Extracto
Aplicaciones
El cáncer de páncreas es una neoplasia agresiva con el curso metastásico característica de la enfermedad y resistencia a la convencional quimio-radioterapia. RLIP76 es una proteína de membrana celular multi-funcional que funciona como un transportador principal ruta del ácido mercaptúrico, así como regulador clave de los complejos ligando-receptor. En este sentido, se determinó la importancia de la orientación RLIP76 sobre la vía PI3K /Akt y mecanismos de regulación de la respuesta a la quimio-radioterapia.
Material y métodos
La supervivencia celular
se evaluó mediante MTT y de formación de colonias ensayos. los niveles celulares de proteínas y la fosforilación se determinó mediante análisis de transferencia Western. El impacto sobre la apoptosis se determinó por el ensayo TUNEL. Los efectos anticancerígenos de RLIP76 las intervenciones selectivas del
in vivo
se determinaron utilizando ratones modelo de xenoinjerto de cáncer de páncreas. La regulación del transporte de doxorrubicina y radiación sensibilidad se determinó mediante estudios de transporte y ensayos de formación de colonias, respectivamente.
Resultados
Nuestros estudios actuales revelan un modelo que abarca por el papel de RLIP76 en la regulación de los niveles de proteínas fundamentales como PI3K, Akt, e-cadherina, CDK4, Bcl2 y PCNA que son de importancia específica en la transducción de señales de las cascadas de señalización aguas arriba críticos que determinan la proliferación, la apoptosis y la diferenciación de las células del cáncer pancreático. RLIP76 agotamiento también causó marcada y la regresión de BxPC-3 tumores de cáncer de páncreas humanos establecidos en el modelo de xenoinjerto de ratón desnudo sostenida. RLIP76 resultó ser un importante regulador del transporte de drogas, y contribuyen a la resistencia a la radiación en el cáncer de páncreas.
Conclusiones /Importancia
RLIP76 representa un objetivo mecánica significativa para el desarrollo de intervenciones eficaces en agresivo y los cánceres de páncreas refractarios
Visto: Leake. K, J Singhal, Nagaprashantha LD, Awasthi S, SS Singhal (2012) RLIP76 Regula PI3K /Akt señalización y quimio-radioterapia resistencia en cáncer de páncreas. PLoS ONE 7 (4): e34582. doi: 10.1371 /journal.pone.0034582
Editor: Abbes Belkhiri, Vanderbilt University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 11 Enero, 2012; Aceptado: 7 Marzo 2012; Publicado: 3 Abril 2012
Derechos de Autor © 2012 Leake et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por el NIH subvención CA 77495 y la Fundación de Investigación del cáncer del Norte de Texas. La fuente de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de páncreas es la cuarta causa principal de muerte por cáncer entre los hombres y las mujeres [1]. Aproximadamente el 95% de los tumores malignos en el páncreas surgen del tejido exocrino. Entre las neoplasias malignas pancreáticas exocrinas, 80% a 90% son adenocarcinomas ductales [2], [3]. Menos del 20% de los pacientes con cáncer pancreático tienen la enfermedad que se macroscópicamente confinado en el páncreas en el diagnóstico con el resto de los pacientes que presentan metástasis viscerales localmente avanzados y distantes, que generalmente incluye el hígado [4]. cánceres pancreáticos poseen múltiples aberraciones en las cascadas de señalización celular y están característicamente conocidos por su fenotipo invasivo y la refractariedad a los modos convencionales de terapia. El tratamiento de cáncer de páncreas es con frecuencia se reunió con resultados decepcionantes debido al desarrollo de resistencia a la consiguiente terapia a la activación de una serie de proteínas de supervivencia promover que transducen señales a partir de moléculas de señalización extracelular tales como el factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento transformante (TGF ), o factores de crecimiento similares a la insulina (IGF1) [5], [6]. Los estudios moleculares han caracterizado las mutaciones del oncogen K-ras en 80% o más de los adenocarcinomas ductales [7]. La vía PI3K /Akt juega un papel importante en la transducción de señales de receptores de factores de crecimiento de aguas arriba, así como K-ras oncogénico [8] - [12]. PI3K señalización /Akt también representa un eje potente y fundamental de relé de señal que determina la supervivencia basal y resistencia a los efectos apoptóticos de quimio-radioterapia en una variedad de tipos de cáncer, lo que hace vía PI3K /Akt un foco central de las investigaciones mecanicistas en el cáncer de páncreas [13], [14]. Actualmente, no existe un tratamiento eficaz para el cáncer de páncreas y quimio-radioterapia convencional ha demostrado un éxito muy limitado en la mejora de la supervivencia del paciente. La tasa de supervivencia global de los pacientes con cáncer de páncreas es de ~ 5%. Por lo tanto, la investigación de los mecanismos de acción de los nuevos objetivos que puede regular los cambios moleculares que conducen a la supervivencia cáncer de páncreas y refractariedad al tratamiento facilitará el desarrollo de intervenciones eficaces para el cáncer de páncreas [4], [15].
ruta del ácido mercaptúrico juega un papel crítico en la regulación de la resistencia celular antioxidante potencial y quimio-radioterapia [16]. El glutatión (GSH) es un azufre que contiene moléculas pequeñas en las células que es esencial para proteger las células de múltiples estímulos tóxicos que inducen la muerte celular [17]. Durante la primera etapa de la vía de ácido mercaptúrico, el glutatión celular S-transferasas (GSTs) catalizan la conjugación de los fármacos y productos de peroxidación de lípidos de quimioterapia administrados, consecuente inducida a la radioterapia, con GSH para formar glutatión-conjugados (GS-Es) [18 ]. La SG-Es todavía son tóxicos para las células y necesitan ser effluxed fuera de las células con el fin de proteger a las células de la muerte celular. Durante el segundo paso de la vía de ácido mercaptúrico, la SG-ES se effluxed fuera de las células y este proceso está mediado por las bombas de transporte dependiente de la energía presente en las membranas de las células [19]. En nuestros amplios estudios publicados anteriormente, hemos demostrado que RLIP76 es un transportador de vía del ácido mercaptúrico primario que elimina GS-Es resultantes de los productos de la peroxidación de lípidos y fármacos de quimioterapia de las células. Esta función de RLIP76 es más importante para las células de cáncer en comparación con las células normales como el agotamiento de RLIP76 no mata a las células normales, pero es muy eficaz para matar las células de cáncer de casi todos los tipos [20] - [24].
Nuestros estudios recientemente publicados indican que RLIP76 es también un GS-E transportador de respuesta al estrés requerido para la endocitosis dependiente de clatrina (CDE), que se requiere para la regulación de la señalización de receptor-ligando a los receptores de la membrana celular [25]. En el contexto de golpear la resistencia a la quimio-radioterapia del cáncer de páncreas y el papel fundamental de RLIP76 como un importante transportador de ruta del ácido mercaptúrico que es esencial para la supervivencia y la terapia de la resistencia en los cánceres, se investigó el papel de RLIP76 en la regulación de las proteínas de señalización críticos implicados en la la retransmisión de las aportaciones de múltiples vías y mecanismos de supervivencia de aguas arriba que contribuyen a la resistencia a la quimio-radioterapia en el cáncer de páncreas.
se obtuvo Materiales y Métodos
Materiales
la doxorrubicina (DOX, adriamicina) de Adria Laboratories (Columbus, OH).
3H-GSH (3000 Ci /mmol) se adquirió de Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ).
14C-DOX (actividad específica 44,8 Ci /mmol) se adquirió de NEN Life Sciences (Boston, MA). Policlonal de conejo-anti-humano-rec RLIP76 IgG así como pre-inmune IgG se prepararon y se purificó como se describe anteriormente [26], [27]. MRP (N19; cat#sc7774), PGP (C19; cat#sc1517), Akt (cat#Sc8312), GAPDH (cat#sc32233), Bcl2 (cat#sc509), Bim (cat#sc11425), y ciclina B1 (#sc595) anticuerpos gato se obtuvieron de Santa Cruz Biotechnology (Columbus, OH). pAkt (S
473; cat#05-736) de anticuerpos fue adquirido de Upstate Señalización Celular (Lake Placid, NY). Los anticuerpos contra PI3K (cat#4292S), pPI3K (Y
458; cat#4228) y PCNA (cat#2586S) eran de Tecnologías de Señalización Celular (Danvers, MA). E-cadherina (cat#C3621), β-actina (cat#A5441), y cdk4 (Cat#DCS-35) anticuerpos fueron de Sigma-Aldrich Corp. (St. Louis, MO.) Y Neomarkers (Fremont, CA) , respectivamente. kit de detección de fluorescencia TUNEL se adquirió de Promega (Madison, WI). DNP-SG se sintetizó a partir CDNB y GSH de acuerdo con el método descrito por nosotros previamente [28]. Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional (IACUC) aprobó el protocolo. RLIP76 antisentido se adquirió de biosíntesis, Inc., (Lewisville, TX) [22], y RLIP76 siRNA se adquirió de Investigación Dharmacon (Lafayette, CO), como se describe anteriormente [29].
Animales
HSD: ratones nu /nu atímicos desnudos se obtuvieron a partir de Harlan, Indianapolis, IN. Los animales se mantuvieron en el Instituto de Investigación Beckman, City of Hope National Medical Center, Duarte, CA. Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con un protocolo aprobado (# 11016) por el Instituto de Investigación Beckman, Nacional City of Hope Medical Center Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC).
Líneas celulares y cultivos
células endoteliales vasculares umbilicales humanas (HUVEC) fueron amablemente proporcionados por el Dr. Fiemu Nwariaku, Universidad de Texas Southwestern Medical Center, Dallas, TX, como se ha descrito previamente (22-24), y se cultivaron a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2 en medio EGM-2 kit bullet suplementado con 10% (v /v) (v /v) de solución de FBS inactivado por calor y 1% Pen-Strep (P /S). cáncer de páncreas humano líneas celulares (BxPC-3 y Panc-1) se adquirieron de la American Type Culture Collection, Manassas, VA, y se cultivaron a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2 en MEBM y RPMI-1640 medio suplementado con 10% (v /v) de FBS inactivado por calor, 1% (v /v), Pen-Strep (/S P) solución, 2 mM L-glutamina, HEPES 10 mM, piruvato de sodio 1 mM, 4,5 g /L de glucosa y 1,5 g /L de bicarbonato de sodio. Se ensayaron todas las células de
Mycoplasma
una vez cada 3 meses.
se determinó
MTT ensayo de viabilidad celular
del número de células /ml en una alícuota de células en crecimiento en fase logarítmica contando azul de tripano con exclusión de las células en un hemocitómetro y se sembraron 20.000 células en cada pocillo de placas de 96 pocillos de microtitulación de fondo plano. Después de 12 h de incubación a 37 ° C, medio que contiene IgG pre-inmune o anti-RLIP76 IgG (40 mg /ml de concentración final) se añadieron a las células. Después de 24 a 48 h de incubación, 20 l de 5 mg /ml MTT se introdujo a cada pocillo y se incubaron durante 2 h de exposición. Las placas se centrifugaron y medio se decantó. Las células se disolvieron posteriormente en 100 l de DMSO con agitación suave durante 2 h a temperatura ambiente, seguido de la medición de OD
570 nm [30]. Ocho pocillos replicados se utilizaron en cada punto en cada uno de tres mediciones separadas. Los valores de absorbancia medidos estaban directamente relacionados con una hoja de cálculo para el cálculo de IC
50, que se define como la concentración de fármaco que reduce la formación de formazán en un 50%. El agotamiento de la expresión en las células RLIP76 por RLIP76 siRNA antisentido y RLIP76 se midieron como sigue: se incubaron las células durante 3 h con 0-2 g /pocillo de RLIP76 siRNA usando Transmessenger reactivo de transfección (Qiagen) o RLIP76 antisentido usando el reactivo de transfección Maxfect (Molécula) de acuerdo con los protocolos del fabricante proporcionado
clonación, expresión procariota, y purificación de RLIP76
la proteína purificada RLIP76. (1965 pb; 655 aa) se obtuvo de
e. coli
BL21 (DE3) que expresa el plásmido pET30a (+) que contiene ADNc de longitud completa correspondiente a la secuencia de RLIP76. La purificación se llevó a cabo usando resina DNPSG afinidad como se describe anteriormente y la pureza se confirmó por análisis de Western blot [26], [31].
reconstitución funcional de purificado rec-RLIP76 en liposomas artificiales y estudios de transporte
purificada RLIP76 se dializó frente a tampón de reconstitución (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, MgCl 2 mM
2, EGTA 1 mM, KCl 100 mM, sacarosa 40 mM, BME 2,8 mM, BHT 0,05 mM, y 0,025% polidocanol). Una emulsión acuosa de asolectina de soja (40 mg /ml) y colesterol (10 mg /ml) se preparó en el tampón de reconstitución por sonicación y se añadió 0,1 ml de esta mezcla a 0,9 ml alícuota de proteína rec-RLIP76 dializada y se purifica. La mezcla de reacción se sonicó a 50 W durante 30 s. Vesiculación se inició por la adición de 200 mg SM-2 Bio-perlas pre-equilibrada en el tampón de reconstitución sin polidocanol. Vesiculación se llevó a cabo durante 4 horas a 4 ° C, los SM-2 Bio-perlas se separaron por centrifugación y las vesículas (RLIP76-liposomas) fueron recogidos. La fracción recogida se obtiene principalmente vesículas unilammelar con diámetro medio de 0,25 micras y la relación de volumen intravesicular /extravesicular de 18 l /mL. vesículas de control (control-liposomas) se prepararon utilizando la misma cantidad de albúmina o proteína cruda de
E. coli no
expresar RLIP76. transporte dependiente de ATP
14C-DOX y
3H-DNPSG en el rec-RLIP76 reconstituyó proteoliposomas se realizó mediante la técnica de filtración rápida utilizando el protocolo exacto descrito previamente por nosotros, donde se ha establecido la eficacia de la prestación de proteoliposomas [ ,,,0],26].
preparaciones a base de fracciones de membrana cruda para análisis de Western blot
fracciones de membrana bruta se prepararon a partir de las líneas celulares de cáncer y normales utilizando procedimientos establecidos tal como se describe anteriormente [22]. Brevemente, las células se sedimentaron y se lavaron con solución salina equilibrada (NaCl mM 138 mM, KCl 5, KH 0,3 mM
2 PO
4, Na 0,3 mM
2HPO
4, NaHCO 4 mM
glucosa 3, y 5,6 mM, pH 7,4) tres veces. Las células lavadas se lisaron en 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, que contiene 1,4 mM BME, PMSF 0,1 mM, BHT 0,05 mM, EDTA 0,1 mM y 0,5% (v /v) polidocanol. Los lisados se sometieron a sonicación tres veces durante 30 segundos a 50 W y se incubaron durante 4 horas a 4 ° C con agitación ocasional. Después de la incubación, la preparación resultante se centrifugó a 100,000 x g durante 60 min a 4 ° C. El sobrenadante se recogió y se sometió a SDS-PAGE. Los niveles de proteína RLIP76 en células normales y cancerosas se midió por Western blot y ELISA usando anti-RLIP76 IgG como se describe anteriormente [29], [31]. Purificada rec-RLIP76 con la pureza evaluada mediante análisis de composición de aminoácidos se utilizó para generar curvas de calibración.
Estudios de Transporte de comprobantes entre oficinas
vesículas de membrana cruda (de dentro a fuera vesículas, IOV) se prepararon a partir del (BxPC-3 y Panc-1) líneas de células normales (HUVEC) y malignos utilizando los procedimientos establecidos según lo descrito por nosotros para las células K562 [26]. Los estudios de transporte de DOX y DNP-SG en comprobantes entre oficinas se realizaron por el método como se describe anteriormente [26]. Comprobantes entre oficinas se recubrieron por separado con 40 mg de concentración /ml final de cualquiera de anti-RLIP76 IgG, anti-IgG MRP1, o anti-Pgp IgG y se usa para medir la absorción dependiente de ATP de
14C-DOX. la absorción dependiente de ATP de
14C-DOX se determinó restando la radiactividad (cpm) de los controles sin ATP de la de los grupos experimentales que contienen ATP. El transporte de DOX se calculó en términos de mg de proteína pmol /min /IOV. El transporte de
3H-DNP-SG se midió de manera similar
xenoinjertos tumorales modelo
HSD:. /Nu atímicos desnudos nu se obtuvieron a partir de Harlan, Indianapolis, IN. Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con un protocolo aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional (IACUC). Treinta y seis de 10 semanas de edad ratones se dividieron en seis grupos de 6 animales (tratados con suero pre-inmune, revueltos siRNA, revueltos antisentido, anticuerpos RLIP76, RLIP76 siRNA y ADN antisentido RLIP76). Los 36 animales fueron inyectados con 2 × 10
6 células humanas de cáncer de páncreas (BxPC-3) suspensiones en 100 l de PBS, por vía subcutánea. Los animales fueron examinados diariamente para detectar signos de crecimiento del tumor. El tratamiento se administró cuando la superficie tumor superó ~42 mm
2 (día 47 después de la inyección de las células tumorales, es decir, día 1 de tratamiento). El tratamiento consistió en 200 g de cualquiera de los anticuerpos RLIP76, RLIP76 siRNA o RLIP76 antisentido en 100 l de PBS. Los grupos de control fueron tratados con 200 mg /100 l de suero pre-inmune, revueltos siRNA y revueltos antisentido. Los tumores se midieron en dos dimensiones mediante calibres.
Colonia ensayo de formación de
Las células (0,1 × 10
6 células /500 l) se incubaron con antisentido revueltos y antisentido RLIP76 (10 mg /ml de concentración final) durante 24 h. Después de 24 h, alícuotas de 50 y 100 l de se incubaron adicionalmente en placas de 60 mm de tamaño de Petri, por separado, en un volumen total de 4 ml de medio en cada placa de Petri. Para los experimentos de irradiación, el control y RLIP76-proteoliposomas (50 mg /ml de concentración final, 24 h) se irradiaron las células tratadas en 100, 200, 500 y 1000 cGY utilizando Varian Clinac 2100C Acelerador lineal con haz de fotones 6 MeV. Después de 7 días, las colonias adherentes se fijaron, se tiñeron con 0,5% de azul de metileno durante 30 min., Y las colonias se contaron usando Innotech Alfa Imager HP [32].
Efecto de RLIP76 antisentido sobre la apoptosis mediante el ensayo TUNEL
las células (~ 1 × 10
6) fueron cultivadas en la cubierta se desliza y tratados con antisentido revueltos y antisentido RLIP76 (10 mg /ml de concentración final) en el reactivo de transfección Maxfect (Molécula). La apoptosis se determinó por el etiquetado de los fragmentos de ADN con el etiquetado terminal de desoxinucleotidil-transferasa dUTP nick-end (TUNEL) ensayo utilizando Promega sistema de detección de apoptosis de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante [33].
Análisis estadístico
se evaluaron todos los datos con la prueba t de Student no pareada de dos colas o compararon mediante ANOVA de una vía y se expresan como la media ± SD. Para
in vivo
estudios, los valores de tratamiento de drogas se compararon con los valores de tratamiento de control del vehículo. Un
p
valor & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Resultados
Expresión de RLIP76 en las células de cáncer de páncreas
análisis de Western blot de los extractos de proteínas de membrana. de las células cancerosas normales y pancreáticos humanos se indica la presencia de cantidades relativamente grandes de RLIP76 en las células de cáncer de páncreas en comparación con las células normales (Fig. 1A). Después de la caracterización de una mayor expresión de RLIP76, se investigó aún más el efecto de la inhibición RLIP76 o el agotamiento de las células de cáncer de páncreas. Los resultados de la evaluación de los niveles de proteína RLIP76 tal como se presenta en la Tabla 1 indican las cantidades totales de proteínas de membrana en bruto obtenido a partir de 10
8 células en fase logarítmica de crecimiento. proteína RLIP76 representaba el 12 ± 2 g /10
8 células normales y ~ 40 ± 3 g /10
8 células del cáncer pancreático, respectivamente (0,19% y ~0.61% de la proteína soluble total de detergente de las membranas de la normalidad y células de cáncer de páncreas, respectivamente). La expresión de RLIP76 en las células de cáncer de páncreas estaba en el rango comparable en relación con los resultados de varias otras líneas celulares en nuestros estudios anteriores [22], [24], [29].
Las alícuotas de las fracciones de membrana cruda de cáncer de páncreas se utilizaron células (BxPC-3 y Panc-1) y las células de control normales (HUVEC) que contienen 100 g de proteína por SDS-PAGE y Western Blot. La intensidad de la proteína RLIP76 de longitud completa (~ 95 kDa) de banda se cuantificó por densitometría de barrido usando Innotech Alfa Imager HP. β-actina se utilizó como control interno (panel A). Impacto de la anti-RLIP76 IgG, RLIP76 siRNA y RLIP76 antisentido en células normales y cáncer de páncreas: Efecto de anti-RLIP76 IgG (40 mg /ml de concentración final) sobre la supervivencia celular se determinó mediante el ensayo de MTT [29], [30]. El agotamiento de expresión RLIP76 por RLIP76 siRNA antisentido y RLIP76 (cada uno 10 mg /ml concentración final) se realizó, utilizando Transmessenger Transfección-Reactivo-kit (Qiagen), y Maxfect Transfección-reactivo (Molecula, Inc.), respectivamente, de acuerdo con la Instrucciones del fabricante. La supervivencia celular se midió mediante el ensayo de citotoxicidad MTT 48 h después del tratamiento. Los valores se presentan como media ± desviación estándar a partir de dos determinaciones separadas con ocho repeticiones cada uno (n = 16), las barras negras, las células normales HUVEC; barras grises, BxPC-3 células de cáncer de páncreas (panel B) * p & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01 en comparación con los controles respectivos. Efecto de RLIP76 antisentido de PI3K y Akt señalización en las células de cáncer de páncreas: RLIP76 antisentido causó la inhibición de la vía PI3K /Akt en células Panc-1 BxPC-3 y. Las células se trataron con 10 g /ml de RLIP76 antisentido para 24 h y inmune-borrados para pPI3K, PI3K, pAkt, Akt, Bim, Bcl2, ciclina B1 y CDK4. La misma transferencia se desnudó y se volvió a sondear para GAPDH para garantizar la igualdad de proteínas de carga (panel C). diagrama de barras muestra la cuantificación de las respectivas transferencias de Western. La línea punteada representa ningún cambio significativo como se observa con antisentido revueltos (panel D).
inhibición RLIP76 o el agotamiento hace que la citotoxicidad en células de cáncer de páncreas
Los efectos citotóxicos iniciales de RLIP76 inhibición en células de cáncer de páncreas se evaluaron por la inhibición RLIP76 utilizando anti-IgG RLIP76 y el agotamiento RLIP76 usando RLIP76 siRNA o RLIP76 antisentido fosforotioato mediante un ensayo de supervivencia de las células MTT establecida [22], [30]. Protein-A fracción de inmunoglobulina purificada por afinidad obtenida a partir del suero pre-inmune se utilizó como control. Anti-RLIP76 IgG utilizada en estos experimentos se demostró previamente mediante un ensayo de inmunodifusión doble de Ouchterlony para ser no reactividad cruzada con cualquier otro proteínas incluyendo Pgp o MRP [31]. Las células se trataron con IgG preinmune, revueltos siRNA, revueltos antisentido, anti-IgG RLIP76, RLIP76 siRNA o antisentido RLIP76 para 24 h. La citotoxicidad de los tres RLIP76 agentes de direccionamiento, RLIP76 siRNA, el anticuerpo y antisentido, se dirige preferentemente hacia las células malignas en comparación con las células HUVEC no malignas, que era similar a nuestras observaciones con otra maligno (de pulmón, melanoma, riñón, próstata ) y líneas de células no malignas [22], [24], [29], [34]. En contraste con los resultados anteriores observados con pulmón o de colon cánceres (en el que las tres modalidades dieron resultados similares), RLIP76 antisentido fue significativamente más eficaz para matar células de cáncer pancreático que el anticuerpo RLIP76 (Fig. 1B). RLIP76 media la supervivencia y la proliferación de las células cancerosas por múltiples mecanismos, que incluyen una mayor desintoxicación de los productos de la peroxidación lipídica, así como regulación de las vías de señalización intracelular [19], [25], [35]. La eficacia mejorada de RLIP76 antisentido fue un hallazgo sorprendente que estimuló la investigación más detallada de agotamiento RLIP76 en la regulación de los niveles de proteínas intracelulares críticos en las células de cáncer de páncreas.
RLIP76 antisentido regula por disminución PI3K /Akt en células de cáncer pancreático
BxPC-3 y Panc-1 células fueron tratadas con antisentido RLIP76 durante 24 h seguido de análisis de Western blot para estudiar el impacto de las proteínas intracelulares críticos (figs. 1C y D). PI3K /Akt se activa de forma constitutiva en la mayoría de los tumores de páncreas [11]. tratamiento antisentido RLIP76 suprimió significativamente la fosforilación de PI3K, aguas arriba de un nodo de señalización señal común, que tranduces señales mitogénicas consecuente a los teléfonos receptores de membrana como factores de crecimiento y las integrinas. tratamiento antisentido RLIP76 también redujo significativamente los niveles de proteína y la fosforilación de Akt en células BxPC-3 y Panc-1. Curiosamente, la fosforilación de Akt y PI3K no se detectó en las células normales HUVEC (datos no presentados), lo cual es consistente con el entendimiento general de que PI3K o Akt se activan en las células transformadas [36]. La PI3K y Akt representan nodos importantes de relé de señalización que a su vez regulan los objetivos de abajo críticos que están involucrados en la apoptosis, la proliferación y el mantenimiento del fenotipo de los cánceres. La activación de Akt conduce a la represión de la expresión de E-cadherina [37]. E-cadherina se considera un marcador de fenotipo epitelial normal y pérdida de E-cadherina se asocia con "transición epitelial mesenquimal (EMT)" y un fenotipo agresivo de cáncer [38]. La activación de PI3K conduce a una mayor activación de mTOR que suprime la expresión de la pro-apoptótica Bim y favorece la supervivencia y proliferación de las células del cáncer [39]. Los mejores niveles de anti-apoptóticos Bcl2 y la quinasa dependiente de ciclina 4 (CDK4) han demostrado mediar resistencia a la inhibición de mTOR [40]. El agotamiento de RLIP76 por antisentido aumentó significativamente los niveles de la pro-diferenciación marcador de E-cadherina y proteína pro-apoptótica Bim mientras que disminuye los niveles de proteína anti-apoptótica Bcl2, ciclina B1 y CDK4 en tanto BxPC3 y las células de cáncer de páncreas Panc-1. Por lo tanto, el agotamiento de RLIP76 tuvo un impacto significativo sobre los mediadores críticos de eje de señalización de PI3K /Akt en el cáncer de páncreas (Figs. 1C y D).
Efecto de agotamiento RLIP76 en la supervivencia clonogénico y apoptosis
además, confirmó los efectos del agotamiento RLIP76 en el potencial de supervivencia y proliferación celular mediante la evaluación del potencial clonogénico y la apoptosis en las células pancreáticas BxPC3. tratamiento antisentido RLIP76 causado agotamiento RLIP76 como se detectó por Western blot (Fig. 2A) y se inhibe el potencial clonogénico como se determina por el ensayo de formación de colonias (Fig. 2B). El impacto de RLIP76 sobre la apoptosis se evaluó mediante el ensayo TUNEL. Los resultados del ensayo de TUNEL no mostraron apoptosis detectable con antisentido revueltos mientras RLIP76 antisentido causó apoptosis en las células de cáncer de páncreas BxPC-3. La cuantificación de la fluorescencia roja y verde por análisis de imagen -J confirmó los hallazgos cualitativos fluorescentes que el agotamiento por RLIP76 antisentido fue eficaz en la inducción de la apoptosis (Fig. 2C).
El agotamiento de RLIP76 por antisentido RLIP76 mediante análisis de Western blot, carril 1 contenía estándar, carriles 2 y 3, contenía fracción de membrana en bruto de cáncer de páncreas (BxPC-3) las células 24 h después del tratamiento de RLIP76 antisentido y revueltos antisentido, respectivamente. Los resultados se cuantificaron por densitometría de barrido usando Innotech Alfa de imágenes HP. β-actina se utilizó como control interno (panel A). Formadoras de colonias eficiencia en BxPC-3 células después del tratamiento de antisentido, se realizó por tinción de las células con azul de metileno y las colonias se contaron usando Innotech Alfa Imager HP. Los valores son medias ± S. D. de tres experimentos separados. *** P & lt; 0,005 en comparación con ningún tratamiento o antisentido revueltos (panel B). Apoptosis en células BxPC-3 por RLIP76 antisentido mediante el ensayo de TUNEL, revueltos antisentido (panel superior) y antisentido RLIP76 (panel inferior) las células tratadas. Las células apoptóticas mostraron fluorescencia verde y característico de la contracción celular. El diagrama de barras que muestra la imagen J adyacente análisis del ensayo de TUNEL que representa el porcentaje de células apoptóticas TUNEL positivas (verde) y células vivas normales (rojo). * P & lt;. 0.05 (grupo C)
agotamiento RLIP76 provoca la regresión de xenoinjertos de cáncer de páncreas en ratones desnudos
in vitro
observaciones anteriores en que refleja la lucha contra la neoplásicas efectos del agotamiento RLIP76 se investigaron más
in vivo
ratones modelo de xenoinjerto de cáncer de páncreas. animales portadores de tumores establecidos con
s.c.
. Los tumores de células de páncreas BxPC3 implantados (~42 mm
2) fueron tratados con 200 mg de cualquiera de anticuerpos RLIP76, RLIP76 siRNA antisentido o RLIP76 por
i.p..
inyección. El aumento de peso fue comparable a los controles no tumorales que llevan, y no manifiesta toxicidad fue evidente. El tratamiento con el anticuerpo RLIP76, RLIP76 siRNA antisentido o RLIP76 dio lugar a reducciones rápidas y espectaculares en los tumores (Figs. 3A y B). El anticuerpo RLIP76, RLIP76 siRNA o RLIP76 tratado antisentido animales portadores establecido por vía subcutánea los tumores estaban vivos para ~298 días sin ninguna evidencia de recurrencia. Hubo un crecimiento no controlado en todos los grupos de control tratados con suero pre-inmune, revueltos siRNA y revueltos antisentido y por lo tanto los grupos de control fueron censurados por ~49 días (Fig. 4). La eficacia de la reducción del tumor volumen fue evidente desde tumorales-pesos en el día 47 después del comienzo del tratamiento (Fig. 3B). La eficacia de RLIP76 antisentido en ozono del tumor RLIP76
in vivo
se demuestra en el Western blot para RLIP76 de homogeneizados tumorales (Fig. 3B, recuadro). Tras el agotamiento RLIP76 y la inhibición, la regresión de los implantes tumorales se observaron en todos los animales, sin efectos tóxicos evidentes, ni efectos en el aumento de peso
Para los estudios de xenoinjertos, hemos utilizado 11 treinta y seis semanas de edad de HSD.: nu /nu ratones desnudos atímicos (Harlan, Indianapolis, IN) asignados aleatoriamente 6 animales cada uno en seis grupos de la siguiente manera: 1) en suero pre-inmune, 2) revueltos siRNA, 3) codificado ADN antisentido, 4) anticuerpos RLIP76, 5) RLIP76 siRNA y 6) antisentido RLIP76. Los 36 animales fueron inyectados con 2 × 10
6 células humanas de cáncer de páncreas (BxPC-3) suspensiones en 100 l de PBS, por vía subcutánea en un flanco de cada nu /nu ratón desnudo. Los animales fueron examinados diariamente para detectar signos de crecimiento del tumor y los pesos corporales. Cuando los tumores alcanzaron un área de sección transversal de ~42 mm
2 (47 d después), los animales fueron asignados al azar a grupos de tratamiento como se indica en la Figura 4. El tratamiento consistió en 200 g de anticuerpos RLIP76, siRNA o antisentido en 100 l PBS. Los grupos de control fueron tratados con 200 mg /100 l de cualquiera de suero pre-inmune, revueltos siRNA o ADN antisentido codificado. Los tumores se midieron en dos dimensiones utilizando calibradores. medidas de los tumores se presentan con todos los grupos de control (pre-inmune IgG, revueltos siRNA o antisentido) frente a todos los grupos tratados (anti-IgG RLIP76, RLIP76 siRNA, o anti-sentido) (panel A). Tumor se reduce el peso en el día 47 después del inicio del tratamiento (panel B) y RLIP76 tumor se agota por antisentido (panel B, recuadro). Los tumores se escindieron 48 h después de antisentido-tratamiento, se pesaron y se homogeneizaron, y las alícuotas que contienen 100 g de proteína de cada uno, se cargaron a SDS-PAGE para el Western Blot contra anti-IgG RLIP76 (n = 3; carriles 1-3, revueltos antisentido tratar, y los carriles 4-6, RLIP76-antisentido tratada). Los resultados se cuantificaron mediante densitometría de barrido. Membrana fue despojado y volvieron a sondar con el anticuerpo β-actina para verificar la carga igual de proteínas, * p & lt; 0,05 en comparación con los controles respectivos. Se determinó la base mecánica de la inhibición del crecimiento tumoral por RLIP76-antisentido en los lisados tumorales de control y RLIP76-antisentido ratones tratados: Western blot de lisados de tejido tumoral. Los tejidos tumorales se homogeneizaron, y ~ 70 g de proteína se resolvieron en SDS-PAGE y se sondaron para pPI3K, PI3K, pAkt, Akt, PCNA, Bim, E-cadherina, ciclina B1 y CDK4. Las transferencias fueron despojados y reprobed de GAPDH para garantizar la igualdad de proteínas de carga (panel C). diagrama de barras que representa los análisis de densitometría. La línea punteada representa ningún cambio significativo como se observa con antisentido revueltos (panel D) guía empresas
HSD:. /nu atímicos desnudos nu se obtuvieron a partir de Harlan, Indianapolis, IN. Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con un protocolo aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional (IACUC).