Extracto
RAD52
es un importante pero no recombinación homóloga de genes de reparación bien caracterizado que se puede unir a los extremos de una sola hebra de ADN y mediar la interacción ADN-ADN necesario para la hibridación de cadenas de ADN complementarias. Para evaluar el papel de
RAD52
variantes en la respuesta de las células tumorales a los agentes de platino, investigamos sus asociaciones con resistencia de platino y el pronóstico en pacientes con cáncer de cuello uterino. Se incluyó a 154 pacientes con carcinoma de células escamosas del cuello uterino, que se sometieron a cirugía radical entre 2008 y 2009, y el genotipo de tres
RAD52
variantes potencialmente funcionales mediante el ensayo de instantáneas. Hemos probado
in vitro
de resistencia de platino y la expresión RAD52 mediante el uso de los métodos de inmunohistoquímica y MTT, respectivamente. En 144 casos que tenían genotipo de datos, se encontró que tanto la variante rs1051669 y expresión de la proteína RAD52 se asociaron significativamente con la resistencia a carboplatino (
P = 0,024
y 0,028, respectivamente) y rs10774474 con la resistencia nedaplatino (
P
= 0,018). La variante rs1051669 se asoció significativamente con la expresión de la proteína RAD52 (OR ajustada = 4,7 IC 95% = 1,4-16,1,
P = 0,013
). Cuando estos tres
RAD52
variantes se combinaron, la supervivencia libre de progresión fue menor en los pacientes que llevaban al menos un (≥1) alelo variante en comparación con los que no tienen ninguno de los alelos variantes (
P
= 0,047). Por lo tanto, ambos
RAD52
variantes y expresión de proteínas se puede predecir la resistencia de platino, y
RAD52 variantes
aparecido para predecir el pronóstico en pacientes con cáncer de cuello uterino. Los estudios a gran están garantizados para validar estos hallazgos
Visto:. Shi T-Y, Yang G, Tu X-Y, Yang J-M, Qian J, Wu X-H, et al. (2012)
RAD52 variantes
predecir la resistencia de platino y pronóstico del cáncer de cuello uterino. PLoS ONE 7 (11): e50461. doi: 10.1371 /journal.pone.0050461
Editor: Shannon M. Hawkins, Baylor College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 16 Julio, 2012; Aceptado: 22 Octubre 2012; Publicado: 29 Noviembre 2012
Derechos de Autor © 2012 Shi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por la Fundación Ciencia para jóvenes Investigadores de la Universidad de Fudan. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer cervical es el tercer tipo de cáncer más comúnmente diagnosticado y la cuarta causa de muerte por cáncer en las mujeres, que representan el 9% (529.800) de todos los nuevos casos de cáncer y el 8% (275.100) de todas las muertes por cáncer entre las mujeres en 2008 en el mundo [1]. Más del 85% de estos casos y muertes se producen en los países en desarrollo, incluyendo a China [1]. quimiorradioterapia concomitante es la terapia estándar que se utiliza con mayor frecuencia en los pacientes con carcinoma de células escamosas del cuello uterino (CSCC) que han avanzado a nivel local [2], [3] y recurrente y /o metastásico [4] enfermedades. Sin embargo, la quimiorresistencia primaria o adquirida es un problema clínico grave que contribuye a la recurrencia de la enfermedad, la progresión y la mortalidad específica de la enfermedad [5] - [7]. El mecanismo de respuesta heterogénea subyacente de los pacientes es multifactorial y puede incluir múltiples factores genéticos. Algunos de estos factores genéticos de forma fiable y prospectiva se puede evaluar por su papel en la determinación de la respuesta a los agentes contra el cáncer.
reparación del ADN es el principal responsable de la reparación y /o eliminación de aductos de ADN-platino. Esta reparación del ADN consiste en las actividades coordinadas de más de 20 enzimas que eliminar y restaurar un segmento de ADN que contiene un aducto voluminosos [8]. reparación de recombinación homóloga (HRR) es un mecanismo de reparación del ADN importante para reparar roturas de la doble hebra (DSB) durante las fases S y G2 [9], que es un mecanismo de defensa celular contra los efectos citotóxicos de los agentes quimioterapéuticos basados en platino [10] - [13].
RAD52
, como un gen HRR relativamente menos bien caracterizado, se extiende de 37,6 kb en el cromosoma 12p12.2-13 y códigos para una proteína con 417 aminoácidos, que puede unirse a los extremos de una sola hebra de ADN y mediar en la interacción ADN-ADN necesario para la hibridación de cadenas de ADN complementarias [14]. Recientemente, Tassone et al. informó que una sobreexpresión de
RAD52
ARNm en células HCC1937 BRCA1 defectuoso se asoció con una alta sensibilidad a los compuestos de platino derivados [15]. Por lo tanto, la hipótesis de que
RAD52
pueden estar involucrados en la resistencia de platino en las células cancerosas.
polimorfismos de nucleótido único (SNPs) en genes implicados en la reparación del ADN pueden afectar a los sitios de unión a proteínas o afinidad o causar cambios en la estructura de proteínas y por lo tanto pueden modificar las funciones de genes y hacer que las células cancerosas sean más sensibles al tratamiento de platino [16], [17]. Hasta la fecha, pocos estudios reportados han investigado las asociaciones de
RAD52
SNPs con el riesgo de malignidad [18], [19], y ninguno ha evaluado esto con la quimio-resistencia. En el presente estudio, se evaluó la asociación de tres potencialmente funcional
RAD52
SNPs con
in vitro
resistencia de platino y el pronóstico en pacientes con CSCC.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
Este proyecto fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad Fudan de Shanghai Centro de cáncer (FUSCC). Un escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los individuos reclutados, y se llevó a cabo cada investigación clínica de acuerdo con los principios expresados en la Declaración de Helsinki consentimiento.
Los pacientes
En el presente estudio, se reclutaron 154 CSCC pacientes que tuvieron una histerectomía radical y linfadenectomía pélvica entre marzo de 2008 y marzo de 2009 en la Universidad del Centro de cáncer de Shanghai Fudan (FUSCC). Todos los casos fueron diagnosticados histológicamente como carcinoma de células escamosas por dos patólogos ginecológicos (xyt y GY). La información clínica detallada se extrae de la base de datos electrónica de los pacientes en FUSCC e incluyó la edad, estadio tumoral (FIGO, la Federación Internacional de Ginecología y Obstetricia, 2009), el tamaño del tumor (es decir, el diámetro del tumor más grande reportado por el patólogo después de la resección quirúrgica) , los ganglios linfáticos pélvicos (LN) metástasis, invasión linfovascular espacio (LVSI) y la profundidad de la invasión del estroma cervical. Los pacientes fueron seguidos cada tres meses durante los dos primeros años, cada seis meses durante los próximos dos años, y anualmente para los años siguientes a partir de entonces. El análisis de todas las muestras de sangre y tejidos se llevó a cabo de una manera ciega con respecto al estado de la quimiorresistencia y la supervivencia de los pacientes.
Selección SNP
Los SNPs fueron seleccionados de la base de datos NCBI dbSNP (http : //www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP), la base de datos Proyecto Internacional HapMap (http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/) y el software de predicción de la función SNP (FuncPred) (http : //snpinfo.niehs.nih.gov/snpfunc.htm) sobre la base de cuatro criterios: 1) situados en los dos extremos de la
RAD52
gen [es decir, flanqueante 5 ', la región 5' no traducida (UTR), 3'-UTR, flanqueante 3 '], 2) tenía una frecuencia del alelo menor de al menos 5% en la población china, 3) en bajo desequilibrio de ligamiento utilizando un
r
2 umbral de 0,8 para los demás, y 4) predijo SNPs como potencialmente funcionales en microARN (miARN) los sitios o factor de transcripción sitios de unión de unión. Como resultado, tres
fueron seleccionados RAD52
SNPs, y son rs1051669G & gt; A (3'-UTR), rs10774474A & gt; T (flanqueante 5 ') y rs11571378T & gt; A (flanqueante 5')
Extracción de ADN y genotipificación
DNA genómico se obtuvieron a partir de muestras de sangre entera usando un QuickGene ADN Whole Blood Kit (Fujifilm Co., Tokio, Japón) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. pureza del ADN y la concentración se determinó por medición espectrofotométrica de la absorbancia a 260 y 280 nm por Synergy ™ 4 Multi-Mode lector de microplacas (BioTek, Winooski, VT).
Los SNPs seleccionados fueron genotipo utilizando el ensayo multiplex instantánea. Los cebadores para la amplificación por PCR de extensión y de instantáneas fueron diseñados para tener una temperatura de hibridación alrededor de 60 ° C utilizando el software Primer5. Para la prueba de posibles secuencias repetitivas, cebadores fueron alineadas con la base de datos GenBank utilizando la herramienta en línea BLAST. AutoDimer Software fue utilizada en la detección de estructuras de horquilla potenciales y las posibles combinaciones de cebadores de dímero. Todos los cebadores fueron sintetizados por Sangon Biotech Co., Ltd. (Shanghai, China). Después de la amplificación y purificación, los productos de PCR se mezclaron y se utilizó como molde en la reacción de extensión de instantánea. Entonces, la electroforesis se realizó en el ABI 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA) para comprobar la calidad de los productos de PCR. Los datos de genotipos se analizaron finalmente por Peak software del escáner versión 1.0 (Applied Biosystems). El diez por ciento de las muestras se seleccionaron al azar para ser secuenciado. Como resultado, la tasa de genotipado media fue de 93,5% utilizando el ensayo multiplex instantánea. La tasa de discrepancia en todos los controles positivos (es decir, las muestras duplicadas, muestras superpuestas de los estudios y las muestras seleccionadas al azar para ser secuenciados anteriores) fue inferior a 0,1%.
El MTT de ensayo [20]
al realizar el ensayo de MTT, se consideró que ya se ha informado concentraciones plasmáticas máximas (PPC) para los cuatro agentes de platino seleccionados: cisplatino 10 mg /ml (Qilu Pharmaceutical Co., China; clínica de dosis de 100 mg /m
2) [21] , carboplatino 20 mg /ml (Qilu Pharmaceutical Co., china; clínica de dosis de 450 mg /m
2) [22], nedaplatino 10 mg /ml (Nanjing Dongjie Pharmaceutical Co., china; clínica de dosis de 100 mg /m
2) [23] y oxaliplatino 12 mg /ml (Nanjing Pharmaceutical Factory Co., china; clínica de dosis de 130 mg /m
2) [24]. En el ensayo real, hemos utilizado 10 × PPC como la concentración final de trabajo para cada uno de estos agentes de platino según lo recomendado anteriormente [25], [26].
punto de vista histopatológico confirmó los tejidos tumorales recientes obtenidos en la cirugía fueron cortadas en trozos de menor que 5 × 5 mm y se suspendieron en el medio RPMI 1640 (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO) que se suministra con 15% de suero bovino fetal (Gibco, Langley, OK) a temperatura ambiente. las células de cáncer en suspensión se vierte sobre una malla de acero estéril 150 micras colocado en el plato. Percoll centrifugación en gradiente discontinua con 400 g se utilizó para separar y purificar las células de cáncer como se recomienda anteriormente [20]. Las células cancerosas se identificaron mediante el uso de la H & amp; E tiñeron examen morfológico y después se resuspendieron a una concentración de 1 × 10
5 células viables /ml y se cultivaron en microplacas de 96 pocillos a 37 ° C en un 5% de CO
2 incubadora. En el segundo día, 90 l de medio RPMI 1640 suministrado con suero bovino fetal 15% y 10 l de las soluciones con 100 × PPC para cada uno de los agentes seleccionados se mezclaron durante 48 h. Para cada paciente, 100 l de suspensión de células de cáncer sin agentes de platino se cultivaron como controles de ensayo negativas. En el cuarto día, 20 MTT l (/5 mg ml, Shanghai Lanji Co., China) se añadió a cada pocillo a 37 ° C durante 4 h, y luego 100 pl de tampón de solución (10% de SDS, 5% isobutanol y 0,012 mol /L HCl) se añadieron en cada pocillo durante la noche para disolver los cristales de formazán. Las densidades ópticas (OD
570 nm) se midieron por lector de microplacas (Bio-RAD550, Hercules, CA). La tasa de inhibición se obtuvo mediante el uso de la fórmula de (1-DO
platino /OD
control) x 100%.
Tejido de microarrays, inmunohistoquímica (IHC) y la Evaluación de Ensayo de Inmuno tinción
las porciones de tejido tumoral /normal a ser utilizados para el microarray de tejido fueron seleccionados de un área del tumor representante /normal en el correspondiente amp H &; e sección de cada bloque manchada por dos patólogos ginecológicos (XYT y Gy). Un 10 × 12 (120 núcleos) serie fue hecha por el Banco de Tejidos de FUSCC, que también incluyó 17 controles de tejidos cervicales normales. Para cada paciente, dos núcleos se hicieron a partir de fuentes separadas. IHC se realizó en 5 secciones de tejido micras de espesor, preparadas a partir de tejido incluido en parafina y fijado en formalina del bloque de microarrays de tejidos construidos usando anticuerpos contra RAD52 [sc-8350, anticuerpo policlonal de conejo, Santa Cruz de Biotecnología (Inc, Santa Cruz, CA ), dilución 1:50] y kit de detección de ChemMate ™ EnVision ™ (DAKO, Glostrup, Dinamarca). Una muestra positiva conocida se incluyó como control positivo. Para el control negativo, el anticuerpo primario fue reemplazado con suero de conejo no inmune.
IHC resultados de la tinción se puntuaron de forma independiente por dos patólogos ginecológicos (xyt y GY), que fueron cegados a la información del paciente, utilizando BX51 microscopio y cámaras DP25 (Olympus Co., Tokio, Japón). El sistema de puntuación se basa tanto en el porcentaje de células positivas y la intensidad de la tinción, tal como se describe anteriormente [27]. La evaluación del estado de expresión de la proteína se define como negativo (≤2 +) y positivo (& gt; 2+). Para núcleos que eran imposibles de interpretar debido a la pérdida de tejido o la falta de células, una puntuación de no aplicable (N /A) fue dado.
Métodos Estadísticos
Debido a que las tasas de platino-inhibición no siguieron distribuciones normales, se realizó el no paramétrico
Wilcoxon
prueba y
Kruskal-Wallis
prueba para comparar las tasas de platino de inhibición para cada agente, tanto entre los agentes y entre los diferentes grupos. χ de Pearson
2-test y análisis de regresión logística se utiliza también para evaluar la asociación entre
RAD52
genotipos y expresión de la proteína. Para el análisis de supervivencia, la supervivencia libre de progresión (SLP) y los tiempos de supervivencia global (SG) se calcularon a partir de la fecha de la primera cirugía a la fecha de la recurrencia de la enfermedad y la muerte, respectivamente. Los pacientes sin progresión, perdieron durante el seguimiento o murieron por otras causas fueron censurados en su última fecha de registro.
de Kaplan-Meier
estimación de la supervivencia y la prueba de log-rank se calcularon para evaluar la SLP y la SG. Se realizó el análisis de riesgos proporcionales de regresión de Cox para evaluar los efectos de
RAD52
genotipos sobre la probabilidad acumulada de supervivencia en pacientes CSCC. Cada informado
P
valor fue de dos caras, y
P Hotel & lt; 0,05 se utiliza para inferir la significación estadística. Todos los análisis se realizaron utilizando el software SAS (versión 9.1; SAS Institute, Cary, NC).
Resultados
Características de los pacientes e in vitro de inhibición de Platino tarifas por el ensayo MTT
p
Genotipado no tuvo éxito en 10 casos después de los ensayos repetidos. Por lo tanto, el análisis final incluyó 144 pacientes CSCC, cuya clínica y patológica características se resumen en la Tabla 1. La edad media de los pacientes al momento del diagnóstico fue de 46,5 años (rango, 20-70 años). distribución de los estadios FIGO fue de 68 etapas IB (47,6%), 67 (46,9%) en estadio IIA y ocho (5,6%) en estadio IIB. Los pacientes con un tamaño del tumor mayor de 4 cm representaron el 43,8% (63/144) de los casos. Cuarenta y nueve (34,0%) y 50 (34,7%) pacientes tenían metástasis positivos LN pélvica y LVSI positivo, respectivamente. Había 109 (75,7%) casos de cáncer cuyas células invadido más de media capa de estroma del cuello uterino. La mediana de seguimiento fue de 37,6 meses (rango, 32.1-41.6 meses), y hubo 20 (13,9%) recidivas y 10 (6,9%) muertes durante el período de seguimiento.
La mediana
in vitro
tasa de inhibición del crecimiento de células cancerosas por el cisplatino, carboplatino, nedaplatino y oxaliplatino fue de 80,8%, 34,3%, 76,4% y 52,0%, respectivamente (Figura 1). Mediante el uso de la etiqueta
Kruskal-Wallis
prueba, se encontró que los cuatro agentes de platino mostraron una diferencia significativa en la inhibición de las células cancerosas (
Kruskal-Wallis
prueba,
P Hotel & lt; 0,001; Figura 1). Cisplatino y nedaplatino ambos tenían un mayor efecto en la inhibición de las células cancerosas que hizo carboplatino (
Kruskal-Wallis
prueba,
P Hotel & lt; 0,001; Figura 1). Además, no se observó ninguna diferencia significativa en las tasas de inhibición entre el cisplatino y grupos nedaplatino (
Wilcoxon
prueba,
P = 0,269
; Figura 1). Para cada compuesto de platino, se compararon sus tasas de inhibición en diferentes grupos en función de diversas características clínicas y patológicas, pero no se encontraron diferencias significativas (datos no mostrados).
La mediana
in vitro de inhibición
tasa de crecimiento de células de cáncer por el cisplatino, carboplatino, nedaplatino y oxaliplatino fue 80,8%, 34,3%, 76,4% y 52,0%, respectivamente, y marcado con "-". Cuatro grupos mostraron una diferencia significativa en la inhibición de las células cancerosas (
Kruskal-Wallis
prueba,
P
& lt; 0,001). No se observó ninguna diferencia significativa en las tasas de inhibición entre el cisplatino y grupos nedaplatino (
Wilcoxon
prueba,
P = 0,269
).
Asociación entre RAD52 SNPs e in vitro Platinum-inhibición tarifas
Todas las distribuciones genotípicas observadas entre los pacientes de acuerdo con el equilibrio de Hardy-Weinberg (HWE,
P = 0,533
y 0,115 para rs1051669 y rs10774474, respectivamente), a excepción de rs11571378 (
P = 0,0004
). En general, las variantes alélicas y rs1051669A rs10774474T se asociaron significativamente con la resistencia de platino. Las células cancerosas con rs1051669AA y rs10774474TT homocigotos variantes tuvieron menores respuestas a carboplatino y nedaplatino, respectivamente (
Kruskal-Wallis
prueba,
P = 0,024
y 0.018, respectivamente, Tabla 2). En concreto, asumiendo un modelo genético recesivo, se encontró que los pacientes que llevaban el genotipo TT rs10774474 había un aumento significativo de la resistencia a la nedaplatino, en comparación con aquellos que llevaron a AA /AT genotipos (
Wilcoxon
prueba,
P
= 0,027). Los portadores del genotipo rs1051669 AA parecían haber aumentado la resistencia carboplatino en comparación con el genotipo GG queridos /AG pero esto no fue estadísticamente significativa (
Wilcoxon
prueba,
P = 0,074
). No se encontró asociación significativa entre los
Tarjetas telefónicas tasas de inhibición in vitro y el SNP rs11571378.
asociación entre las características clinicopatológicas, RAD52 SNPs y Supervivencia
Después de ajustar por los pacientes 'edad, estadio FIGO, tamaño tumoral, metástasis LN pélvicos, LVSI y la profundidad de la invasión del estroma, no encontramos una asociación independiente de una sola variante, solo, con los pacientes de la supervivencia (datos no mostrados). Sin embargo, cuando se combinaron los tres SNPs seleccionado RAD52, los pacientes portadores de al menos un (≥1) alelo variante (es decir, rs10774474T, rs11571378A y rs1051669A) tenían más pobres SLP y la SG en comparación con los que no tienen ninguno de los alelos variantes (log-rank test ,
P = 0,047
y 0,162, respectivamente;. Figura 2A y 2B)
Los pacientes portadores de al menos un (≥1) alelo variante (es decir, rs10774474T, rs11571378A y rs1051669A) tenían más pobre la supervivencia libre de progresión y la supervivencia global en comparación con los que no tienen ninguno de los alelos variantes (prueba de log-rank,
P = 0,047
y 0,162, respectivamente). RAD52 (C) negativo y (D) la expresión positiva con un bajo fondo citoplasmática fue detectado por el anticuerpo sc-8350 (400 ×).
RAD52 SNPs asociados con la expresión de la proteína RAD52
Para evaluar más a fondo verosimilitud biológica subyacente a la asociación observada, se realizó el análisis IHC de los tejidos diana y encontramos que RAD52 se localizó en el núcleo (Figura 2C y 2D). Las puntuaciones medias de los niveles de expresión de proteína RAD52 fue de 1,6 ± 1,8 y 4,2 ± 1,8 para el cáncer de cuello uterino y de los tejidos normales, respectivamente. De los 144 casos analizados, 109 (75,7%) eran RAD52 negativo, 30 (20,8%) eran RAD52 positiva y cinco (3,5%) eran RAD52 N /A. La tasa positiva de expresión (& gt; 2 +) de la proteína RAD52 en tejidos de cáncer de cuello uterino fue del 22% (30/139) en comparación con 88% en los tejidos normales (15/17) (χ
2-prueba,
P Hotel & lt; 0,001). Las distribuciones de genotipo de los gt rs1051669G y; A, rs10774474A & gt; T y rs11571378T & gt; A SNP en los pacientes que Rad52-negativos y positivos se muestran en la Tabla 3. En los modelos genéticos dominantes, los portadores de AG /AA variante rs1051669 mostraron una significativa disminución de nivel de expresión de la proteína RAD52 en pacientes CSCC, en comparación con los portadores del genotipo variante GG [análisis de regresión logística, cociente de probabilidad ajustado (OR) = 4,7, intervalo de confianza del 95% (IC = 1,4-16,1),
P = 0,013
; Tabla 3]. Además, la tasa de RAD52-negativo se asoció significativamente con una mala respuesta de las células de cáncer de cuello uterino a carboplatino (
Wilcoxon
prueba,
P = 0,028
; Tabla 2). Sin embargo, no se encontró ninguna correlación significativa entre la expresión de la proteína RAD52 y la supervivencia de los pacientes (datos no mostrados).
Discusión
La resistencia a la quimioterapia basada en platino es un challege en clínica la práctica [5] - [7]. En el presente estudio, para evaluar la resistencia de platino, se realizó el ensayo MTT que fue ampliamente utilizado para la prueba de sensibilidad química, y su precisión global era de unos 81,3% para predecir el efecto clínico en cáncer ginecológico [28]. Se encontró que la tasa de inhibición de nedaplatino y cisplatino a células de cáncer cervical son mucho más altas que la de carboplatino y oxaliplatino, independientemente de las variables clínicas y patológicas. Este hallazgo es consistente con las recomendaciones actuales de las guías de la NCCN que el cisplatino ser la primera opción para la quimioterapia del cáncer de cuello uterino. Nuestras conclusiones respecto nedaplatino también son consistentes con los datos clínicos publicados. cada vez más datos han sugerido que nedaplatino es tan efectivo como el cisplatino con menos digestivo y la toxicidad renal y puede ser una opción alternativa prometedora para pacientes con cáncer de cuello uterino [29]. Sin embargo, se requieren ensayos clínicos aleatorios más grandes para validar este hallazgo.
Es bien sabido que la reparación del ADN juega un papel importante en la resistencia de platino y cualquier perturbación en la reparación del ADN puede conducir a una alteración de la sensibilidad al tratamiento [30 ], [31]. DSB, la forma más letal de daño en el ADN inducido por radiación ionizante agentes y platino, se reparan por dos grandes vías-HRR de reparación y de extremos no homólogos de unión [32]. Se ha sugerido que una elevada frecuencia de DSBs y aberraciones cromosómicas se observan 16-24 h después de la exposición cisplatino [33] y la supresión de proteínas relacionadas que participan en la vía HRR puede ser responsable de la resistencia al cisplatino [34]. En
Saccharomyces cerevisiae
, levadura
RAD52
juega un papel clave en la replicación asociada HRR [35]. RAD52 de levadura y de mamíferos RAD52 muestran la secuencia de aminoácidos similar y actividades bioquímicas, lo que sugiere su función conservada [36]. Los datos previos han demostrado que los mamíferos RAD52 podría responder a ADN DSBs y replicación estancamiento independientemente de BRCA2, en calidad de una vía de HRR independiente y alternativa [37]. Por ejemplo, la ausencia de la proteína RAD52 dio lugar a extensas aberraciones cromosómicas, especialmente los de tipo cromátida aberraciones [37], y los agentes de platino pueden unirse directamente al ADN, dando lugar a diferentes tipos de lesiones del ADN [38]. Además, la regulación a la baja de
RAD52
mRNAs se asoció con una mala respuesta de las células a los compuestos de platino derivados en células HCC1937 BRCA1 defectuoso [15]. Consistentemente, en el presente estudio, se encontró que el estado de expresión de la proteína RAD52-negativo se asoció con una pobre respuesta de las células de cáncer de cuello uterino al carboplatino. Por lo tanto,
RAD52
pueden estar involucrados en la formación de resistencia de platino. Sin embargo, se necesitan estudios adicionales para explorar los mecanismos subyacentes a los niveles de expresión observados bajo RAD52 que jugará un papel decisivo a la quimioterapia del cáncer de cuello uterino.
A lo mejor de nuestro conocimiento, este es el primer estudio que se centró en el valor predictivo de
RAD52
las variaciones en la resistencia de platino y el pronóstico en CSCC. Curiosamente, se observó que la distribución de los genotipos entre los pacientes rs11571378 partió de HWE, pero no predecir cualquiera de los resultados clínicos. Por el contrario, los otros dos SNPs (es decir, rs1051669 y rs10774474), cuyas distribuciones de genotipo entre los pacientes seguidos HWE, se asociaron de forma independiente con el
in vitro
tasas de inhibición de carboplatino y nedaplatino en las células CSCC, respectivamente, lo que indica un papel importante de
RAD52
variantes de resistencia de platino. En realidad, estos dos SNPs son ambos predijeron como potencialmente funcional. Por ejemplo, el SNP rs1051669 está situado en el 3 'UTR de
RAD52
y puede estar en un sitio de unión miARN rompen la interacción de los genes miARN-mRNA y afectan a la expresión de los genes miARN específicos [39]. Del mismo modo, el SNP rs10774474 se encuentra en la corriente arriba de
RAD52
, lo que podría ser un sitio de unión al factor de transcripción que participan en redes reguladoras de genes, tales como vías de reparación del ADN [40]. Por otra parte, la proteína RAD52 niveles de expresión se asociaron con tasas de inhibición de carboplatino, un resultado similar al observado para
RAD52
-rs1051669 SNP. Curiosamente, nuestra correlación genotipo-fenotipo también análisis demostraron que el SNP rs1051669 se asoció significativamente con los niveles de expresión de la proteína RAD52. Por lo tanto, parece biológicamente plausible que el
RAD52
-rs1051669 SNP puede ser funcional mediante la regulación de la expresión de RAD52 y por lo tanto contribuir a la resistencia de platino en pacientes con cáncer de cuello uterino.
de Kaplan-Meier
estimaciones de supervivencia mostraron además que los pacientes que llevaban al menos un (≥1) alelo variante de tres
RAD52
SNPs presentaron una SSA significativamente más pobres que aquellos que no llevan a ninguna de las variantes alélicas, lo que indica el efecto de
RAD52
SNPs en el pronóstico de los pacientes CSCC. Debido a que estos genotipos variantes pueden predecir la expresión de la proteína, la hipótesis de que los niveles de expresión de proteínas Rad52 pueden predecir la supervivencia en el cáncer de cuello uterino. Sin embargo, en el presente estudio, no se observó ninguna asociación entre los SNPs individuales o los niveles de expresión de la proteína RAD52 y la supervivencia, lo que podría deberse al tiempo de seguimiento relativamente corto con eventos limitadas de recurrencias y muertes. Sin embargo, algunos datos publicados sobre otros tipos de cáncer apoyan nuestra hipótesis, aunque no se han publicado estudios sobre el cáncer de cuello uterino hasta la fecha. Recientemente, Jewell et al. informó de que la sobreexpresión de
RAD52
mRNA puede predecir la SLP pobres con un riesgo relativo de 4,49 en el melanoma y que las células cancerosas con genes upregulated de vías de reparación del ADN eran propensos a ser más agresivo [41].
En resumen,
RAD52
SNPs, ya sea individual o colectivamente, puede modificar la función del gen y alterar los niveles de expresión de proteínas RAD52, haciendo así resistente a los agentes de platino de células de cáncer. Se requieren estudios prospectivos más grandes con el tiempo de seguimiento más largo para validar nuestros resultados.
Reconocimientos
Nos gustaría dar las gracias a Yunhua Ling, Guangqi Qin y Hongyu Gu del Centro de Cáncer de la Universidad Fudan de Shanghai para llevar a cabo
in vitro
técnicas de ensayo MTT, los microarrays de tejidos e inmunohistoquímica, respectivamente, y gracias al profesor Zhan Shaokang de la Escuela de Salud Pública de la Universidad de Fudan de apoyo análisis estadístico. Agradecemos también el Prof. Mario Leitao desde el Centro de Cáncer Memorial Sloan-Kettering para la revisión de este documento.