Extracto
El cáncer cervical es uno de los cánceres más comunes en las mujeres en todo el mundo, siendo el grupo de alto riesgo del VPH infectado, el factor etiológico más importantes. La proteína inhibidora de quinasa raf (RKIP) se ha asociado con la progresión tumoral y la metástasis en varios neoplasmas humanos, sin embargo, su papel en el cáncer cervical está claro. En el presente estudio, 259 tejidos del cuello uterino, incluyendo cervicitis, lesiones intraepiteliales cervicales y carcinomas, se analizaron para la expresión RKIP por inmunohistoquímica. Hemos encontrado que la expresión RKIP se redujo significativamente durante la progresión maligna, siendo altamente expresado en los tejidos no neoplásicos (54% de las muestras; 73/135), y hemos expresado en niveles bajos en los carcinomas invasivos del cuello uterino (~ 15% (19/124 ). Después de
in vitro
regulación a la baja de RKIP, se observó una viabilidad y la ventaja proliferativa de las células RKIP inhibida en el tiempo, que se asoció con una distribución del ciclo celular alterado y mayor número de colonias en un ensayo de formación de colonias. un
in vitro
herida ensayo demostró que la curación RKIP derogación se asocia con una mayor capacidad migratoria. RKIP regulación a la baja también se asoció con un aumento de la vascularización de los tumores
in vivo
utilizando un ensayo de CAM. además, RKIP la inhibición inducida por las células de cáncer de cuello uterino resistencia apoptótica al tratamiento con cisplatino. en conclusión, hemos descrito que la proteína RKIP se agota de manera significativa durante la progresión maligna de los tumores cervicales. a pesar de la falta de asociación con la evolución clínica del paciente, se demuestra,
in vitro
y
in vivo
, que la pérdida de expresión RKIP puede ser uno de los factores que están detrás de la agresividad, la progresión maligna y la resistencia a la quimioterapia del cáncer de cuello uterino
Visto:. Martinho O, F Pinto , Granja S, Miranda-V Gonçalves, Moreira MAR, Ribeiro LFJ, et al. (2013) RKIP inhibición en el cáncer cervical se asocia con mayor comportamiento agresivo del tumor y la resistencia al tratamiento con cisplatino. PLoS ONE 8 (3): e59104. doi: 10.1371 /journal.pone.0059104
Editor: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesú, Italia |
Recibido: 23 Noviembre 2012; Aceptado 11 de febrero de 2013; Publicado: 19 Marzo 2013
Derechos de Autor © 2013 Martinho et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue parcialmente apoyado por el portugués Fundação para a Ciência e Tecnologia (subvención PTDC /SAU-TOX /114549/2009). Olga Martinho y Sara Granja eran los destinatarios de las becas de doctorado (SFRH /BD /36463/2007 y SFRH /BD /51062/2010, respectivamente), y Filipe Pinto y Vera Miranda-Gonçalves eran los destinatarios de las becas de investigación (Uminho /BI /016 /2011 y SFRH /BI /33503/2008, respectivamente), ambos de FCT, Portugal. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. No se recibió financiación externa adicional para este estudio
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El cáncer cervical es el tercer tipo de cáncer más comúnmente diagnosticado. y la cuarta causa de muerte por cáncer en las mujeres en todo el mundo, representando el 9% (529,800) de los nuevos casos de cáncer en total y un 8% (275.100) del total de muertes por cáncer entre las mujeres en 2008 [1]. La infección persistente por tipos de alto riesgo del virus del papiloma humano (VPH) es un
sine qua non-
condiciones para el desarrollo de cáncer de cuello uterino. Los VPH infectan las células epiteliales y causan una variedad de lesiones que van desde verrugas comunes a la neoplasia cervical y el cáncer [2] - [4]. Los tumores del cuello uterino se dividen en tres diferentes subtipos histológicos: uterinos carcinomas de células escamosas (SCC) es el más frecuente, seguido de adenocarcinoma (AC) y el carcinoma adenoescamosa (ASC), que es un subtipo raro [5]. la infección por VPH por sí sola no es suficiente para desencadenar el cáncer de cuello uterino y el VPH oncogénesis mediada también requiere la acumulación de cambios genéticos adicionales que se producen con el tiempo después de la infección inicial [6]. Puede tomar varios años para un
In situ
neoplasia de progresar a un carcinoma invasivo. El mecanismo de la evolución clonal, que implica la selección de células con potencial invasivo o metastásico, también permanece sin resolver
proteína inhibidora de quinasa
Raf (RKIP; también conocido como PEBP1, por protein1 unión fosfatidiletanolamina-)., Como se indica por el nombre, se identificó primero como el inhibidor endógeno de la vía RAF /MEK /ERK, la inhibición de la activación de Raf-1 [7] - [9]. En realidad, RKIP ha sido implicado en varias vías de señalización intracelular que controlan el crecimiento celular [10], [11], la motilidad [12], [13], transición epitelio mesénquima (EMT) [14] y la diferenciación [15]. RKIP se expresa ampliamente en tejidos humanos normales, destacando su papel en varios procesos fisiológicos [16], pero se considera que es un supresor de la metástasis en el cáncer [17], siendo su pérdida o expresión reducida asociada con la malignidad y el pronóstico en muchos tipos de metastásico y cánceres agresivos [10], [11], [18] - [34]
un estudio anterior, realizado en una pequeña fracción de los pacientes, que se encuentra por el análisis de microarrays expresión que RKIP es uno de los genes que. se expresa diferencialmente entre las muestras de tumores de pacientes con cáncer de cuello uterino con o sin metástasis de los ganglios linfáticos [35]. Más recientemente, se encontró en una gran serie de pacientes que la proteína RKIP está regulado por disminución significativa en el cáncer de cuello uterino y la metástasis de los ganglios linfáticos [36]. Además, otro estudio con células de cáncer cervical HeLa mostraron que RKIP, a través de la regulación de la vía de ERK, tiene un papel importante en la regulación del punto de control mitótico [37]. Por lo tanto, los resultados anteriores, nos llevó a dilucidar la función biológica de RKIP en la progresión maligna del cáncer cervical y respuesta a la quimioterapia. Por lo tanto, se evaluó primero los niveles de expresión de proteína RKIP en ambas muestras cervicales no malignas y tumorales, y se evaluó su función en la evolución clínica de los pacientes con cáncer de cuello uterino. En segundo lugar, se evaluó
in vitro
y
in vivo
la función biológica de la regulación a la baja en RKIP malignidad del cáncer de cuello de útero y de respuesta a la quimioterapia.
Materiales y Métodos
las muestras de tejido
En el presente trabajo, se analizaron 259 tejidos del cuello uterino, que incluía 45 cervicitis, 47 lesiones intraepiteliales escamosas de bajo grado (LSIL), 43 lesiones intraepiteliales escamosas de alto grado (HSIL), 70 carcinomas de células escamosas (SCC), 41 adenocarcinomas (AC) y 13 carcinomas adenoescamosos (ASC) (Tabla 1). Las muestras de parafina que contienen las lesiones no malignas de cuello uterino fueron recuperados de los archivos de la División de Patología de Adolfo Lutz Instituto de Sao Paulo, Brasil, y las muestras de tumores de cuello uterino invasivo fueron recuperados de Araújo Jorge el Hospital y la Escuela de Medicina de la Universidad Federal de Goiás (Goiânia, Goiás Estado, Brasil). Todos los diagnósticos histopatológicos fueron revisados por los autores y se clasifican de acuerdo con la clasificación de la OMS. Todos los pacientes con cáncer de cuello de útero eran mujeres de origen brasileño, con una edad media de 49 años (rango 23-74 años). fue Seguimiento de los datos disponibles para 72 pacientes, y se recogen a través de entrevista directa con los pacientes o sus familiares, y mediante la revisión de los archivos del paciente en el hospital. El tiempo medio de seguimiento (supervivencia global) fue de 35,5 ± 42,0 meses (rango, 2-144 meses).
Todas las muestras incluidas en el presente estudio fueron disociados y no identificados de sus donantes. Debido a la naturaleza retrospectiva del estudio, no se obtuvo el consentimiento informado por escrito de los pacientes. Los locales comités de examen ético de las instituciones implicadas (Comité de Ética de la Investigación Humana de Adolfo Lutz Instituto de Sao Paulo y de Araújo Jorge del Hospital de la Facultad de Medicina de la Universidad Federal de Goiás, Brasil) aprobó el trabajo y no aplicarse la necesidad de consentimiento informado por escrito .
líneas celulares
en el presente estudio se utilizaron tres líneas celulares de carcinoma de cuello uterino: la línea celular HeLa, amablemente proporcionados por el Dr.
a Logarinho Elsa (IBMC, Portugal) [38] , las líneas celulares SiHa y C-33A que fueron amablemente proporcionados por el Dr.
a Villa Luisa (inc-VPH, Brasil) [39]. Todas las líneas celulares se cultivaron y se mantuvieron a 37 ° C y 5% de CO
2 en la Dulbecco Modificado de Eagle Medium (DMEM 1 ×, alta glucosa; Gibco, Invitrogen) suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS; Gibco, Invitrogen ) y 1% de penicilina /estreptomicina solución (Gibco, Invitrogen) (DMEM-10).
Drugs
El cisplatino (cis-Diammineplatinum (II) dicloruro) se obtuvo de Sigma-Aldrich y se diluye en 0,9% de NaCl para una solución madre de 10 mM. El fármaco se preparó posteriormente como diluciones intermediados para obtener una cantidad igual de vehículo del fármaco (1% de concentración final) en cada una de las condiciones estudiadas. En todas las condiciones experimentales se diluyeron las drogas en medio de cultivo FBS al 0,5% (DMEM-0.5).
La inmunohistoquímica y análisis de inmunocitoquímica RKIP
en el estudio histológico con 4 secciones de tejido micras de espesor se sometieron a el análisis inmunohistoquímico de acuerdo con el sistema complejo de estreptavidina-peroxidasa biotina (UltraVision de gran volumen de sistema de detección de anti-polivalente, HRP; LabVision Corporation), utilizando el anticuerpo primario elevado contra RKIP (Millipore, referencia 07-137) diluido 1:600, 1H incubación a RT, como se describe anteriormente [18], [25], [40], [41]
Las secciones se anotó doble ciego para la expresión citoplasmática siguiendo un criterio semicuantitativo:. (
-
), 0% de las células inmunorreactivas; (+),
& lt; página 5% de las células inmunorreactivas; (++), 5 a 50% de las células inmunorreactivas; y (+++),
& gt;
50% de las células inmunorreactivas. Las muestras con puntuaciones (
-
) y (+) fueron considerados negativos, y aquellos con puntuaciones (++) y (+++) se consideraron positivos
Para RKIP inmuno análisis de cuello uterino. líneas celulares de carcinoma, las células se sembraron en cubreobjetos de vidrio colocados en placas de 12 pocillos, y se dejaron adherir durante la noche. El procedimiento inmunocitoquímica se realizó como se describió anteriormente [41].
Generación de shRKIP que expresan establemente líneas celulares
Para la generación de líneas celulares que expresan establemente shRKIP, se utilizó el vector PQY15, que contiene un 19 pb shRNA para RKIP, tal como se describe anteriormente [37], [41], [42]. La transfección se realizó utilizando el reactivo de FUGENE HD (Roche) según lo recomendado por el fabricante, con 2 g de plásmido en una proporción de 6:02 (Reactivo: plásmido). Las células (2 × 10
5) se sembraron en una placa de 12 pocillos hasta 80% de confluencia y se transfectaron en medio DMEM, sin FBS o antibióticos Además, durante 24 horas [41]. Después de eso, se seleccionaron transfectantes estables con 0,5 mg /ml (HeLa) o 2 mg /ml (C-33A y SiHa) de puromicina en DMEM-10. El vector vacío también se transfectó como control.
Análisis Western Blot
Las células fueron placa en una placa de 6 pocillos a una densidad de 8 × 10
5 células por pocillo y se dejó a que se adhieran al menos 24 horas. Las células se mueren de inanición de suero durante 6 horas antes del aislamiento de proteínas. Cuando sea necesario, las células también se estimularon con 10 ng /ml de EGF por 10 minutos antes del final de las 6 horas de inanición. Además, para los experimentos de cisplatino las células se expusieron a diversas concentraciones de cisplatino por un período adicional de 24 horas en DMEM-0,5. Las células se rasparon en PBS frío y se lisaron en tampón que contiene 50 mM Tris pH 7,6 a 8, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, Na3VO4 1 mM, NaF 10 mM, mM NaPyrophosphate 10, 1% NP-40 y 1/7 de Los inhibidores de la proteasa cocktail (Roche). transferencia de Western se realizó utilizando gel de SDS-PAGE estándar 12%, la carga de 20 g de proteína por carril, con detección por quimioluminiscencia mejorada (SuperSignal West Femto máxima sensibilidad Substrato, Pierce). expresión RKIP se midió usando un anticuerpo específico contra RKIP (dilución 1:2000, Upstate Biotechnology). Activado ERK y EGFR se evaluaron utilizando el anticuerpo fosfo-p44 /42 MAPK (Thr202 /Tyr204) y fosfo-EGFR (Y1068) (dilución 1:1000, Señalización Celular Tecnología). La forma total de ERK y EGFR también se evaluaron con los anticuerpos p44 /42 MAPK (ERK1 /2) (137F5 clon, dilución 1:1000, Señalización Celular Tecnología) y EGFR (dilución 1:500, 31G7 clon, Zymed Laboratories). Para la evaluación de la apoptosis que se utilizaron anticuerpos contra PARP escindida (clonar Asp214, la dilución 1:1000, Señalización Celular Tecnología), escindido de la caspasa-9 (clonar Asp330, la dilución 1:1000, Señalización Celular Tecnología) y PARP (dilución 1:1000, Cell Tecnología de señalización). Para el control de carga se utilizó β-tubulina (AA2 clon, dilución 1:5000, Upstate Millipore). Todos los anticuerpos primarios se incubaron durante una hora a RT.
Blots detección se hizo por quimioluminiscencia (ECL Western Blotting de detección de reactivos, RPN2109, GE Healthcare) en ImageQuant ™ LAS 4000 mini (GE Healthcare) o usando Hyperfilm X100 ECL (Amersham, GE Healthcare).
viabilidad celular y Ensayos de proliferación
Las células se sembraron en placas de 96 pocillos por triplicado a una densidad de 3 × 10
3 células por pocillo y se dejaron adherir durante la noche en DMEM-10. Después de 6 horas de privación de suero se cuantificaron las células viables o proliferativos usando el Titer96 acuosa ensayo de células de proliferación celular (Promega) o con la proliferación celular ELISA, BrdU (colorimétrico, Roche Applied Science) y se utilizan para el valor de tiempo 0. Luego, las células se incubaron en medio DMEM sin suero durante 24, 48 y 72 horas y la viabilidad y la proliferación celular se evaluó de nuevo por Cell Titer96 acuosa ensayo de proliferación celular y la proliferación celular ELISA, BrdU (colorimétrico), respectivamente. Los resultados se calibraron al valor inicial (tiempo 0 h, considerado como el 100% de la viabilidad /proliferación) y se expresaron como la media ± SD. El ensayo se realizó por triplicado al menos tres veces.
Para determinar la concentración a la que 50% del crecimiento celular es inhibida por el tratamiento con cisplatino (IC
50 concentración), las células se sembraron en 96 placas de pocillos a una densidad de 3 x 10
3-5 × 10
3 células por pocillo y se dejaron adherir durante la noche en DMEM-10. Posteriormente, las células fueron tratadas con concentraciones crecientes del fármaco diluido en DMEM-0,5. Después de 48 horas, la viabilidad celular se cuantificó usando la célula Titer96 acuosa ensayo de proliferación celular (MTS) (Promega). Los resultados se expresaron como media ± SD células viables con relación al vehículo de fármaco solo (considerado como 100% de viabilidad). El IC
50 concentración se calculó por análisis de regresión no lineal usando el software GraphPad Prism.
Curación de Heridas migración Ensayo
Se sembraron las células en placas de 6 pocillos y se cultivaron a al menos 95% de confluencia. Las células en monocapa se lavaron con PBS y se rasparon con una punta de pipeta 200 l de plástico y después se incubaron con medio DMEM fresco sin suero. Las áreas "heridos" se fotografiaron por microscopía de contraste de fase en puntos de tiempo de 12, 24 o 48 horas. La distancia de migración relativa se calcula mediante la siguiente fórmula: porcentaje de cierre de la herida (%) = 100 (A-B) /A, donde A es la anchura de las heridas de células antes de la incubación, y B es la anchura de las heridas de células después de la incubación [ ,,,0],41]. Los resultados se expresan como la media ± desviación estándar. El ensayo se realizó por triplicado al menos tres veces.
Cell Análisis de Ciclo de
Las células se sembraron en una placa de 6 pocillos a una densidad de 2 × 10
5 células por pocillo y se dejaron adherir durante la noche. Después de 6 horas de privación de suero se incubaron las células con medio DMEM fresco sin suero durante 24 horas. solución de células se tripsinizan y se fijaron en etanol al 70% por lo menos 30 minutos y luego se tiñeron durante 1 hora a 50 ° C con un yoduro de propidio (PI) (20 mg /ml de PI y 250 g /ml de ARNasa en una solución de 0,1 % de Triton X-100 en PBS). Análisis del ciclo celular de las células PI manchado se realizó por citometría de flujo (LSRII, BD Biosciences). El porcentaje de células en cada fase del ciclo celular se determinó con el software FlowJo versión 7.6.3. Los resultados se expresaron como la media ± SD de el porcentaje de células en fase G1 o G2 /M más fase S [41]. El ensayo se realizó por triplicado al menos tres veces.
de colonias en agar suave Formación Ensayo
El ensayo de formación de colonias en agar blando se realizó utilizando métodos estándar, como se describe anteriormente por nosotros [43]. Brevemente, 1 mL capas inferiores (base agar capas) que consisten en un medio de agar 0,6% se prepararon en placas de 6 pocillos mediante la combinación de volúmenes iguales de 1,2% agar Noble, ya sea con 2 × medio DMEM con 20% de FBS. las células se tripsinizaron, se centrifugaron, y ressuspended en un medio de 0,35% de agar (agar de capa superior; volúmenes iguales de 0,7% agar Noble y 2 × DMEM con 20% FBS); 2 × 10
3 células se sembraron sobre las capas de base de agar previamente preparadas. Las células se incubaron a 37 ° C en una atmósfera humidificada 5% de CO
2 ambiente durante 15 días y las colonias formadas se tiñeron con violeta cristal al 0,05% durante 15 minutos. colonias teñidas se fotografiaron usando un microscopio estereoscópico (Olympus S2 × 16) y una cámara digital (Olympus DP71) y contaron con la imagen J Software. Sólo las colonias con un tamaño superior a 775 micras
2 (aproximadamente 31,4 micras de diámetro) se contaron [43]. Los resultados se expresan como la media ± desviación estándar. El ensayo se realizó por triplicado al menos tres veces.
Chick corioalantoidea de membrana (CAM) Ensayo
Para evaluar
in vivo
la proliferación tumoral y la angiogénesis se utilizó el ensayo de CAM como descrito anteriormente [41], [43]. huevos de pollo fertilizados se incubaron a 37 ° C y 70% de humedad, y en el día 3 de desarrollo, una ventana se hizo en la cáscara, que se selló con cinta y los huevos se devolvieron a la incubadora. En el día 9 de desarrollo, los pequeños anillos de plástico se colocaron en la CAM y en el día 10 de desarrollo 3 × 10
6 células, se resuspendieron en 20 l de medio DMEM, se inyectaron en los anillos sobre la CAM. En el día 17 de desarrollo, el tumor formado fue fotografiado
in ovo
usando un estereomicroscopio (Olympus S2 × 16), y el perímetro del tumor se midió utilizando software de la célula B (Olympus). Los resultados se expresan como la media ± desviación estándar.
Finalmente, los huevos de gallina se sacrificaron a -80 ° C durante 10 minutos, y la CAM y los tumores se fijaron con paraformaldehído al 4% y se fotografiaron
ex ovo
de los vasos sanguíneos de conteo. Los tumores fueron incluidos en parafina y se procesaron para análisis histológico.
Análisis estadístico
Las correlaciones entre la expresión RKIP y los datos clínicos de los pacientes se realizaron mediante la prueba de chi-cuadrado (χ2-test). probabilidades de supervivencia acumulada se calcularon utilizando el método de Kaplan-Meier. Las diferencias entre las tasas de supervivencia fueron probados con la prueba de log-rank. El análisis estadístico se realizó con el programa SPSS para Windows, versión 17.0. Para
in vitro
y
ensayos in vivo
, comparaciones individuales entre las diferentes condiciones estudiadas se realizaron mediante la prueba t de Student, y las diferencias entre los grupos fueron analizados utilizando el análisis de dos vías de la varianza (ANOVA) . El análisis estadístico se realizó utilizando GraphPad Prism versión 5. El nivel de significación en todos los análisis estadísticos se fijó en p. & lt; 0,05
Resultados
Expresión RKIP en tejidos cervicales
un enfoque inmunohistoquímica se realiza para detectar la expresión de proteínas RKIP y distribución de las lesiones cervicales (Fig. 1).
a) expresión positiva en una cervicitis. B) Alto grado de lesión intraepitelial escamosa con la expresión negativa. C) tejido Adenocarcinoma que representa la expresión positiva. D) adenocarcinoma Negativo (*) con las células normales adyacentes (flecha) que representan la tinción positiva. Todas las imágenes fueron tomadas con a 200 × magnificación.
Se observó Citoplasmáticos expresión positiva de RKIP en el 64,5% (29/45) de las muestras cervicitis, en el 44,7% (21/47) de LSIL y 53,5% (23/43) de HSIL (Tabla 1) (Fig. 1A y B). No se observaron diferencias significativas en los niveles de expresión de RKIP entre LSIL y HSIL (
p = 0,404
), y también entre la cervicitis y lesiones intraepiteliales escamosas (SIL) en general (
p = 0,087
), Tabla 1). En cuanto a las lesiones malignas, RKIP estaba presente en niveles bajos, con sólo el 19,5% (8/41) de CA, el 12,9% (9/70) de SCC y el 15,4% (2/13) de ASC que representa una tinción positiva (Tabla 1) ( La Fig. 1C y D). No se observaron diferencias significativas entre la expresión RKIP en las diferentes lesiones malignas estudiadas (
p = 0,643
, Tabla 1). Sin embargo, cuando la agrupación de las lesiones benignas (cervicitis y SIL) y las lesiones malignas (AC, SCC y ASC), se observó una disminución estadísticamente significativa de la expresión RKIP en muestras de cáncer de cuello uterino (
p
& lt; 0,001) cuando en comparación con las lesiones benignas (Tabla 1) guía
No se encontraron correlaciones entre la expresión RKIP y las características clínicas de los pacientes, tales como la edad, la presencia de datos de seguimiento de metástasis y, con independencia del tipo histológico (p & gt.; 0,05, Tabla 2).
expresión RKIP y la modulación de ERK en líneas celulares de cáncer de cuello uterino
para estudiar el papel de RKIP en el cáncer cervical, primero se proyectarán para la expresión en RKIP líneas celulares de cáncer cervical humano (HeLa, SiHa y C-33A) por inmunocitoquímica y Western blot (Fig. 2). Se encontró que RKIP se expresa en altos niveles en todas las líneas celulares, y está presente tanto en el citoplasma y el núcleo de las células (Fig. 2A), como ya se ha descrito antes [37]. Todas las líneas celulares se utilizaron para derribar la expresión de RKIP por transfección estable con el vector de PQY15 que contiene una horquilla corta de ARN-para RKIP (shRKIP). El vector vacío también se transfectó como control. Los niveles de proteína RKIP en estas células transfectadas estables se determinaron por análisis de transferencia Western. Como se muestra en la Fig. los niveles de proteína 2B, RKIP se inhibió de manera eficiente en las células transfectadas shRKIP en comparación con las células transfectadas vector vacío.
análisis A) La inmunocitoquímica para RKIP en HeLa, SiHa y células C-33A muestran expresión tanto nuclear y citoplasmática. B) Para la inhibición RKIP, las líneas celulares fueron transfectadas de forma estable con un shRNA para RKIP y con el respectivo vector vacío por el control. los niveles de expresión RKIP se evaluaron mediante inmunotransferencia de tipo Western. Además, se estimularon las células con 10 ng /ml de EGF por 10 minutos y EGFR y la activación de ERK (fosforilación) se evaluó mediante Western blot para la fosfo-ERK1 /2 y la expresión de fosfo-EGFR, pero no se observaron diferencias significativas. E: Vaciar vector; Sh:. ShRKIP
Para explorar el papel de RKIP en la modulación de EGF estimula la señalización de ERK en el cáncer de cuello uterino, las células transfectadas fueron estimuladas con EGF, y los niveles de fosforilación de EGFR y ERK se evaluaron por Western Blot . Como se puede observar en la Fig. 2B, la estimulación de EGF no dio lugar a efectos significativos en la activación de ERK señalización en estas células, independientemente de la condición RKIP.
papel de la expresión RKIP en líneas celulares de cáncer de cuello uterino comportamiento biológico
Para evaluar si la modulación de la expresión RKIP influyó en las propiedades tumorigénicas de las células, se optó por la línea celular con el más alto nivel de inhibición RKIP por shRKIP, HeLa y medimos
in vitro
sus capacidades de viabilidad, proliferación, crecimiento independiente del anclaje y migración en (Fig. 3). Hemos observado que shRKIP células transfectadas tienen una ventaja significativa sobre la viabilidad de tiempo (Fig 3A.), En comparación con las células transfectadas vector vacío (p & lt; 0,05). Esta diferencia puede ser un reflejo de un aumento del número de células o puede reflejar el aumento de metabolismo celular. Para ver si esta ventaja viabilidad fue debido a mayores tasas de proliferación, se estudió el efecto de RKIP sobre la incorporación de BrdU, la distribución del ciclo celular y el crecimiento independiente de anclaje. El ensayo de BrdU, confirmó que shRKIP transfectadas células tienen una ventaja proliferativa significativa con el tiempo (Fig. 3B). El ensayo de formación de colonias en agar blando demostraron una disminución significativa (p & lt; 0,05) aumento en el número de las colonias formadas en las células transfectadas shRKIP en comparación con las células de control (Fig 3C.). Por análisis del ciclo celular, se observó que las células transfectadas shRKIP tenían una disminución de la fase G0 /G1 con un concomitante y significativa (p & lt; 0,05) aumento de la G2 /M + S fase (Fig 3D.). Estos resultados fueron validados en las otras dos líneas de células transfectadas, SiHa y C-33A (Fig. S1A-D).
A) y B viabilidad celular) La proliferación se midió a las 24, 48 y 72 horas por Los ensayos de MTS y BrdU, respectivamente. células inhibidas RKIP tenían una viabilidad estadísticamente significativa y una ventaja proliferativa en el tiempo, en comparación con las células control. C) Las células se ensayaron con respecto a su capacidad para proliferar en medio de crecimiento que contiene 0,35% de agar y la formación de colonias multicelulares fotografiados con una ampliación x16 después de 14 días. inhibición RKIP induce un crecimiento estadísticamente significativo independiente de anclaje de células HeLa en agar blando. D) regulación a la baja de RKIP en células HeLa induce un cambio en la distribución del ciclo celular con un mayor porcentaje estadísticamente significativo de células en fase S + G2M en comparación con las células control. El análisis del ciclo celular se realizó a las 24 horas en punto en el tiempo de análisis de citometría de flujo de células teñidas de yoduro propridium. E) A cero estandarizada (herida) se aplicó a las monocapas y se tomaron imágenes digitales en varios puntos de tiempo (0; 12; 24 y 48 horas). Se observó que las células transfectadas shRKIP tenían una ventaja estadísticamente significativa la migración con el tiempo, en comparación con las células control (panel derecho). Imágenes representativas a las 0 y 48 horas se presentan en el panel izquierdo. Todos los experimentos se realizaron por triplicado al menos tres veces. Los datos se representan como la media ± desviación estándar y las diferencias con un
p
. & Lt; 0,05 en el ANOVA de dos vías o la prueba t de Student se consideraron estadísticamente significativas (*) guía empresas
Por último , para abordar el efecto de RKIP en células HeLa migración, se realizó la cicatrización de heridas ensayo de migración y se observó que las células shRKIP transfectadas tenían una ventaja de la migración con el tiempo, con una disminución significativa (p & lt; 0,05) mayor tasa de cierre de la herida en comparación con las células de control (Fig. 3E). Lo mismo se observó en las otras dos líneas celulares transfectadas, SiHa y C-33A (Fig. S1E-F).
En vivo
papel de la expresión RKIP en el crecimiento del cáncer de cuello del útero y la angiogénesis
Para examinar el efecto del crecimiento del tumor RKIP mediada por la angiogénesis y
in vivo
, se realizó el ensayo CAM (Fig. 4). Las células transfectadas se implantaron en la CAM del embrión de pollo (células vector vacío, n = 10; células shRKIP, n = 10), y siete días después de la implantación celular, los embriones de pollo se sacrificaron para evaluar el crecimiento del tumor y la angiogénesis, como se describe en la sección de materiales y métodos. La media perímetro de los tumores formados por el control y las células transfectadas era shRKIP 4335 ± 823 micras y 4,913 ± 1,568 m, respectivamente. Como se muestra en la Fig. 4B, el tamaño de los tumores formados por células shRKIP no fue significativamente mayor en comparación con los tumores formados por las células vector vacío.
A) imágenes representativas (16 aumentos) de ensayo de CAM después de 7 días de tumor el crecimiento
in ovo
y
ex ovo
. B) Se midió el crecimiento tumoral
in vivo fotos: por ensayo de CAM como se describe en la sección de materiales y métodos. Se observó un perímetro superior (M) de los tumores (
in ovo
) formados por las células shRKIP, sin embargo, la diferencia entre las células de control no fue significativa. C) la tinción de hematoxilina-eosina de los tumores embebidos en parafina que muestran la vascularización más alta inducida por la inhibición RKIP. Representante imágenes de 10 × 20 × magnificación y están representados en el panel izquierdo. D) Recuento de los vasos sanguíneos
ex ovo
, se observó un aumento estadísticamente significativo en el número de vasos reclutados en los tumores formados por células shRKIP en comparación con el control. En total se analizaron 20 huevos (10 fueron inyectados con el vector vacío y 10 con células shRKIP). Los datos se representan como la media ± desviación estándar y las diferencias con un
p Hotel & lt; 0,05 en la prueba de la t de Student fueron considerados estadísticamente significativa (*) guía empresas
Para evaluar el impacto de. RKIP en la modulación de la angiogénesis, que contó
ex ovo
el número de vasos alrededor de los tumores. Contamos con una media de 54 ± 16 y 83 ± 10 vasos en los tumores formados por el vector vacío y las células transfectadas shRKIP, respectivamente. células inhibidas RKIP revelaron una estadísticamente significativa (
p
& lt; 0,05) aumento en los vasos sanguíneos de contratación cuando se compara con las células de control (Fig. 4D). Como se muestra en la Fig. 4C, la tinción con hematoxilina-eosina de los tumores embebidos en parafina y CAM de confirmó la rica vascularización de los tumores con capilares de todo el tumor y capilares que brotan fuera de la CAM en los tumores. Se observaron mayores tasas de vascularización en los tumores formados por células transfectadas shRKIP (Fig. 4C).
Papel de RKIP en células de cáncer de cuello uterino respuesta a la quimioterapia
Para determinar si la proteína podría estar involucrada RKIP en la modulación de la respuesta del paciente de cáncer cervical a la quimioterapia convencional, se determinó la sensibilidad de líneas celulares de cáncer de cuello uterino transfectadas con shRKIP al tratamiento con cisplatino. Como se puede observar en los ensayos citotóxicos (Fig. 5A), todo el shRKIP transfectadas líneas celulares fueron menos sensibles al tratamiento con cisplatino, cuando se compara con las líneas de células de control transfectadas con el vector vacío, siendo esta diferencia menos evidente para C-33A línea celular. Como se muestra en la Fig. 5B, las células HeLa transfectadas con el shRKIP muestra un IC media
50 de 18,55 ± 2,06 M contra los 5,91 ± 0,30 mM alcanzados por las células vector vacío. Para la línea celular C-33A los valores fueron más similares entre las dos líneas celulares transfectadas, 10,37 ± 2,69 M y 13.25 ± 1.98 M para el vector vacío y las células transfectadas shRKIP, respectivamente (Fig. 5B). La línea de células SiHa fue la menos sensible a cisplatino con el vector vacío células transfectadas que alcanzan 25,99 ± 0,51 M de media IC
50, mientras que las células shRKIP transfectadas llegaron a 40,69 ± 2,37 M de media IC
50 para el cisplatino (Fig . 5B).
a) imágenes representativas del análisis de regresión no lineal de las líneas celulares de cáncer de cuello uterino tratados con cisplatino para la determinación de las concentraciones inhibitorias medias máximas (CI
50). B) Representación gráfica de los valores de la media de CI
50 para cisplatino en las líneas celulares de cáncer de cuello uterino. Las células transfectadas con shRKIP fueron menos sensibles al tratamiento con cisplatino en las tres líneas celulares diferentes. C) HeLa transfectadas líneas celulares fueron expuestas a concentraciones crecientes de cisplatino por 24 horas. tratamiento cisplatino inducida por la activación de ERK (p-ERK1 /2) y la apoptosis de las células según la evaluación de PARP (total y cleaded anticuerpos específicos) y la caspasa-9 hendidura, principalmente en las células transfectadas vector vacío. Todos los experimentos se realizaron por triplicado al menos tres veces.