherente en cada protón que, en virtud de la presencia de un campo magnético grande, produce un efecto medible como una señal de la imagen de RM en. Las señales producidas a través de la relajación T1 (spin-red relajación) o la relajación T2 (relajación espín-espín) depende de los parámetros de la secuencia programados para adquirir la imagen de RM. En general, en T1 y T2 ponderado imágenes proporcionan diferentes efectos de contraste entre el tejido fluido y el cuerpo. Por ejemplo T1 ponderado imágenes muestran tejidos fluidos como oscuros, a base de agua como tejidos grises y basados en grasas como brillantes, con lo que muestran muy claramente los límites entre los diferentes tejidos. Por el contrario, las imágenes ponderadas en T2, el líquido aparece brillante y el agua y los tejidos a base de grasa parece gris. El uso de agentes de contraste mejora en gran medida la especificidad y la sensibilidad de la RM acortando T1 o T2 de relajación de los protones de agua adyacentes a ellos, proporcionando así información más detallada acerca de la patología. agentes de T1 a base de gadolinio se usan más comúnmente en la RM, sin embargo, la creciente preocupación por la seguridad de los contrastes a base de gadolinio han dado lugar a un cambio importante hacia agentes T2 de contraste basados en óxido de hierro que se consideran ser relativamente biológicamente segura [11] - [ ,,,0],. 13]
Aunque, óxido de hierro agentes de contraste basados han sido aprobados clínicamente para MRI, su uso se ha restringido a predominantemente hígado /bazo de formación de imágenes (IAM-25 Feridex® - no está en uso ya) y el lumen gastrointestinal formación de imágenes (Lumirem® /Gastromark®). Esta limitación se debe principalmente al mayor tamaño de las partículas de óxido de hierro que participan en estos agentes, que se toman ya sea hacia arriba de inmediato por el sistema reticuloendothelium después de la administración intravenosa (Feridex®), o se administran por vía oral (Lumirem® /Gastromark®). Por lo tanto, existe una urgencia clínica para desarrollar agentes de contraste comercialmente viables y biológicamente seguras que se puede usar para RM de una amplia gama de tejidos del cuerpo [14] - [16]. Por otra parte, ha habido numerosos informes sobre diferentes rutas de síntesis a agentes de contraste a base de nanopartículas magnéticas, incluyendo nanopartículas magnéticas sintetizados biológicamente [17] - [18], las nanopartículas magnéticas con núcleos de dendrímero [19], liposomas superparamagnéticas [20], lípidos basan Los agentes de contraste de RM [21], dopado con nanopartículas magnéticas de metales [22] - [25], las partículas CoFe2O4 @ SiO2 con tintes fluorescentes incorporadas [26], y nanopartículas magnéticas tanto para aplicaciones terapéuticas [27] de imagen y. Además, en el entorno pre-clínica, la tendencia en los últimos años se ha dirigido hacia el desarrollo de pequeñas nanopartículas (nm-100 sub) de óxido de hierro [24], [28] - [31]. Los estudios anteriores sugieren que, para pasar de partículas de óxido de hierro inferior a una micra a su forma de nanopartículas en el entorno clínico, los retos que hay que superar incluyen su baja estabilidad química y biológica, pequeña vida útil, inherente de baja a alta citotoxicidad, y baja magnetización asociada a las nanopartículas de óxido de hierro, que ha sido abordadas por aunque algunos estudios recientes, en cierta medida, aún requiere esfuerzos adicionales en este ámbito [32] - [34]. Esto se produce principalmente debido a las propiedades antes mencionadas de agentes de contraste de RM fuertemente pueden depender de su ruta de síntesis.
En este manuscrito, nos dirigimos a la mayor parte de los problemas antes mencionados mediante la demostración de la elaboración de una ponderada en T2, a base de óxido de hierro agente de contraste de MRI con razonablemente baja citotoxicidad, alta capacidad de relajación, y una gran estabilidad particularmente notable que se puede almacenar a temperatura ambiente durante más de 6 meses sin ningún tipo de agregación visible. La estabilidad química de estas nanopartículas se consigue mediante el recubrimiento con una capa de sílice inorgánica (SiO2), que conduce a Mag @ SiO2 nanopartículas de núcleo-corteza. Las nanopartículas resultantes se analizaron mediante un dispositivo superconductor de interferencia cuántica de medición (SQUID), de alta resolución microscopía electrónica de transmisión (HRTEM), difracción de rayos X (XRD) y un escáner de MRI clínico 3 Tesla. Nuestros
in vitro
estudios indican que el recubrimiento con SiO2 hace que estas nanopartículas biocompatibles y que se toman de forma activa por las células de cáncer de próstata bajo
in vitro
condiciones. Nuestra preliminar
in vivo
estudios con un modelo animal de tumor de mama sugiere, además, su potencial utilidad como buenos agentes de contraste de MRI para obtener imágenes de tumores.
Resultados y Discusión
La figura 1A muestra la imagen TEM de las nanopartículas magnéticas (MAG), que indica que las nanopartículas Mag tal como se sintetiza preparados por nuestra ruta de síntesis eran casi cúbico en la morfología con buena monodispersidad y un tamaño medio de 40 ± 5 nm. En particular, el uso de nuestro enfoque, se podría lograr la síntesis a gran escala de las nanopartículas Mag (al menos hasta 10 g de partículas por lote) sin comprometer la forma de nanopartículas o monodispersidad. De la ampliación de la imagen TEM más alta, se encontró que estas nanopartículas Mag tener bordes esféricos, y parece como si estas nanopartículas constan de varias partículas esféricas más pequeñas que se ensamblan juntos dan lugar a estructuras cuasi-cúbico (recuadro Figura 1A). Es importante señalar que en condiciones de almacenamiento de temperatura ambiente, las nanopartículas cristalinas Mag pierden su morfología casi cúbico y se convierten esférica después de dos semanas de síntesis. La vida útil de los agentes de contraste de MRI comercialmente disponible es de hecho una de las principales limitaciones asociadas con aplicabilidad clínica de tales materiales. SiO
2 revestimiento de envuelta se ha demostrado previamente para proporcionar biocompatibilidad, estabilidad de las partículas, así como una superficie fácil para más biofuncionalización en diferentes nanomateriales [27] - [29]. Por lo tanto, para proporcionar estabilidad química de nanopartículas magnéticas, una cáscara de sílice se cultiva alrededor de las partículas Mag cuasi-cúbico (dentro de los 3 días de su síntesis), produciendo de esta manera nanopartículas core-shell Mag @ SiO2 (Figura 1B). El revestimiento de sílice controlada de nanopartículas Mag condujo a la formación de estructuras de núcleo-envuelta Mag @ SiO2 con un ca. 20 ± 2 nm de conchas de sílice alrededor de 40 ± 5 nm nanopartículas Mag cuasi-cúbico (Figura 1B y recuadro). Large análisis del área de TEM de las estructuras de núcleo-envoltura Mag @ SiO2 indicó que la mayoría de las nanopartículas Mag conservaron su morfología casi cúbico después del revestimiento de sílice, y más de ca. Se encontraron 75% de las partículas de la muestra a ser recubierto individualmente con una concha de sílice. Sin embargo, menos de ca. 25% de las estructuras consistía en dos o tres o sin partículas Mag dentro de la cáscara de sílice. En particular, este tipo de distribución de partículas es típico de una ruta de síntesis química, que no es necesariamente siempre reconoció de manera explícita en la literatura imperante. Además, se observó que después de recubrir nanopartículas Mag con sílice, las partículas de Mag @ SiO2 se mantienen estables en solución salina tampón fosfato (PBS) durante al menos hasta 1 mg /ml de concentración, así como en forma de polvo fácilmente dispersable en por lo por lo menos hasta 6 meses. La imagen de TEM muestra en la Figura 1B se adquirió después de 6 meses de almacenamiento de las nanopartículas Mag @ SiO2 a temperatura ambiente y fue similar a los fotografiado inmediatamente después de la síntesis. Esto sugiere que un revestimiento de sílice sobre nanopartículas Mag puede mejorar significativamente su estabilidad para las condiciones de almacenamiento a largo plazo, por lo que conserva sus propiedades magnéticas mediante la mejora de su vida útil. Este es uno de los parámetros cruciales para el desarrollo de agentes de contraste basados en resonancia magnética para aplicaciones clínicas y comerciales.
El recuadro muestra las respectivas imágenes de TEM de mayor resolución.
La figura 2 muestra los patrones de difracción de rayos X de Mag y Mag @ SiO2 nanopartículas. El patrón de difracción de rayos X obtenido a partir de nanopartículas Mag cuasi-cúbicos (curva 1), podría ser indexado basado en el patrón de difracción norma general, tras la magnetita (Fe
3O
4) con los picos principales indexados (archivo JCPDS No 75-0449). Después del recubrimiento de sílice, la mayoría de los picos de difracción que surgen de nanopartículas Mag todavía podía ser detectado. Sin embargo, curiosamente, después del revestimiento de sílice, un pico adicional a ca. Se observó 29,3 ° 2θ que pueda asignarse al (220) plano de un ferrosilicio
2 fases (curva 2) (archivo JSPDS. 73 a 0963 hay). La fase de Fe-Si mixta es más probable formada en la interfase de sílice y magnetita durante la síntesis de núcleo-corteza de nanopartículas Mag @ SiO2.
picos de XRD con reflexiones de Bragg de magnetita correspondiente se han indicado. (*) Corresponde al pico de XRD que surge de una fase de Fe-Si mixto.
High magnetización de saturación de agentes de contraste de RM es un requisito importante para las nanopartículas magnéticas para ser utilizado para la aplicación de resonancia magnética. La curva de histéresis magnética de nanopartículas Mag @ SiO2 obtenidos por medición SQUID se muestra en la Figura 3, que se encontró que no tienen campos coercitivos, lo que confirma su naturaleza superparamagnético. Se encontraron nanopartículas de SiO2 Mag @ poseer un valor relativamente alto de magnetización masa de 74,4 emu /g, lo que es comparable a la reportada previamente los valores de magnetización en masa de 72,9 emu /g de partículas de óxido de hierro disponibles comercialmente Resovist [35].
El Mag y Mag @ SiO2 sintetizado en este estudio se ensayaron adicionalmente por su capacidad para ser internalizado por las células PC3 de cáncer de próstata humano (Figura 4). Cuando se somete a estudios de captación de células durante 24 h, se encontraron 50 mg nanopartículas /mL Mag @ SiO2 ser especialmente captado por las células de cáncer de próstata PC3 de manera más eficiente que similares una concentración de nanopartículas Mag desnudos (comparar las figuras 4B y C). Cuando las células de cáncer PC3 fueron expuestos a nanopartículas Mag, se observó que las nanopartículas Mag desnudos sin ningún SiO
2 de recubrimiento tienden a formar grandes agregados (de dimensiones similares a tamaño de celda) en la solución durante un período de exposición de 24 h, lo que limita su capacidad de ser especialmente captado por las células PC3 (Figura 4B). Como se puede deducir de la figura 4B, estos grandes grupos de nanopartículas Mag desnudos predominantemente se fijan a la exterior de las células, y son difíciles de ser internalizado por las células cancerosas de próstata PC3. Por el contrario, después de SiO
2 de recubrimiento, las nanopartículas Mag @ SiO2 permanecen bien dispersos en la solución incluso después de 24 h, lo que facilita su captación eficaz por las células PC3, como puede verse a partir de una mayor densidad de nanopartículas Mag @ SiO2 dentro PC3 las células de cáncer de próstata (Figura 4C). Nuestro grupo y otros han demostrado previamente que el tamaño de las nanopartículas y la agregación en medios biológicos pueden desempeñar un papel crucial en los procesos de absorción celular, como la absorción no específica de sub-100 nanopartículas nm se observa generalmente a través de mecanismo de endocitosis de las células [36] - [ ,,,0],39]. La agregación de desnudos (vírgenes) nanopartículas Mag en medios biológicos, y la evitación de su agregación después del revestimiento de sílice sugiere claramente el importante papel de SiO recubrimiento
2, y la ventaja de Mag @ SiO2 nanopartículas core-shell sobre nanopartículas Mag desnudas para aplicaciones biológicas . Con base en los resultados de los estudios de absorción celular, se encontró que las nanopartículas cristalinas Mag se considere inadecuado para aplicaciones biológicas, y por lo tanto sólo nanopartículas Mag @ SiO2 fueron elegidos para estudios adicionales con respecto a su idoneidad para aplicaciones de MRI.
A partir de la estudios de absorción celular, también es evidente que las nanopartículas Mag @ SiO2 no causan ningún cambio significativo en la morfología de las células de cáncer de próstata PC3. Estudios previos indican que las nanopartículas de óxido de hierro no son tóxicos a la concentración más baja, pero puede ser ligeramente tóxico a concentraciones más altas [40] - [41]. basado en MTS antes de explorar las nanopartículas Mag @ SiO2 para la aplicación de la RM, el perfil de biocompatibilidad de estas partículas se evaluó mediante la realización de
in vitro
experimentos de citotoxicidad en células de cáncer de próstata PC3, que es una de las medidas de biocompatibilidad (Figura 5) . Es evidente de la Figura 5 que las nanopartículas Mag @ SiO2 no afectaron significativamente la viabilidad celular PC3 durante al menos hasta 50 mg ml-1 concentraciones de Fe, por lo que se mantuvo más de 85% de células PC3 viabilidad. Sin embargo aumentar aún más en Mag @ SiO2 concentración equivalente a 100 g nanopartículas ml
-1 Fe resultó en una pérdida de la viabilidad celular de ca. 30%. Esto sugiere que las nanopartículas de SiO2 Mag @ reportados en este estudio pueden ser adecuados para aplicaciones de MRI a menos de 50 mg ml
-1 rango de concentración de Fe. Sin embargo, este aspecto puede requerir una investigación más detallada, en la que tendrá que ser investigado efecto de Mag @ nanopartículas de SiO2 sobre el perfil de la producción de citoquinas de las células.
Desde nanomateriales magnéticos pueden modular los efectos de mejora de la señal de RM, la capacidad de nanopartículas Mag @ SiO2 como agente de contraste T2 MR fue evaluado en términos de su capacidad de relajación (R2 o velocidad de relajación, que es igual a 1 /T2, donde T2 es espín-espín tiempo de relajación) en un Tesla escáner 3 MRI clínica en un tiempo de eco ( TE) de 10,86 ms. La capacidad de relajación es una medida de la eficiencia de un agente de contraste MR para mejorar la relajación de protones y aumentar la eficiencia a la que se produce durante el contraste de la imagen MRI [42]. Las mediciones de capacidad de relajación se realizaron tanto en nanopartículas como suspensión en fantasmas, así como después de haber sido especialmente captado por las células de cáncer de próstata PC3. Se encontró que las nanopartículas de SiO2 Mag @ a tener un valor alto de relajación de 263,23 l /mmol /s en las suspensiones libres de células, y 230,90 l /mmol /s para las nanopartículas Mag @ SiO2 dentro de las células PC3. alto valor de capacidad de relajación (es decir, un mejor contraste MR) junto con el valor de magnetización de alta masa para la RM son consideraciones importantes en el desarrollo de agentes T2 de contraste, como el proceso de relajación espín-espín de los protones en las moléculas de agua que rodean las nanopartículas se ve facilitada por la gran magnitud de espines magnéticos en nanopartículas [43] - [44]. Por lo tanto, las nanopartículas Mag @ SiO2 con alta magnetización de masas y altos valores de capacidad de relajación pueden dar lugar a una fuerte disminución de la intensidad de señal de RM ponderada en T2, medida por resonancia magnética [45]. Esto es crítico en permitir que la actividad nanomolar de agentes de contraste, lo que facilitará en la reducción de la dosis total de agente de contraste a los pacientes.
Los datos relaxividad también sugiere una reducción en el valor de relajación de nanopartículas Mag @ SiO2 en células PC3 después de la captación celular en comparación con la de la suspensión. Este resultado corrobora bien con estudios anteriores, que mostraban que las capacidades de relajación de las nanopartículas de óxido de hierro nativos fueron más altos en comparación con los que después de la acumulación en las células [46] - [47]. Los mecanismos responsables de este efecto aún no han sido completamente entendido, sin embargo, posiblemente se puede atribuir al confinamiento de las nanopartículas dentro de los endosomas de las células diana, que puede provocar una acumulación de faltas de homogeneidad de campo magnético después de la compartimentación subcelular, que haría por el contrario estar ausente en nanopartículas uniformemente distribuidos en las suspensiones [48]. Además, la diferente disposición geométrica de las nanopartículas en las suspensiones y en las células, y el acoplamiento antiferromagnético posiblemente como resultado de la agrupación dentro de los compartimentos subcelulares pueden desempeñar algún papel en la reducción de los valores de capacidad de relajación después de la captación celular [28], [48]. Cabe destacar que, en contraste con los valores de relajación del 230 a 269 l /mmol /S, observado para las nanopartículas Mag @ SiO2 en este estudio, las nanopartículas comerciales basados Resovist se ha informado con valores más bajos de 151 l /mmol /s [35]. El valor de relajación observada de nanopartículas Mag @ SiO2 preparados de este estudio es también relativamente más altos que los reportados para partículas de magnetita sin dopar (218 l /mmol /s) en los últimos estudios detallados [24]. Para partículas magnéticas dopadas, se ha informado de que las altas capacidades de relajación de hasta 358 l /mmol /s se pueden conseguir por el dopaje magnetita con Mn (MnFe
2O
4) [24]. Sin embargo, el potencial de lixiviación de Mn durante la administración de estos agentes de contraste de RM en el cuerpo podría plantear problemas de citotoxicidad, y para el mejor conocimiento de los autores, hasta el momento no se han reportado sin dopar nanopartículas Mag @ SiO2 con estos altos valores de capacidad de relajación.
Además, los estudios relaxividad como una función de diferentes concentraciones de Fe en nanopartículas Mag @ SiO2, tanto como una suspensión de nanopartículas en fantasmas (Figura 6A), y después de 24 h de la absorción de nanopartículas por las células de cáncer de próstata PC3 (Figura 6B) reveló que Mag nanopartículas @ SiO2 actúan como agentes de contraste en T2 pendientes. Esto se demuestra por un efecto de imagen oscurecimiento, demostrada por caída en la intensidad de la señal R2 (ΔR2 /R2
Control) con el aumento de las concentraciones de Fe. Por ejemplo, a una concentración /mL Fe 100 mg, las nanopartículas Mag @ SiO2 proporcionan una mejora de la señal de ~ 90% en comparación con mejora de la señal de más de 70% durante la obtención de imágenes de células de cáncer de próstata PC3. Esta es una mejora significativa de la señal en comparación con la mayoría de los materiales se informó anteriormente, en los que se ha observado en general, sólo mejora de la señal 15 a 20% [28]. Se espera que este fuerte aumento de la señal MR a partir de nanopartículas de SiO2 Mag @ debido a sus relativamente altos valores de capacidad de relajación y la magnetización de saturación.
El panel A muestra los estudios realizados en fantasmas para las partículas en suspensión, mientras que el panel B muestra los estudios similares en PC3 células de cáncer de próstata humano después de nanopartículas de la utilización para los 24 h. Correspondientes imágenes de RM ponderadas en T2 de muestras diferentes, que muestran la imagen efecto de oscurecimiento al aumentar la concentración de Fe también se muestran debajo de cada barra.
in vivo
estudios de resonancia magnética en un ratón de tumor de mama modelo también demostró aumento de la señal T2 en el sitio del tumor mediante nanopartículas Mag @ SiO2 (Figura 7). Las imágenes siguientes
in vivo
administración de dosis de 10 mg de nanopartículas de SiO2 Mag @ demuestran su capacidad para producir la mejora MR del sitio del tumor con respecto al cuerpo. Ponderadas en T2 efectos de aumento de la señal de las nanopartículas Mag @ SiO2 una imagen de RM se visualizan como en el oscurecimiento o el contraste entre las zonas infiltradas con Mag @ nanopartículas de SiO2 y los que no tienen las nanopartículas. Los estudios futuros sobre Mag @ SiO2 se pueden adaptar para MRI específica, de la utilización de sus características magnéticas superiores en el diagnóstico de patologías.
Mouse 2 se inyectó con nanopartículas Mag @ SiO2 como agente de contraste T2, mientras que el ratón se inyectó con 1 solución salina como control. sitios de tumor en el control (ratón 1) y en el ratón tratado (ratón 2) han sido etiquetados como los círculos de color azul y rojo respectivamente. Los paneles C y D muestran las imágenes de sección transversal mayor aumento de sitio del tumor correspondiente a los paneles A y B, respectivamente, en la región del tumor inyectado con agente de contraste MR ha sido resaltado con círculos blancos.
En resumen, es importante consideraciones para un agente de contraste de MRI eficiente incluyen menor tamaño de partícula, su absorción por las células eficientes, la reducción de la agregación en los fluidos biológicos, la mejora de la vida útil, y una mayor biocompatibilidad. Un control sobre todos estos parámetros proporcionará una capacidad de dirigirse a una serie de aplicaciones de formación de imágenes moleculares /celulares sin causar toxicidad aguda para las células normales. Particularmente para aplicaciones de imágenes tumorales, sub-100 nm partículas pueden proporcionar una ventaja significativa, ya que el diámetro de corte de los poros de los vasos tumorales es de 400-600 nm [41] - [43], [49] - [51].
En este estudio, hemos demostrado una síntesis fácil, a gran escala de la magnetita cuasi-cúbico y nanopartículas Mag @ SiO2 de sub-100 nm de tamaño. Las nanopartículas de SiO2 Mag @ aquí presentados tienen una vida útil de más de 6 meses, y están especialmente captado eficientemente por las células sin causar agregación significativa o toxicidad celular. Se espera que la vida media biológica de las nanopartículas de óxido de hierro más pequeños y recubiertas de sílice para ser aumentado aún más debido a su interacción reducida con los fluidos corporales. Por tanto, este estudio pone de manifiesto claramente la importancia de SiO
2 de recubrimiento para mejorar la captación de nanopartículas de SiO2 Mag @ por las células cancerosas de próstata PC3, y la mejora de la vida útil de los agentes de contraste de RM. Las nanopartículas magnéticas compuestas de sílice actúan como agentes de contraste T2 tan prometedores que ofrecen una opción potencialmente viable como un agente de contraste MR comercial. Esto es atribuible a su pequeño tamaño, mejora de alta MR señal, biocompatibilidad relativa, mayor vida útil, y la química de superficie de sílice altamente modificable que permitirá la adhesión de marcadores moleculares múltiples para MRI específica en el futuro. Estas características de un agente de contraste T2 son altamente deseables para aplicaciones de imagen de resonancia magnética a nivel preclínico y clínico para su uso posterior.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
el modelo de ratón de tumor de mama se desarrolló en la casa, y todos los estudios con animales se pre-aprobado por el comité de ética animal institucional.
Materiales
todos los productos químicos fueron adquiridos de Sigma-Aldrich y se utilizaron como se recibieron sin más modificación. Las células de cáncer de próstata (línea celular PC3) se adquirieron de la American Type Culture Collection (ATCC). Una solución CellTiter 96 Aqueous Ensayo de proliferación celular kit (Promega) se adquirió de Promega Corporation.
Síntesis de nanopartículas de óxido de hierro
nanopartículas de óxido de hierro Quasi-cúbicos (que se refiere como "Mag ') se sintetizaron utilizando un proceso de dos etapas modificado significativamente de Park
et al
, lo que conduce a la síntesis a gran escala controlada [52]. Durante la síntesis, un complejo de oleato de hierro se formó primero disolviendo 5,4 g de cloruro de hierro y 18,25 g de oleato de sodio en una solución compuesta de 40 ml de etanol, 30 ml de agua destilada y 70 ml de hexano. Una vez homogeneizada, la solución se calentó a reflujo a 70 ° C durante 4 h, seguido de separación de la capa orgánica superior usando un embudo de separación, el lavado y la evaporación de hexano, dejando de ese modo un complejo de oleato de hierro ceroso. Los nanocristales de óxido de hierro se formaron mediante la disolución de 9,0 g del complejo de oleato de hierro en 1.425 g de ácido oleico y 63,3 ml de 1-octadeceno, seguido de reflujo en atmósfera de nitrógeno hasta que alcanzó 320 ° C, en cuyo punto la temperatura se mantuvo por 30 min y después se dejó enfriar a temperatura ambiente. 250 ml de etanol y después se añadió a la solución y las partículas de magnetita se separaron mediante centrifugación, seguido de tres ciclos de lavado con etanol. En particular, mediante el diseño de este protocolo, la escala de por lo menos hasta 10 g nanopartículas magnéticas por reacción podría lograrse fácilmente en condiciones de laboratorio.
Síntesis de óxido de hierro recubierto de sílice (Mag @ SiO2) nanopartículas
se prepararon nanopartículas de óxido de hierro recubierto de sílice (SiO2 Mag @) utilizando un método modificado de manera significativa a partir del colmillo
et al
y Morel
et al
[53] - [54], en el que se realizó hidrólisis controlada del precursor de sílice en presencia de nanopartículas de magnetita. En nuestro enfoque, partículas magnéticas pre-formados se utilizan como nucleante sitios para la posterior hidrólisis del precursor de sílice alrededor de ellos. Brevemente, se sometieron a ultrasonidos 1 mg de nanopartículas de óxido de hierro preparado en la etapa anterior en una solución que consiste en 15 ml de etanol y 2 ml de agua desionizada (MilliQ). 1 ml de amoníaco (solución al 25%) se añadió a la solución anterior mientras se está inmerso en un sonicador programado para encender durante 1 min en cada 10 min. Además, un agitador superior se utiliza adicionalmente para mezclar la solución mientras que 4 ml de 1:60 (orthosilicate:ethanol tetraetilo) se añadió a razón de 0,4 ml /h mediante una bomba de jeringa, y la solución se dejó en agitación a temperatura ambiente por 12 h. Las nanopartículas de óxido de hierro recubierto de sílice se centrifugaron, se lavaron tres veces con etanol y se volvieron a dispersar en agua Milli-Q.
Materiales caracterización
La morfología y el tamaño de Mag y Mag @ SiO2 nanopartículas se caracterizó utilizando JEOL 2010 microscopio electrónico de transmisión (HRTEM) de alta resolución funcionar a un voltaje de aceleración de 200 kV. Las muestras para mediciones HRTEM se prepararon partículas de gota de colada a una rejilla de cobre revestida de carbono, seguido de secado al aire. Se obtuvo el cristalografía de los polvos de nanomateriales en un difractómetro de rayos X Bruker D8 ADVANCE usando radiación Cu Ka. Para las mediciones magnéticas, se utilizó un magnetómetro basado dispositivo de interfaz cuántica superconductor (Quantum Design MPMS-XL5). El contenido de hierro de las soluciones de nanopartículas utilizadas para
in vitro
y
in vivo
estudios ha sido comprobada en un Varian AA280FS rápida secuencial Espectrómetro de Absorción Atómica (AAS) después de la digestión de las partículas durante la noche en ácido nítrico.
in vitro
estudios celulares y ensayos de citotoxicidad
próstata humano las células cancerosas (línea celular PC3) fueron cultivadas de forma rutinaria a 37 ° C en una atmósfera húmeda con 5% de CO2 utilizando RPMI 1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 1% penicilina, 1% de estreptomicina /penicilina y 1 mM de L-glutamina. Para sub-cultivo, las células de cáncer de próstata PC3 se separaron por lavado con tampón fosfato salino (PBS) y la incubación con solución de tripsina-EDTA (0,25% de tripsina, EDTA 1 mM) durante 5 min a 37 ° C, seguido por lavado e incubación con complementado medio RPMI 1641. Para la captación celular, las células se sembraron primero en placas de 24 pocillos de poliestireno durante 24 h, seguido de incubación con Mag y Mag @ SiO2 nanopartículas para 24 horas a 37 ° C en medio de células completa, y posterior tres veces el lavado de las células con PBS , antes de exponer en un microscopio invertido. Para los ensayos de citotoxicidad, se determinó la viabilidad de las células cáncer de próstata PC3 expuestos a nanopartículas Mag @ SiO2 en ausencia de medio de crecimiento celular. A CellTiter 96 acuoso Una célula de soluciones Ensayo de proliferación de kit (Promega) que contiene el compuesto de tetrazolio 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboximetoxifenil) -2- (4-sulfofenil) 2H-tetrazolio (MTS), se utilizó para controlar la viabilidad celular de acuerdo con los protocolos del fabricante. MTS cambio de color se controló usando un lector de placas a 490 nm, y los datos de la viabilidad celular se representó gráficamente considerando la viabilidad de las células no tratadas como 100%. Los experimentos se realizaron por triplicado, y las barras de error representan los errores experimentales estándar.
Imagen de Resonancia Magnética (MRI) los estudios se llevaron a cabo
estudios de resonancia magnética para las soluciones de nanopartículas almacenados en fantasmas, en las células de cáncer de próstata PC3 después la absorción de nanopartículas, y en un modelo de ratón con cáncer de mama. Para los estudios de resonancia magnética fantasma, fantasmas se prepararon en tubos Eppendorf con nanopartículas Mag @ SiO2 a tres concentraciones diferentes Fe (0,18 mM, 0,9 mM, 1,79 mM) y se utilizó una solución salina sin nanopartículas como control. Para
in vitro
estudios de resonancia magnética, las células de cáncer PC3 se cultivaron utilizando el protocolo anterior en placas de 24 pocillos de poliestireno, y se incubaron durante 24 h con nanopartículas Mag y Mag @ SiO2 a tres concentraciones diferentes (0,18 mM, 0,9 mM, 1,79 mM) y un control con las células, pero no las nanopartículas. mediciones de resonancia magnética para fantasmas y células PC3 se realizaron con un Tesla Clinical escáner Siemens Trio MRI clínica 3,0 usando una bobina de la cabeza 12 de canal y los parámetros siguientes: formación de imágenes ponderadas en T2, la secuencia de eco de gradiente, el tiempo de eco múltiple (TE) que van desde 0.99- 100 ms, tiempo de repetición (TR) = 2000 ms, matriz de 128 × 128, grosor de corte de 3 mm. velocidades de relajación (R2) se determinaron mediante el uso de una sola secuencia de eco (SE) con un TR constante de 2000 ms y múltiple TE que van desde 0.99-100 ms. La señal se representa como una función de tiempo de eco y equipado para obtener los valores de R2. Los valores de R2 de la Mag @ SiO2 en fantasmas y células PC3 se determinaron mediante el trazado de la capacidad de relajación a un TE de 10,86 ms, como una función de la concentración de hierro molar en muestras respectivas, y extrayendo el valor T2 de la pendiente por regresión lineal de los datos Los puntos obtenidos en los valores de concentración de Fe inferiores.