humano
Extracto
RB1
inducible espiral de la bobina 1 (RB1CC1, también conocido como FIP200) desempeña un papel en la mejora de la vía de RB1 a través de la unión directa a una región aguas arriba 201bp rica en GC (de la iniciación ATG) de la
RB1
promotor. Aquí, hemos identificado hSNF5 y p53 como las parejas de unión de RB1CC1 por ensayos de inmunoprecipitación e inmunofluorescencia. La interacción entre estas moléculas y la vía RB1 se analizó mediante los ensayos de inmunoprecipitación de la cromatina, la luciferasa-reportero, reacción en cadena de la polimerasa con transcripción y inmunoblot. La supresión del crecimiento del tumor por RB1CC1 se evaluó por citometría de flujo o mediante un ensayo de crecimiento celular. El complejo RB1CC1 nuclear relacionado con hSNF5 y /o p53 se activa la transcripción de
RB1
,
p16
y
p21
, y el crecimiento de las células tumorales suprimida. Además, la expresión RB1CC1 nuclear correlacionó significativamente con los de RB1 y p16 en el tejido de cáncer de mama
in vivo
, y el índice de proliferación Ki-67 fue dependiente de p53, así como RB1CC1. El presente estudio indica que RB1CC1 junto con hSNF5 y /o p53 aumenta la vía RB1 través de la activación transcripcional de
RB1
,
p16
y
p21
. Se espera que la evaluación de la expresión RB1CC1 combinado con RB1 y p53 para proporcionar información útil en la práctica clínica y futuras estrategias terapéuticas en el cáncer de mama
Visto:. Chano T, Ikebuchi K, Ochi Y, Tameno H, Y Tomita, Jin Y, et al. (2010) RB1CC1 Activa Camino RB1 e inhibe la proliferación y la supervivencia en el cáncer Cologenic humano. PLoS ONE 5 (6): e11404. doi: 10.1371 /journal.pone.0011404
Editor: Joseph Alan Bauer, Fundación de Investigación Bauer, Estados Unidos de América
Recibido: 9 de noviembre de 2009; Aceptado: June 9, 2010; Publicado: 30 de junio 2010
Derechos de Autor © 2010 Chano et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado en parte por KAKENHI (subvención-en-Ayudas a la Investigación Científica en Áreas prioritarias; Nº 20012025) del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología, Japón; y la Sociedad Japonesa de Medicina de Laboratorio Fondo para la Promoción de la Investigación Científica. Estas fuentes de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
La proteína supresora de tumores retinoblastoma (RB1) regula G1 /S-fase de la progresión del ciclo celular y es un mediador crítico de la señalización antiproliferativa. A pesar de que la fosforilación desempeña un papel importante en la regulación funcional de RB1, la regulación transcripcional del gen RB1 es mucho menos conocida [1]. fue identificado;: RB1-inducible espiral de la bobina 1 (que también se conoce como FIP200, la quinasa de adhesión de proteínas que interaccionan con la familia focal de 200 kDa del símbolo que se utiliza aquí, que es aprobado por la Organización Comité de Nomenclatura del Genoma Humano [HUGO] Gen RB1CC1) como un regulador RB1 vía que, en particular, realza
RB1
transcripción [2], [3]. Recientemente, hemos demostrado que RB1CC1 nuclear se une a una región 201bp rica en GC de aguas arriba (desde el inicio ATG) del promotor de RB1 y activa la expresión de [4] RB1. Un reordenamiento genético de
RB1CC1
También se ha sugerido que participan en la tumorogénesis del cáncer de mama [3], [5]. Curiosamente, se ha informado de que RB1CC1 se une y estabiliza p53 [6], lo que sugiere que RB1CC1 podría ser un importante mediador de la conexión de las vías de RB1 y p53. Nuestro presente estudio investiga el mecanismo de mejora de la vía RB1CC1 RB1. RB1CC1 forma un complejo con p53 y /o hSNF5, un factor remodelador de la cromatina, en el núcleo celular y activa la transcripción de
RB1
,
p16
y
p21
. Además, RB1CC1 nuclear se correlaciona significativamente RB1 y p16 expresión en tejido de cáncer de mama
in vivo
.
Resultados
RB1CC1 forma un complejo con hSNF5 y /o p53
inicialmente se intentó identificar las proteínas de unión a RB1CC1 en MCF-7 de cáncer de mama en un ensayo de inmunoprecipitación seguida de cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS /MS). Un factor de remodelación de la cromatina, hSNF5 (también conocido como BAF47 o INI1) fue co-inmunoprecipitado con RB1CC1 (Fig. 1A). El ensayo pull-down usando RB1CC1 deleción mutantes reveló que era necesaria la región C-terminal de RB1CC1 (aa 1364-1594) para la interacción con hSNF5 (Fig. 1B y C). La N-terminal de RB1CC1 también interactúa con p53 [6], por lo que considera que RB1CC1 puede formar un complejo con hSNF5 y /o p53 para inhibir el crecimiento del tumor. La formación de complejos entre RB1CC1, hSNF5 y p53 se evaluó mediante ensayos de inmunoprecipitación e inmunofluorescencia. RB1CC1, hSNF5 y p53 fueron co-inmunoprecipitó con dos tipos de anticuerpos que reconocen diferentes sitios de RB1CC1 (aa 25-271 y 549-817.); la composición de cada uno de los precipitados es diferente, probablemente debido a las fracciones preferibles a cada anticuerpo (Fig. 1D). RB1CC1-1 y anticuerpos -2 han tendido a unirse más preferiblemente a las fracciones nucleares y citoplasmáticas, respectivamente. hSNF5 y p53 en abundancia nuclear (que podrían ser más fosforilada y movilizado lentamente en PAGE) pueden ser preferentemente co-precipitaron con el complejo entre RB1CC1 nuclear y anticuerpos RB1CC1-1. Recíprocamente, el anticuerpo RB1CC1-2 podría unirse a dominantemente abundante RB1CC1 citoplasmática, así como hSNF5 y algunos de p53 en el citoplasma. RB1CC1, hSNF5 y p53 fueron co-localizada en los núcleos de células con la excepción de nucleolos (Fig 1E y F;.. Fig S1). Los datos indicaron que RB1CC1 forma un complejo con hSNF5 y /o p53 principalmente en los núcleos celulares.
(A) MCF-7 lisados celulares se inmunoprecipitaron (IP) con anticuerpo anti-RB1CC1 y se analizaron por SDS-PAGE seguido por tinción con plata. La molécula que co-inmunoprecipitó con RB1CC1 fue identificado como hSNF5 por cromatografía en tándem líquido espectrometría de masas (LC-MS /MS). (B) Flag-RB1CC1 y HA-hSNF5 fueron co-transfectadas en células HEK293. Los lisados se inmunoprecipitaron con anti-Flag o anti-HA anticuerpo, y se analizaron mediante inmunotransferencias como se indica. Las puntas de flecha indican las señales co-inmunoprecipitó. (C) HEK293 células fueron transfectadas con HA-hSNF5 tanto de tipo salvaje (completo) y Bandera-RB1CC1 variantes; de tipo salvaje (wt), DCCA, DCCB, dlz, LZC, DCC y FCC. Diagramas esquemáticos de RB1CC1wt y mutantes también se indican en el lado izquierdo. El rectángulo muestra el sitio de unión para hSNF5, y el rectángulo de trazos indica que para p53. Los lisados celulares se inmunoprecipitaron con anticuerpo anti-HA y a inmunotransferencia tal como se indica. (D) MCF-7 lisados se inmunoprecipitaron con dos tipos de anticuerpos anti-RB1CC1 y se analizaron mediante inmunotransferencias. (E) RB1CC1 (verde), hSNF5 (rojo), p53 (azul) y la imagen resultante de la concentración en las células HeLa. Cada proteína se immunofluorescently etiquetado por Alexa 488, 594 o 350 respectivamente. Barra de escala, 50 micras. (F) RB1CC1 (verde), DAPI y la imagen resultante de la concentración en las células HeLa. RB1CC1 es inmuno-etiquetado por Alexa 488, y DAPI se muestra con fluorescencia azul en el núcleo celular. Barra de escala, 50 micras.
RB1CC1 se une y activa los promotores de RB1, p16 y p21, p53 cooperar con y /o hSNF5
RB1CC1 [2], [4] , [6] y hSNF5 [7], [8], [9], [10] a mejorar la transcripción de las moléculas implicadas en la ruta RB1, por lo que hemos determinado si la RB1CC1, hSNF5 y se unen p53 para las regiones promotoras de
RB1
,
p16
y
p21
. Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) ensayos que utilizan anticuerpos contra RB1CC1, hSNF5 y p53 indican que los fragmentos del promotor de
RB1
,
p16
y
p21
, que se amplificó a partir de la cromatina de células HeLa , se precipitaron por cada anticuerpo (Fig. 2A), lo que sugiere que las moléculas son reclutados para las regiones promotoras de la vía RB1. La participación de estas tres moléculas en la expresión de
RB1
,
p16
y
p21
fueron validados mediante la introducción de SH-ARN
RB1CC1 gratis (sh -
RB1CC1
),
hSNF5 gratis (sh
hSNF5
) y
p53
(sh
p53
) en células HeLa . Los efectos de derribo en
RB1CC1
,
hSNF5
,
p53
,
p21
,
p16
y
RB1
expresión de mRNA fueron analizados por semi-cuantitativos RT-PCR. sh
RB1CC1 Opiniones y sh
hSNF5
disminución de los niveles de mRNA de
RB1
,
p16
y
p21
, mientras que SH-
p53
sólo disminuyó
p21
ARNm (Fig. 2B). En otras palabras, RB1CC1 y hSNF5 están obligados a mantener las transcripciones de
RB1
,
p16
y
p21
, mientras que p53 se exija expresamente para la transcripción de
p21
. RB1CC1 activa significativamente los promotores de
RB1
,
p16
y
p21 gratis (Fig. 2C), y la caída de los suprimió RB1CC1 (Fig. 2D). Estas mejoras promotor de RB1CC1 fueron comparados entre HeLa, las células TTC642 (hSNF5 nulo) y H1299 (p53-null), con el fin de validar el requisito de hSNF5 o p53 activa cuando RB1CC1
RB1
,
p16 Opiniones y
p21
. RB1CC1 fue incapaz de proporcionar una mejora significativa de
RB1 Opiniones y
p16
promotores en TTC642 células, y desempeñó un pequeño papel en
p16
y
p21
la transcripción en células H1299 (Fig. 2E). Teniendo en cuenta la vía iniciada por RB1 RB1CC1, RB1CC1 requiere hSNF5 para la mejora de
RB1 y p53
para la mejora de
p21
transcripciones, pero ambos hSNF5 y p53 son necesarias para la mejora de RB1CC1
p16
transcripción. En resumen, RB1CC1 requiere la interacción con tanto hSNF5 y p53 para proporcionar una fuerte activación de
RB1
,
p16
y
p21
promotores.
(A ) de inmunoprecipitación de cromatina (chIP) ensayo se realizó en células HeLa. La cromatina se inmunoprecipitó por anti-RB1CC1, anti-p53, o anti-hSNF5 anticuerpo. Cada precipitado de ADN se analizó mediante PCR cuantitativa y semi-cuantitativa usando los cebadores-promotor específico para
RB1
,
p16
y
p21
. Las intensidades de señal se definieron en base a las que se originan a partir de ADN de entrada (2 ng /l) de células HeLa, que se establecieron como 1.000. (B) Semi-RT-PCR cuantitativa se realizó en el número de ciclo individual para cada transcripción en células HeLa tratadas con shRNA para
RB1CC1
,
hSNF5
o
p53
. Sh
GL3
, sh
p21 Opiniones y sh
p16
se utilizaron como controles. Los paréntesis indican los números de ciclos de PCR. (C-D) En las células HeLa, la actividad luciferasa del promotor de
RB1
,
p16
y
p21
aumentó significativamente tras la transfección del plásmido que expresa RB1CC1 (RB1CC1wt) (
C
) y la marcada disminución en la precipitación de RB1CC1 usando sh
RB1CC1
-1 y -2 (
D
), en comparación con las células transfectadas con pcDNA o SH-ARN scramble, respectivamente, como controles. Los valores indican las medias ± error estándar de los experimentos por cuadruplicado. (prueba t de Student; asteriscos (*) indican diferencias estadísticamente significativas entre pcDNA y RB1CC1wt o entre scramble y sh
RB1CC1
*, p. & lt; 0,05; y **, p & lt; 0,01). La eficacia de la expresión sobre-o desmontables de RB1CC1 fue validado por transferencias de Western como se indica en los paneles superiores. (E) tras la introducción de RB1CC1wt, actividades de luciferasa de los promotores para la
RB1
,
p16
y
p21
se compararon entre HeLa, TTC642 (hSNF5 nulo) y H1299 células (p53 nula). Los asteriscos (**) indican diferencias estadísticamente significativas (prueba t de Student; p & lt; 0,01). Entre HeLa y TTC642 o entre HeLa y H1299
RB1CC1 activa la vía de RB1 y suprime el crecimiento tumoral
para evaluar si RB1CC1 mejora vías RB1 para suprimir el crecimiento de células cancerosas, las células HeLa fueron transducidas con lentivirally
RB1CC1
ADNc o shRNA. La expresión ectópica de RB1CC1 aumentó los niveles de proteína de p53, p21, p16 y RB1, y se inhibe el crecimiento de las células (Fig. 3A y B, panel izquierdo). Por el contrario, la caída de RB1CC1 endógeno por SH-
RB1CC1
disminuyó los niveles de p53, hSNF5, p21 y p16, y mejoró el crecimiento de las células (Fig. 3A y B, panel derecho). Los mismos experimentos en dos líneas celulares de cáncer de mama (MCF-7 y SK-BR3) dieron resultados similares (Fig. S2A-D). En
células RB1CC1
-transduced, se incrementó el número de /G1-células en fase G0 concomitantemente con la disminución del número de células en S y G2 /M fases. Introducción de SH
RB1CC1
disminuyó la población G0 /G1 y el aumento de las poblaciones de células en S y M G2 /. (Figura 3C;. Fig. S2E): perfil
Las células HeLa (A) fueron transducidas con lentivirally
RB1CC1
o sh
RB1CC1
. Los lisados se inmunotransfirieron como se indica. ensayos (B) de crecimiento en células HeLa transducidas como en
a
. Los datos se cuantificaron a partir de experimentos por triplicado (columna inferior). inmunotransferencias representativas, platos y significan los números de colonias ± se muestran los errores estándar. (C) Después de la modificación de la expresión lentiviral RB1CC1, las células NIH3T3 se analizaron mediante citometría de flujo.
RB1CC1 Opiniones y sh
¿Cuáles son RB1CC1 indicada por el rojo (izquierda) y azul (derecha), respectivamente. Los datos (media ± desviación estándar porcentajes) fueron confirmados en experimentos por triplicado, y una gráfica representativa de citometría de flujo se demuestra. pLenti6 y sh-GL3 se utilizaron como controles. Las flechas indican que los aumentos (flecha hacia arriba) y disminuciones (flecha hacia abajo) fueron estadísticamente significativas según la prueba t de Student; p. & lt; 0,05 (D) RB1CC1, hSNF5 y p53 forman el complejo transcripcional en el núcleo celular, y activar
RB1
,
p16
y
p21
en conjunto, los datos antes mencionados indicaron que RB1CC1 forma un complejo con hSNF5 y /o p53, y globalmente activan la transcripción de
RB1
,
p16
y
p21 gratis (Fig. 3D).
análisis expressional de las moléculas implicadas en la ruta RB1CC1-RB1 en los cánceres de mama
in vivo
Para evaluar la correlación entre la actividad proliferativa y la vía mencionada RB1CC1 de la activación de p53 y la participación de RB1 hSNF5 en el tejido tumoral
in vivo
, se evaluó el estado de expressional RB1CC1, RB1, p16, p21, Ki-67, p53 y hSNF5 en 59 casos de cáncer de mama. Cuatro casos de nulicigotos RB1 indican un alto índice de proliferación Ki-67 (media ± error estándar = 69,7 ± 6,6%). La inmunorreactividad de p53-p21 se refiere a la expresión se divide en dos categorías, "normal" (p53nor) para la tinción débil y "anormal" (p53ab) para la tinción fuerte, que altamente indicó que la proteína p53 mutante se acumula. Hubo 41 y 14 casos de p53nor y p53ab, respectivamente, en esta serie. hSNF5 fue altamente mantiene en los cánceres de mama, con independencia de RB1CC1 o el estado de p53 (datos no mostrados). Los resultados de inmunohistoquímica para RB1CC1 se calificaron como cuantitativamente I-III. Grado III, expresando RB1CC1 abundantemente en los núcleos celulares, se registró como RB1CC1 (+), mientras que los grados I-II sin RB1CC1 nuclear se registraron como (-) (Fig. 4A). Como se informó anteriormente [4], la expresión de RB1 fue bastante bien correlacionada con la expresión RB1CC1 en los casos registrados como RB1CC1 (+) y fue mayor que en el RB1CC1 (-) de los casos (Fig. 4B, izquierda). la expresión de p16 también se correlacionó positivamente con la expresión RB1CC1 nuclear (Fig. 4B, 2
nd izquierdo). Etiquetado de índices de p21 y Ki-67 en los casos p53nor - pero no en los casos p53ab - estaban bien correlacionados con el estado de la expresión de RB1CC1 (Fig. 4B, 3
rd izquierda y derecha). En conjunto, el estado de la expresión de p53 y RB1CC1 se asociaron con un aumento de expresiones de RB1, p16 y p21, que a su vez influyeron en el índice Ki-67 de la actividad de proliferación de los cánceres de mama clínicos. Por lo tanto, el estado de inmunohistoquímica de RB1 y p53, así como la de RB1CC1 deberían ser buenos predictores de la actividad proliferativa; por lo tanto, la vía RB1CC1-RB1 demostrado en nuestros experimentos podría desempeñar un papel importante en la progresión del cáncer de mama clínica
(A) Los grados de RB1CC1 inmunohistoquímicos fueron clasificados como I-III. I, tinción negativa en tanto citoplasma y núcleos; II, tinción positiva sólo en el citoplasma y negativo en los núcleos; III, tinción positiva en los núcleos y /o citoplasma. Grados III, que expresan abundantemente en RB1CC1 núcleos de las células, se registraron como RB1CC1 (+), mientras que los grados I-II sin RB1CC1 nuclear se registraron como RB1CC1 (-). La barra de escala muestra 50 micras. (B) Correlación entre RB1CC1 y RB1, p16, p21 o Ki-67 en p53normal (gráficos superiores) y anormales (gráficos inferiores) de los casos. RB1CC1 (-) o (+) estado se indica en la línea horizontal, y cada índice de etiquetado se indica en una línea vertical en los gráficos. Un estado de p53 anormal se definió como un caso de cáncer de mama, cuando más de 50% de las células tumorales eran fuertemente positivas para p53, mientras que menos del 10% de las células fueron positivas para p21. Tal caso altamente indicó que la proteína p53 mutante se acumula, y que las funciones intactas de p53 (como la activación transcripcional de
p21
) fueron pérdida. Estudiante de
t-test
se utilizó para evaluar las correlaciones (*, P & lt; 0,05; y **, p & lt; 0,01) guía empresas
Discusión
RB1CC1 es. una novela regulador de RB1 que desfosforila RB1 [2], [6] y aumenta su expresión [2], [4]; Además, un reordenamiento genético de
RB1CC1
podría estar implicado en la tumorigénesis del cáncer de mama [3], [5]. Más recientemente, se informó de que RB1CC1 nuclear activa directamente el
RB1
promotor a través de una región rica en GC aguas arriba 201bp (-201 /T-GCbox) [4]. Para aclarar más precisamente el mecanismo molecular de la acción RB1CC1, un ensayo de inmunoprecipitación seguida por LC-MS /MS se intentó, y un factor de remodelación de la cromatina, se identificó hSNF5. RB1CC1 también interactúa con p53, por lo RB1CC1 se cree que forman un complejo con hSNF5 y /o p53. Se cree que induce RB1CC1
RB1
[2], [4], y que mejora la hSNF5
p16 gratis (también conocido como INK4a o CDKN2A) y /o
p21
(también conocido como CIP1, WAF1 o CDKN1A) [7], [8], [9], [10]. De hecho, los ensayos de inmunoprecipitación e inmunofluorescencia han indicado que un complejo entre RB1CC1, hSNF5 y formas de p53 en el núcleo celular y chip, RT-PCR cuantitativa y los ensayos de luciferasa para
RB1
,
p16
y
p21
han sugerido que las mejoras de la transcripción coordinada de estas moléculas son afectados por el complejo que incluye RB1CC1, hSNF5 y p53. Sin embargo, RB1CC1, hSNF5 y p53 no son igualmente importantes para la estimulación de cada uno de los promotores de
RB1
,
p16
o
p21
, mientras que tres moléculas son reclutados para cada promotor. Por ejemplo, silenciando
p53
en células HeLa no tuvo ningún efecto sobre la transcripción de
RB1
, y RB1CC1 sobre-expresión puede activar el
RB1
promotor en H1299 (p53- células nulas). Estos significa que p53 no se requiere esencialmente a
RB1
la transcripción, y que RB1CC1 y hSNF5 pueden cooperar para activar
RB1
transcripción. Por lo tanto, las tres moléculas no son siempre necesarios para la activación de cada uno de los promotores, mientras que los tres son necesarios para las transcripciones coordinados de
RB1
,
p16
y
p21
. También hemos establecido anteriormente que RB1CC1 nuclear se une y activa el
RB1
promotor [4]. Curiosamente, un punto de mutación en el -201 /T-GCbox de la
fue identificado RB1
promotor en una familia de retinoblastoma hereditario [11]. Cabe señalar que la -201 /T-GCbox de
RB1
y el complejo transcripcional vinculante que incluya RB1CC1, hSNF5 y el juego p53 papel importante en la carcinogénesis humana.
En el presente estudio , RB1CC1, en colaboración con hSNF5 y p53, activa la vía de RB1 y suprime el crecimiento de células tumorales. Con el fin de activar la vía RB1 efectivamente, RB1CC1 debe expresarse en los núcleos celulares y debe formar un complejo con hSNF5 y /o p53, como se sugiere en los datos inmunocitoquímicos e inmunohistoquímicos de este estudio. PIASy (una proteína de inhibidor de la proteína STAT activado y) interactúa con el extremo C-terminal (aa 1350-1594) de RB1CC1 y recluta un complejo de interacción entre PIASy y RB1CC1 de citoplasma en los núcleos [12]. Además, PIASy regula negativamente la diana de mamífero de la rapamicina actividad (mTOR) estimulada por RB1CC1 citoplásmica, y positivamente activa la vía de señalización de p53-p21 junto con RB1CC1 nuclear [12]. Estos datos parecen ser compatible con nuestros datos que se presentan en la sublocalización del complejo compuesto de RB1CC1, hSNF5 y p53. El complejo molecular nuclear, incluyendo RB1CC1, hSNF5, p53 y PIASy adicional, se puede formar un componente de la transcripción grande como para activar la vía RB1 coordinadamente y reprimir a la tumorigénesis en tejido de mama humano.
expresión nuclear de RB1CC1 podría ser importante para la supresión de tumores. Como se informó anteriormente, RB1CC1 se encuentra no sólo en el núcleo, sino también en el citoplasma [4], [6], [13], [14]. RB1CC1 citoplasmática se ha sugerido que es el equivalente de la levadura Atg17, y varios estudios han indicado que las funciones RB1CC1 como una molécula esencial en la regulación de la autofagia [13], [14], [15]. La autofagia se ha implicado en la tumorigénesis, pero su papel preciso es ambiguo. Es concebible que la autofagia tiene diferentes funciones en las diferentes etapas, o contextos, de la tumorigénesis. Young, et al. [16] han informado de que la autofagia media la senescencia mitótico, una ventana hacia el desarrollo tumoral precoz. Sugerimos que la transición citoplasmática poseedores de RB1CC1 juega un papel clave en la asociación de la autofagia-senescencia. Nuestros datos
in vitro
y
in vivo sugieren que
RB1CC1 desempeña diferentes roles de acuerdo a su localización subcelular. Nuclear RB1CC1 forma un complejo con hSNF5, p53 y cualquier otro componente que contribuye a la transcripción de la vía de RB1, lo que indica una posible vinculación a la senescencia mitótico. Sin embargo, RB1CC1 citoplásmica parece jugar ningún papel como un supresor tumoral activación de la vía RB1.
Nuclear RB1CC1 expresión correlacionó significativamente con los de RB1 y p16 en el tejido de cáncer de mama
in vivo
, independientemente de estado de p53. Ki-67 índice de proliferación y la expresión de p21 se vieron afectados por tanto RB1CC1 y p53, y el índice de Ki-67 también dependía de estado RB1. Las expresiones de RB1, p16 y p21 afectan el índice Ki-67 de la actividad proliferativa, por lo que el estado de inmunohistoquímica de RB1 y p53, así como la de RB1CC1 puede predecir la actividad proliferativa del tumor. Así, la presente datos sugiere que la progresión de los cánceres de mama estaba bajo la fuerte influencia de RB1CC1, así como el estado RB1 y p53. Esperamos que la evaluación inmunohistoquímica combinado de RB1, RB1CC1 y p53 proporcionará información sobre sus aplicaciones clínicas, como la posibilidad de utilizar como biomarcadores de pronóstico.
En resumen, hemos informado aquí que RB1CC1, que conecta el RB1 y p53 vías como un posible mediador, forma un complejo con hSNF5 y /o p53 que mejora la vía RB1 a nivel mundial. evaluación inmunohistoquímica de RB1 y p53 en combinación con RB1CC1 puede ser un biomarcador útil en ensayos clínicos de rutina convenientes, y proporcionar una predicción del comportamiento biológico de neoplasias de la mama y /o los tumores de otros órganos.
Materiales y Métodos
cultivo de células
TTC642 fue proporcionado amablemente por los Drs. Shigeru Ohta, Hiroyuki Shimada y Timothy J. Triche (Hospital Infantil de Los Ángeles, Los Ángeles, CA). células HeLa, HEK293, MCF-7, SK-BR3 y H1299 se adquirieron de la American Type Culture Collection (MD), y se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) o RPMI 1640 que contenía suero bovino fetal al 10%. Todos los medios de cultivo de células se suplementaron con penicilina (50 unidades /ml) y estreptomicina (50 mg /ml).
Los anticuerpos y reactivos
antisueros de conejo contra RB1CC1 (aa. 25 a 271, 549 -817 ya que cada epítopo) se generaron como se informó anteriormente [4], [17], y la IgG purificada fueron usados en los experimentos. Anti-p53 (FL-393) y anti-p21 (F-5) se obtuvieron de Santa Cruz Biotechnology (CA). Anti-HA (3F10) era de Roche (Alemania). Anti-Flag (M2) y anti-tubulina α (1A DM) se adquirieron de Sigma (MO). Los otros anticuerpos eran de BD Biosciences (CA).
La inmunoprecipitación de complejos de proteínas seguido por espectrometría de líquido tándem chromatography- de masas (LC-MS /MS)
Las células de cáncer de mama MCF-7 fueron se lisaron en tampón de lisis EBC que contiene 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), NaCl 120 mM, EDTA 1 mM, 0,5% Nonidet P-40 (NP-40), 0,25% de desoxicolato de sodio, Na 0,2 mM
3Vo
4, 100 mM de NaF y 1% de cóctel inhibidor de la proteasa (Wako Chemicals, Japón), y luego se centrifuga durante 20 min a 20.000 × g a 4 ° C. El sobrenadante 5 ml (~10mg /ml) se incubó con 100 g de anti-RB1CC1 purificó IgG anticuerpo primario a 4 ° C durante la noche. Los inmunocomplejos se unen a proteínas G-agarosa (Pierce, IL) durante 2 h adicionales a 4 ° C y se lavaron cinco veces con NETN (20 mM Tris-HCl (pH 8,0), NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, 0,5% NP 40). Las proteínas unidas a la proteína G-Sepharose se eluyeron mediante la adición de tampón de muestra Laemmli SDS que contiene 62,5 mM Tris-HCl (pH 6,8), 10% de glicerol, 5% de 2-mercaptoetanol, 2% SDS, y 0,01% de azul de bromofenol al gel y hervirla durante 3 minutos. Después de centrifugación a 10.000 xg durante 2 min, el sobrenadante se sometió a SDS poliacrilamida-electroforesis en gel (SDS-PAGE), y las proteínas separadas se visualizaron por tinción con plata. La banda específica fuertemente teñidas se en-gel digerido con tripsina y los péptidos recuperados se analizaron usando un espectrómetro de masas de electrospray-trampa de iones (LCQ, Finnigan MAT, CA) acoplado en línea con HPLC capilar (magia 2002, Michrom BioResorces, CA) a adquirir espectros de espectrometría de masas /espectrometría de masas (MS /MS). Se utilizaron los datos derivados de la espectros MS /MS para buscar una base de datos de proteínas compilado, que estaba compuesto por NR base de datos y un calendario de seis lectura traducida EST base de datos, para identificar la proteína utilizando el programa de VAGABUNDEO a disposición del público (http: //prowl.rockefeller.edu).
el ADN del plásmido y el gen de la transferencia
externo y los mutantes de deleción interna de
RB1CC1 gratis (GenBank no. NM_014781) se generaron en el pcDNA3.1 vector plásmido (Invitrogen), por una combinación de manipulaciones basadas en PCR con los cebadores externos apropiados en las posiciones descritas a continuación y la digestión con enzimas de restricción. Los nucleótidos de todos los constructos se confirmaron por secuenciación de ADN. Los
RB1CC1
mutantes DCCA, DCCB, dlz, LZC, DCC y FCC eliminan los aminoácidos 863-1083, 1078-1363, 1364-1594, 1 a 1356, 824 a 1594 y de 1 a 863, respectivamente ( la Fig. 1C, panel izquierdo). La transfección se realizó usando FuGENE HD (Roche) según las recomendaciones del proveedor. Los vectores de plásmidos de RNAi para
RB1CC1
se prepararon como se describe anteriormente [17]. En resumen, dos tipos de vectores lentiviral sh-ARN (sh
RB1CC1
-1 y -2) que corresponden a diferentes sitios de destino (nt. 2070-2090 y nt. 4611 hasta 4631, respectivamente) en
RB1CC1
ARNm (GenBank no. NM_014781) se sintetizaron in vitro mediante la inserción de oligonucleótidos artificiales en el pSIH1-H1-Puro sh-RNA vector (Sistema Biosciences, CA). Los vectores para sh-ARN de
hSNF5
y
p53
fueron preparados por OpenBiosystems (AL). Para los controles no silenciar, sh
GL3 Opiniones y vectores revueltos fueron adquiridos de Sistema de Biociencias y OpenBiosystems, respectivamente. Además, humano
RB1CC1
cDNA se subclonó en un vector pLenti6 (Invitrogen). Lenti-virus transferir sh-RNA o cDNA fue preparada con cada mezcla de embalaje, según las instrucciones de cada fabricante. Clonados y se seleccionaron las células expandidas en presencia de puromicina o blasticidina, respectivamente, y se utilizan en los experimentos.
desplegables ensayo
Bandera de etiquetado-tipo salvaje (wt)
RB1CC1
o sus mutantes (DCCA, DCCB, dlz, LZC, DCC y FCC) se transfectaron en células HEK293 combinados con hSNF5 marcada con HA (lleno). Las células se lisaron en tampón TNE (20 mM Tris-HCl, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, 1% NP-40 y 1 mM Na
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4 que contiene una mezcla de inhibidores de proteasa). Los lisados se centrifugaron, y los sobrenadantes se incubaron con anti-Flag o anti-HA perlas inmovilizadas durante 2 horas a 4 ° C. Las perlas se lavaron cinco veces con tampón TNE y se hierven en presencia de tampón de muestra Laemmli SDS. Los complejos de proteínas se resolvieron mediante SDS-PAGE, se transfirieron a filtros de membrana de PVDF y se sometieron a análisis de inmunotransferencia con los anticuerpos indicados.
inmunoprecipitación para detectar la proteína complejo
se enjuagaron MCF-7 células en monocapa con solución salina tamponada con fosfato enfriada con hielo (PBS) y raspado en tampón de lisis enfriado en hielo NP-40 (20 mmol /L Tris (pH 8,0), 137 mmol /L de NaCl, 1% NP-40, 10% de glicerol) suplementado con 1% de cóctel inhibidor de la proteasa (Wako Chemicals) y 3 mmol /L de Na
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4. Los lisados se incubaron en hielo durante 20 minutos, aprobados por centrifugación, y la concentración de proteína se determinó por el ensayo de ácido bicinconínico (Pierce). Las soluciones que contienen 400 a 1000 g de proteína se precleared brevemente con perlas de proteína G-agarosa (Pierce) y luego se usa para la reacción de inmunoprecipitación con 2 tipos de IgG policlonales de conejo anti-RB1CC1 o IgG normal de conejo de control a 4 ° C durante la noche, seguido por incubación con perlas de proteína-G durante 2 horas para recoger los complejos inmunes. Finalmente, las perlas se lavaron con tampón NP-40 cinco veces, se resuspendieron en tampón de muestra SDS, hervido, se resolvieron en SDS-PAGE, y se analizaron mediante inmunotransferencias como se describe a continuación.
El análisis por inmunotransferencia
Las células se lisaron en general, para la transferencia Western como se describe por Sarbassov, et al [18]. Después de la limpieza de materiales lisados por centrifugación a 15.000 xg durante 1 min, los sobrenadantes se hirvieron en tampón de muestra SDS. Las proteínas se resolvieron mediante SDS-PAGE se transfirieron a filtros de difluoruro de polivinilideno (PVDF). Después del bloqueo de los filtros con TBS-T (10 mM Tris-HCl (pH 7,6), cloruro de sodio 150 mM, 0,1% de Tween 20) que contiene 5% de albúmina de suero bovino (BSA), los filtros se incubaron durante la noche con los anticuerpos primarios indicados en TBS-T que contiene 2% de BSA a 4 ° C. Los filtros se lavaron en TBS-T y se incubaron durante 1 h en peroxidasa de rábano conjugada anti-ratón, anti-conejo o anti-IgG de rata (GE Healthcare, Reino Unido) diluido 1:20,000 en TBS-T que contiene 2% de BSA . Después de varios lavados con TBS-T, la inmunorreactividad se detectó usando el sistema ECL (GE Healthcare) de acuerdo con los procedimientos recomendados por el fabricante.
inmunofluorescencia ensayo
células MCF-7 y HeLa se cultivaron en portaobjetos de cámara LabTek ™ (BD Biosciences) a 70% de confluencia, fijadas con 1% de formaldehído tamponado y 70% de etanol, y luego se permeabilizaron con 0,1% Triton X-100. El conejo primario anti-IgG RB1CC1, ratón anti-hSNF5 IgG2a (BAF48), y IgG de conejo anti-p53 (FL393) se conjuga con Alexa 488, 594 y 350 por el kit de marcaje de ZenonTM (Molecular Probes).