Extracto
Antecedentes
La curcumina inhibe el crecimiento de xenoinjertos de tumores de cáncer de páncreas en ratones desnudos; sin embargo, el mecanismo de acción no se entiende bien. Cada vez es más claro que las proteínas de unión de ARN regulan la expresión de genes postranscripcional y juegan un papel crítico en la estabilidad del ARN y la traducción. Aquí, hemos determinado que la curcumina modula la expresión de ARN de unión a proteínas CUGBP2 para inhibir el crecimiento del cáncer de páncreas.
Metodología /Principales conclusiones
En este estudio, mostramos que la curcumina tratada xenoinjertos de tumores tienen una reducción significativa en el volumen del tumor y la angiogénesis. La curcumina inhibe la proliferación, mientras que la inducción de la detención G2-M y la apoptosis que resulta en la catástrofe mitótica de varias células de cáncer de páncreas. Esto se confirmó además por el aumento de la fosforilación de la proteína 2 puesto de control quinasa (Chk2) acoplado con mayores niveles de ciclina B1 nuclear y Cdc-2. La curcumina aumentó la expresión de la ciclooxigenasa-2 (COX-2) y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) mRNA, pero los niveles de proteína fueron más bajos. Además, la curcumina aumentó la expresión de las proteínas de unión de ARN CUGBP2 /CELF2 y TIA-1. la unión a la COX-2 y el ARNm de VEGF CUGBP2 también se ha mejorado, lo que aumenta la estabilidad del mRNA, la vida media se cambia de 30 min a 8 h. Por otro lado, desmontables silenciador mediada de CUGBP2 restauró parcialmente la expresión de COX-2 y VEGF incluso con tratamiento curcumina. los niveles de COX-2 y de ARNm de VEGF se redujeron para controlar los niveles, mientras que los niveles de proteínas eran más altos.
Conclusión /Importancia
curcumina inhibe el crecimiento del tumor de páncreas a través de catástrofe mitótica mediante el aumento de la expresión de la proteína de unión de ARN CUGBP2, inhibiendo de este modo la traducción de COX-2 y el ARNm de VEGF. Estos datos sugieren que la inhibición de la traducción es un nuevo mecanismo de acción de la curcumina durante la intervención terapéutica de los cánceres de páncreas
Visto:. Subramaniam D, S Ramalingam, Linehan DC, Dieckgraefe BK, Postier RG, Houchen CW, et al . (2011) RNA Binding Protein CUGBP2 /CELF2 media la curcumina inducida por mitótico catástrofe de células de cáncer pancreático. PLoS ONE 6 (2): e16958. doi: 10.1371 /journal.pone.0016958
Editor: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 14 Octubre, 2010; Aceptado 18 de enero de 2011; Publicado: 11 Febrero 2011
Derechos de Autor © 2011 Subramaniam et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Con el apoyo de NIH subvenciones DK062265, CA109269 y CA135559. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
a pesar de los avances en la patogénesis molecular, cáncer de páncreas sigue siendo un problema de salud importante sin resolver en los Estados Unidos [1]. El cáncer de páncreas es un tumor metastásico rápidamente invasivo, que es resistente a las terapias estándar [2], [3]. En la actualidad, la quimioterapia a base de agente único (por ejemplo gemcitabina) es el principal tratamiento para la metástasis de adenocarcinoma de páncreas. tratamiento gemcitabina tiene una tasa de respuesta tumoral por debajo de 10%; Del mismo modo ninguno de los agentes quimioterapéuticos actualmente disponibles tienen una tasa de respuesta objetiva superior al 10% [4], [5]. Más recientemente, las combinaciones de fármacos con gemcitabina también están siendo examinados, pero es demasiado pronto para decir si son clínicamente superior. Sin embargo, la magnitud de este problema exige la necesidad de nuevos agentes terapéuticos.
Los estudios epidemiológicos sugieren que la dieta juega un papel importante en la prevención de muchos tipos de cáncer. La curcumina, un ingrediente activo de la cúrcuma, ha mostrado efectos antitumorales en estudios preclínicos [6], [7]. propiedades antitumorales de la curcumina incluyen la inhibición del crecimiento tumoral y la inducción de la apoptosis [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16] . ensayos clínicos de fase I piloto han demostrado que la curcumina es seguro, incluso cuando se consume en una dosis diaria de 12 g por 3 meses [17], [18], [19]. Una fase más reciente I /II del estudio demostró que la terapia de combinación usando 8 g curcumina oral diaria con gemcitabina fue segura y factible para los pacientes con cáncer de páncreas que justifican más investigaciones sobre su eficacia [20].
Las propiedades anti-tumorales de la curcumina se han atribuido, al menos en parte, a su capacidad para inhibir la expresión y la actividad de la ciclooxigenasa-2 (COX-2) [21], [22]. Es una enzima limitante de la velocidad en el ácido araquidónico en vía de la síntesis de prostaglandinas. La proteína se sobreexpresa en la inflamación y en una variedad de tipos de cáncer. En los cánceres de páncreas, la COX-2 overexpresssion se asocia con la inhibición de la apoptosis, el aumento de la invasividad del tumor, y la promoción de la angiogénesis. El CELF (factores CUGBP-ETR3-como) la familia de proteínas de unión de ARN se compone de seis miembros que están involucrados en diversos procesos celulares, incluyendo mRNA de empalme, la edición, la estabilidad y la traducción [23]. Uno de los miembros, CUGBP2 (también conocidos como CELF2, ETR3, BRUNOL2, Napor2) se expresa de forma ubicua, aunque a niveles más altos en las células del músculo [24], [25]. En estudios previos, se ha demostrado que cuando se sobreexpresa CUGBP2, las células se someten a mitótico catástrofe [26], [27]. También hemos demostrado que CUGBP2 puede unirse a secuencias ricas en AU en la región no traducida 3 'de la COX-2 mRNA y aumentar la estabilidad del mRNA, mientras que la inhibición de su traducción [28]. Hur, un ARN relacionado proteína de unión con similitud estructural con CUGBP2 por el contrario está implicada en el aumento de la COX-2 la estabilidad del ARNm y la mejora de su traducción mediante la unión a los mismos ricos en AU elementos de secuencia [29]. Una tercera proteína de unión de ARN que funciona como un regulador post-transcripcional de la expresión génica mediante el reconocimiento de la secuencia de U-rico en el ARN es TIA-1 (células T restringido-intracelular de antígeno-1). TIA-1 se ha demostrado que inhibe la traducción del ARNm en condiciones de estrés ambiental [30], [31]. En este artículo, se ha determinado el efecto de la curcumina en la expresión de las proteínas de unión de ARN en las células de cáncer de páncreas.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
Todos los animales se manejaron en estricta conformidad con las buenas prácticas de los animales tal como se define por los organismos nacionales y /o locales pertinentes de bienestar animal, y todos los animales de trabajo fue aprobado por el Comité Institucional de animales Cuidado y uso (IACUC) (Protocolo#07-009) de la Universidad de Oklahoma Health Centro de Ciencias.
células y Reactivos
AsPC-1, MiaPaCa-2, Panc-1, BxPC-3 células de cáncer pancreático Pan02 humano y del ratón (todos de la American Type Culture Collection, Manassas, VA) se cultivaron en RPMI 1640 que contiene 10% inactivado por calor suero fetal bovino (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO) y solución de antibiótico-antimicótico al 1% (Mediatech Inc, Herndon, VA) a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2. La curcumina se adquirió de LKT Laboratories, St. Paul, MN.
Proliferación y Ensayos de apoptosis
Para evaluar la proliferación, las células fueron sembradas en placas de 96 pocillos y se cultivaron durante la noche. Las células se trataron luego con dosis crecientes de la curcumina en RPMI 1640 medio que contiene 10% de FBS. Análisis de la proliferación celular se realizó mediante ensayo enzimático [32]. Para la apoptosis, se midió la caspasa 3/7 actividad usando el Apo-homogéneo caspasa-3/7 kit de ensayo (Promega, Madison, WI).
Colonia ensayo de formación de
Brevemente, 6 así platos se sembraron con 500 células viables y se dejaron crecer durante 24 h. Las células fueron incubadas en presencia o ausencia de diversas concentraciones de la curcumina para un máximo de 48 h. Después se retiró el medio que contiene curcumina, y se lavaron las células en PBS y se incubó durante una 10 d adicional en medio completo. Cada tratamiento se realizó por triplicado. Las colonias obtenidas se lavaron con PBS y se fijaron en formalina al 10% durante 10 min a temperatura ambiente y después se lavaron con PBS seguido por tinción con hematoxilina. Las colonias se contaron y se compararon con células no tratadas.
análisis del ciclo celular
Las células fueron tratadas con la curcumina para 12 h y 24 h, y posteriormente se trataron con tripsina y se suspendieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS). una sola célula suspensiones fueron fijadas usando 70% de etanol durante 2 h, y posteriormente se permeabilizaron con PBS que contenía 1 mg /ml de yoduro de propidio (Sigma-Aldrich), 0,1% de Triton X-100 (Sigma-Aldrich) y 2 RNasa g de DNasa libre de (Sigma-Aldrich) a temperatura ambiente. La citometría de flujo se realizó con un analizador FACSCalibur (Becton Dickinson, Mountain, View, CA), la captura de 50.000 eventos en cada muestra. Los resultados se analizaron con el software ModFit LT ™ (Verity Software House, Topsham, ME).
Análisis de reacción en cadena de polimerasa en tiempo real con transcripción inversa
El ARN total aislado de MiaPaCa-2, células y Pan02 xenoinjertos de tumores usando el reactivo TRIZOL transcrito fue inversa con Superscript II de la transcriptasa inversa en presencia de cebadores de hexanucleótidos aleatorios (todos de Invitrogen, Carlsbad, CA). Los ADN complementarios se utilizaron luego para PCR en tiempo real utilizando ADN Taq polimerasa Jumpstart (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO) y SYBR Green colorante de ácidos nucleicos (Molecular Probes, Eugene, OR). Cruce de valores umbral para los distintos genes se normalizaron a ß-actina. Los cambios en la expresión de mRNA se expresaron como factor de cambio con respecto al control. Los cebadores utilizados en este estudio fueron los siguientes: β-actina: 5'-GCTGATCCACATCTGCTGG-3 'y 5'-ATCATTGCTCCTCCTCAGCG-3'; COX-2: 5'-GAATCATTCACCAGGCAAATTG-3 'y 5'-TCTGTACTGCGGGTGGAACA-3'; VEGF: 5'-AGCGCAAGAAATCCCGGTA-3 'y 5'-TGCTTTCTCCGCTCTGAGC-3'; Hur: 5'-3 'y 5' GTGAACTACGTGACCGCGAA-GACTGGAGCCTCAAGCCG-3 '; CUGBP2: 5'-TGCTTCAACCCCCAACTCC-3 'y 5'-GTCCTTGCAGAGTCCCGAGA-3'; TIA-1: 5'-3 'y 5'-ACCCATCTGTTGAATGGCGT GGCAACAGGAAAGTCTAAGGGAT-3'; Ciclina D1: 5'-AATGACCCCGCACGATTTC-3 'y 5'-TCAGGTTCAGGCCTTGCAC-3'
ARN Estabilidad ensayo
Las células fueron tratadas con la curcumina para 2 h.. Actinomicina-D (10 mg /ml de concentración final), un potente inhibidor de la síntesis de ARNm se añadió a las células y ARNm total fue extraído en 0-8 h. RNA fue sometido a PCR en tiempo real como se describió anteriormente. Los datos se presentan como en relación con las células de control, en el momento de la adición de actinomicina D.
análisis de transferencia Western
Los lisados celulares se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida y se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno Immobilin (Millipore , Bedford, MA). Los anticuerpos se adquirieron de Cell Signaling Technology (Beverly, MA), Abcam Inc (Cambridge, MA) y Santa Cruz Biotechnology Inc (Santa Cruz, CA) y se detectaron proteínas específicas por el sistema de quimioluminiscencia mejorada (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) .
inmunoprecipitación
Para la inmunoprecipitación, las células se fijaron con formalina al 1%. Los lisados se prepararon y se inmunoprecipitaron con anticuerpo anti-CUGBP2. El sedimento y sobrenadante fueron incubadas a 70 ° C durante 1 h para revertir los enlaces cruzados, y el ARN se purificó y se sometieron a RT-PCR para determinar los niveles de COX-2 y VEGF mRNA.
siRNA
Secuencia de orientación del ARNm CUGBP2 5'-GCAAACCUUACUGAUCCUA-3 '(adhesión mumber ns. NM_001025076) y un control de siRNA revueltos que no coincida con ninguno de los genes humanos se obtuvieron de Ambion Inc, Texas, EE.UU. y se transfectaron con el reactivo de transfección SIPORT (Ambion).
xenoinjertos de tumores Pan02
Cinco semanas de edad, los ratones desnudos atímicos macho adquiridos en Jackson Laboratories fueron utilizados para
in vivo
experimentos. Los ratones se mantuvieron con agua y comida estándar del ratón
ad libitum Windows que se utiliza en los protocolos aprobados por el Comité de Estudios de Animales de la Universidad. Los animales fueron inyectados con 1 x 10
6 Pan02 células en el flanco izquierdo y derecho y se dejó formar xenoinjertos. Una semana después de la siembra de las células y después de observar la presencia de un tumor palpable, la curcumina (200 mg /kg de peso corporal) en 5% Na
2 HCO tampón
3 solo se administró por vía intraperitoneal diariamente durante 23 d. El tamaño del tumor se midió semanalmente. Al final del tratamiento se sacrificaron los animales y se extrajeron los tumores, se pesaron y se prepararon para su uso en la histología (hematoxilina & amp; eosina, COX-2, VEGF, y CD31) y los estudios de expresión génica
. La inmunocitoquímica e inmunohistoquímica
Las células se sembraron en placas a cubreobjetos y se dejaron crecer durante 24 h. Las células fueron fijadas con 10% de formalina tamponada durante 10 minutos y posteriormente se lavaron con PBS. Después las células se permeabilizaron con PBS que contenía 0,5% de Triton X-100 durante 10 minutos. Los cubreobjetos se incubaron con anticuerpo de conejo anti-ciclina B1 (Santa Cruz biotecnologías, Santa Cruz, CA) y anticuerpos de conejo anti-Cdc2 (Abcam Inc, Cambridge, MA), seguido por IgG anti-conejo biotinilado. Los portaobjetos se procesan adicionalmente usando kit Vectastatin ABC (Vector Laboratories, Burlingame, CA) seguido de tinción DAB.
Los tejidos embebidos en parafina se cortaron a una sección de 4 M, desparafinaron y se trataron con tampón citrato. Luego se bloquearon con avidina /biotina durante 20 min. Las diapositivas fueron incubadas con anticuerpos anti-COX-2 o VEGF o CD31 o Hur o CUGBP2 o AIT-1 o ciclina D1 durante la noche a 4 ° C. A continuación, los portaobjetos se trataron con el anticuerpo secundario, tal como HRP de cabra anti-conejo para la posterior COX-2, VEGF, Hur, CUGBP2, TIA-1, y la tinción de ciclina D1. Para CD31staining de cabra anti-rata se utilizó HRP. Cada anticuerpo secundario se incubó durante una hora y luego se desarrolló con DAB (Sigma Aldrich). Por último, las diapositivas se counterstained con hematoxilina.
El análisis estadístico
Todos los valores se expresan como la media ± SEM. Los datos se analizaron mediante una prueba t de 2 colas no apareada. Un
valor de P Red de menos de 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
Resultados
La curcumina inhibe el crecimiento de tumores de xenoinjertos tumorales y la angiogénesis Pan02
Para comenzar a evaluar el papel de la curcumina sobre la proliferación tumoral
in vivo
, hemos examinado la capacidad de la curcumina para suprimir el crecimiento de xenoinjertos de cáncer de páncreas células de ratón en ratones desnudos. xenoinjertos de tumores inducidos por células de cáncer pancreático se les permitió desarrollarse y crecer a un tamaño de 200 mm
3 curcumina tras lo cual se administró por vía intraperitoneal durante tres semanas todos los días. La curcumina inhibió significativamente el crecimiento de los xenoinjertos de tumor (Fig. 1A). Los tumores extirpados de los animales de control variaron de 700 a 800 mg, mientras que los tratados con curcumina pesaba menos de 400 mg (Fig. 1B). Además, el volumen del tumor se redujo significativamente (Fig. 1A). No hubo cambio aparente en el peso del hígado, peso del bazo, o el peso corporal en los animales (datos no mostrados). Estos datos implican que la curcumina es un agente terapéutico potente para el tratamiento de los cánceres de páncreas y es relativamente no tóxico para los ratones. También se determinó el efecto de la curcumina en la vascularización del tumor mediante la tinción para el antígeno específico de CD31 endotelial. Como se muestra en la Figura 1C, el tratamiento de cúrcuma redujo significativamente la tinción de CD31 y borra los vasos del tumor que sugieren disminuyeron la angiogénesis. También se calculó la densidad de microvasos y nos pareció que disminuyó significativamente después del tratamiento con curcumina (Fig. 1D). curcumina
(A) se administraron Los ratones desnudos que llevan xenoinjertos de tumores de células Pan02 en los flancos por vía intraperitoneal durante 3 semanas. Hubo una reducción significativa en el tamaño del tumor de los animales tratados con curcumina en comparación con controles no tratados (* p & lt; 0,05). (B) de tratamiento curcumina resultó en significativamente más bajo el peso del tumor en comparación con los controles (* P & lt; 0,05). (C) las secciones de los tumores se tiñeron para CD31, un marcador de superficie específico de las células endoteliales y con hematoxilina y eosina (H & amp; E). Una figura representativa se presenta mostrando una reducción significativa en los microvasos. (D) El número de microvasos en los tejidos tumorales se contaron en 12 campos de alta potencia y un promedio. Los datos muestran que la densidad de microvasos se redujo significativamente en los xenoinjertos de los animales tratados con curcumina (* p & lt; 0,05) guía empresas
La curcumina inhibe el crecimiento de células de cáncer de páncreas
Para determinar el mecanismo de curcumin-. mediada por la detención del crecimiento, se estudiaron las células de cáncer de páncreas
in vitro
. Para ello se utilizó cinco líneas de células cultivadas diferentes MiaPaCa-2, Panc-1, ASPC-1, BxPC-3 y Pan02. La curcumina suprimió significativamente la proliferación de líneas celulares de cáncer pancreático MiaPaCa-2, Pan02, AsPC-1, BxPC-3 y Panc-1 de una manera dependiente de la dosis y el tiempo. Este efecto anti-proliferación de las células tumorales fue visto dentro de un periodo de 24 h, y que siguió aumentando significativamente en los próximos 72 h (Fig. 2A). Para determinar el efecto a largo plazo del tratamiento de curcumina, las células se trataron con 30 micras curcumina durante 24 h, después de lo cual se dejó que las células de crecer en medios normal. tratamiento curcumina suprime la formación de colonias en todas las líneas celulares de cáncer de páncreas (Fig. 2B), lo que sugiere efectos de que la curcumina en las células tumorales era irreversible. Ciclina D1 es una proteína reguladora del ciclo celular que regula la G1 a la transición de la fase S del ciclo celular y funciona como un cofactor para varios factores de transcripción [33]. Ciclina D1 sobreexpresión se ha relacionado con el desarrollo y progresión del cáncer [34]. En ambas células MiaPaCa-2 y Pan02, el tratamiento de cúrcuma resultó en la reducción de expresión de ciclina D1 a las 24 h (Fig. 2C, D). Además, la ciclina A2, que regula la progresión S /G2, se downregulated potencialmente retardar la progresión de las células fuera de fase S (datos no mostrados).
(A) La curcumina inhibe la proliferación de células de cáncer pancreático. MiaPaCa-2, las células Pan02, AsPC-1 y BxPC-3 se incubaron con curcumina (1-50 mM) para un máximo de 72 h. La proliferación celular se analizó mediante actividad de la enzima hexosaminidasa. tratamiento curcumina resultó en una disminución de la dosis y dependiente del tiempo significativo en la proliferación celular en todas las células en comparación con controles no tratados. (B) La curcumina inhibe la formación de colonias. células MiaPaCa-2 y Pan02 se incubaron con 30 M de curcumina durante 24 h y se les permitió colonias para formar por incubación en medios regulares que contienen 10% de SFB durante un 10 d adicional. El tratamiento con la formación de colonias inhibido curcumina. Se muestra una representativos de tres experimentos independientes. (C) Expresión de la ciclina D1 se suprime en 24 h. ARN de las células MiaPaCa-2 y Pan02 incubadas con 30 mM curcumina se sometieron a PCR en tiempo real para la ciclina D1 expresión mRNA. Hubo una supresión significativa del ARNm a las 24 h pero no a las 12 h (* p & lt; 0,05). (D) Los lisados de MiaPaCa-2 o Pan02 incubó con 30 mM curcumina se analizaron por transferencia Western para los niveles de expresión de ciclina D1. el tratamiento de cúrcuma inhibe la ciclina D1 mRNA y proteína de expresión.
curcumina induce G2-M detención del ciclo celular antes de la catástrofe mitótica
A continuación se determinó si la curcumina afecta a la progresión del ciclo celular y la consecuencia de esto efecto. La curcumina inducida por la detención del crecimiento de la MiaPaCa-2 dentro de las 24 h en el G
Fase 2 M (Fig. 3A). Se observaron resultados similares en células Panc-1 y Pan02 (datos no mostrados). La curcumina se sabe que inducen apoptosis en una variedad de células cancerosas. La caspasa-3 y 7 son moléculas efectoras de llave conocidas para inducir la apoptosis en una variedad de células cancerosas mediante la amplificación de la señal de caspasas iniciadoras, tales como la caspasa 8 o caspasa 10 [35], [36]. Capsase 3 y 7 se incrementaron en 24 h en las células MiaPaCa-2 Línea tratados con curcumina lo que sugiere la inducción de la apoptosis (Fig. 3B). análisis de transferencia Western de lisados de células Pan02 MiaPaCa-2 y demostró un aumento significativo de la caspasa-3 activada en las células tratadas curcumina (Fig. 3B recuadro). Estos datos sugieren que las células tumorales tratadas curcumina fueron sometidos a apoptosis. Para determinar si una detención en la fase G2 o falta de progresión de la mitosis está contribuyendo al nivel más alto de células visto en G
2 M fase, se evaluó la expresión y localización de ciclina B1 y la serina /thereonine quinasa CDC 2. Ciclina B1 /CDC-2 complejo juega un papel significativo en el G
transición de fase 2 M de ciclo celular. Para inducir la mitosis, la ciclina B1 y Cdc-2 heterodimerizan y localizar en el núcleo, que a su vez activa las enzimas que regula la condensación de cromatina, la ruptura de la membrana nuclear y mitosis microtúbulos reorganización específica [37], [27]. El análisis inmunocitoquímico demostró significativamente más altos niveles nucleares de tanto la ciclina B1 y Cdc-2 en las células tratadas curcumina que sugieren que las células tratadas con la curcumina fueron sometidos a catástrofe mitótica (Fig. 3C). Además de esto, el análisis de transferencia Western demostró una mayor expresión tanto de la ciclina B1 y Cdc-2 en las células tratadas curcumina y la fosforilación de la quinasa Chk2 tanto en las células MiaPaCa-2 en cultivo y los tejidos de xenoinjerto de tumor Pan02 (Fig. 3D). Dado que las células fueron sometidas a la apoptosis, al mismo tiempo que estaban en detención en G2-M, sugiere que la curcumina induce a las células a someterse a la catástrofe mitótica.
perfiles de un ciclo celular) de células MiaPaCa-2 tratados con curcumina durante 12 h y 24 h y se determinaron por citometría de flujo usando tinción con yoduro de propidio para el contenido de ADN. el tratamiento de cúrcuma aumentó significativamente las células de la S y G
2 M fase del ciclo celular dentro de las 12 h. (B) el tratamiento curcumina induce la apoptosis. Se analizaron las células MiaPaCa-2 y Pan02 incubadas con 30 M de la curcumina para la apoptosis por la caspasa 3/7 activación. tratamiento de cúrcuma aumentó el número de células que experimentan apoptosis en comparación con los controles no tratados (* p & lt; 0,05). (Recuadro) La curcumina induce la caspasa 3, un mediador de la apoptosis. Los lisados de células MiaPaCa-2 o Pan02 incubadas con 30 micras curcumina se analizaron por transferencia de Western para la proteína caspasa 3. Las células tratadas curcumina muestra escindida (activado) caspasa 3, mientras que las células no tratadas no tienen exfoliados caspasa-3. (C) La curcumina tratamiento aumentó los niveles de ciclina B1, CDC-2 y fosforilada Chk2 quinasa de control. Los lisados de curcumina tratados MiaPaCa-2 células (izquierda) y xenoinjertos tumorales Pan02 (derecha) fueron analizados por Western Blot para fosfo Chk2, y ciclina B1 y CDC-2 niveles de expresión de proteínas. el tratamiento de cúrcuma fosforila quinasas de punto de control y aumento de los niveles de ciclina B1 y CDC-2 en ambos MiaPaCa-2 células y xenoinjertos de tumores Pan02. Resultados (D) de tratamiento de curcumina en la localización nuclear de ciclina B1 y CDC-2. La inmunocitoquímica de la curcumina tratada con MiaPaCa-2 células tanto el cyclinB1 y CDC-2 niveles de proteína fueron predominantemente en el núcleo en comparación a las células no tratadas. La fosforilación de Chk2, junto con el aumento de expresión y translocación nuclear de ciclina B1 y CDC-2 demuestra la progresión mitótico de las células.
La curcumina inhibe la expresión de COX-2 y VEGF mientras que induce CUGBP2 y AIT-1
COX-2 juega un papel importante en la carcinogénesis, incluyendo el aumento de la invasividad, la promoción de la angiogénesis y la resistencia a la apoptosis [38]. Por lo tanto, se determinó su expresión en xenoinjertos tumorales. Los análisis de PCR en tiempo real demostró que la COX-2 expresión mRNA fue significativamente menor en tratados curcumina xenoinjertos de tumores en comparación con los tumores de control (Fig. 4A). Esto se confirmó además mediante transferencia Western e inmunohistoquímica análisis, donde se observaron niveles más bajos de proteína COX-2 en los tejidos tratados con curcumina (Fig. 4B, C). Las prostaglandinas y los otros promotores de tumores se sabe que inducen la expresión de VEGF en las células epiteliales que promueve la angiogénesis y por lo tanto el crecimiento del tumor [39]. VEGF mRNA y expresión de la proteína se analizó y también se encontró que era significativamente menor en los tratados con curcumina xenoinjertos de tumores en comparación con los tumores de control (Fig. 4A, B). La inmunohistoquímica demostró también que el tratamiento de cúrcuma redujo significativamente la tinción de VEGF en comparación con el control del tumor (Fig. 4C). Ciclina D1 es una proteína reguladora del ciclo celular que regula la G1 a la transición de la fase S y funciona como un cofactor para varios factores de transcripción [40]. Ciclina D1 sobreexpresión también se ha relacionado con el desarrollo y progresión del cáncer [34]. expresión de ciclina D1 inhibe el tratamiento de cúrcuma en los xenoinjertos de tumor que sugieren que inhibe la proliferación de células cancerosas (Fig. 4A, B). Un número de proteínas de unión a ARN se han identificado para reconocer secuencias se contienen y regular la estabilidad del mRNA. Los miembros de la CELF (CUGBP2) y familia ELAV (Hur) de las proteínas de unión de ARN están implicadas en varios procesos celulares, incluyendo mRNA de empalme, la edición, la estabilidad y la traducción [23], [41]. Hemos demostrado previamente que CUGBP2 se induce en las células sometidas a apoptosis y funciones para inhibir la COX-2 la traducción del ARNm [28], [42]. T-por células restringido intracelular de antígeno-1 (TIA-1) es también una proteína de unión de ARN que funciona como un supresor de la traducción, especialmente bajo condiciones de estrés [43]. Aquí se observó que el tratamiento de cúrcuma resultó en un aumento significativo tanto en CUGBP2 y TIA 1-mRNA y expresión de proteínas en los xenoinjertos de tumor (Fig. 4A, B, D). Por otra parte, no hubo ningún cambio significativo observado en ambos niveles de mRNA Hur y proteínas en respuesta a la curcumina (Fig. 3A, B, D).
(A) ARN total de xenoinjertos de tumores fueron sometidos a Pan02 PCR en tiempo real. tratamiento curcumina como resultado reduce los niveles de ciclina D1 mRNA de COX-2, VEGF y, en comparación con los controles. Por otra parte, se aumentó CUGBP2 y TIA-1 la expresión de ARNm (* p & lt; 0,05). Los datos son un promedio de xenoinjertos de 5 ratones. (B) Análisis de transferencia Western demostró que los lisados de tejido de los animales tratados con curcumina tienen niveles significativamente más bajos de proteínas de ciclina D1 COX-2, VEGF, y, pero aumentó los niveles de CUGBP2 y proteínas TIA-1. (C) La inmunohistoquímica demuestra que el tratamiento curcumina redujo significativamente la expresión de COX-2 y VEGF. (D) La inmunohistoquímica demuestra una mayor expresión de CUGBP2 y AIT-1 en los xenoinjertos tumorales.
La curcumina inhibe la traducción de la COX-2 y el ARNm de VEGF en las células de cáncer de páncreas
Los estudios anteriores han demostrado aumento de los niveles de la COX-2 mRNA y expresión de proteínas en los adenocarcinomas de páncreas [38]. Por lo tanto, próximos a determinar los efectos del tratamiento sobre la curcumina expresión COX-2. el tratamiento de cúrcuma aumentó significativamente los niveles de ARNm de la COX-2 en MiaPaCa-2 células (Fig. 5A). Sin embargo, hubo una reducción significativa en los niveles de proteína de la COX-2 (Fig. 5B). Se observaron resultados similares en células Pan02 (datos no mostrados). También se determinó el efecto de la curcumina sobre la expresión génica de VEGF en las células. tratamiento de cúrcuma aumentó significativamente VEGF mRNA mientras que inhibe los niveles de proteína en MiaPaCa-2 células (Fig. 5A, B). Se observaron resultados similares en células Pan02 (datos no mostrados). Por otro lado, la curcumina aumentó significativamente tanto la expresión CUGBP2 y TIA 1-mRNA y de la proteína (Fig. 5A, B). Sin embargo, no hubo ningún cambio significativo observado con la expresión Hur (Fig. 5A, B). En estudios previos, se ha demostrado que se une a CUGBP2 COX-2 3'UTR para inhibir su traducción [28]. Dado que los niveles de mRNA de COX-2 son más altas, pero los niveles de proteína son más bajos en la respuesta al tratamiento curcumina, se determinó si la curcumina aumenta la unión de CUGBP2 para COX-2 mRNA. La inmunoprecipitación acoplado RT-PCR demostró que había un nivel más alto de unión a CUGBP2 COX-2 y el ARNm de VEGF en comparación con el control, las células no tratadas (Fig. 5C). Además, actinomicina D experimentos demostraron que el tratamiento curcumina resultó en niveles significativamente más altos de COX-2 la estabilidad del mRNA, la vida media de aumento de 30 min en las células no tratadas a ~ 8 h (Fig. 5D). Se observaron resultados similares con VEGF; la vida media del ARNm de VEGF también aumentó de 30 min a & gt; (Fig. 5D). 8 h en las células tratadas curcumina
la expresión de ARNm
(A). MiaPaCa-2 células fueron tratados con curcumina durante 2 h. tratamiento de cúrcuma aumentó los niveles de COX-2, VEGF, CUGBP2 y TIA-1 mRNA. No hubo ningún cambio significativo de la expresión de mRNA Hur (* p & lt; 0,05). Los datos de tres experimentos independientes. (B) Western blot análisis demuestran que los lisados con curcumina tratada MiaPaCa-2 células tienen menores niveles de COX-2 y las proteínas VEGF y los niveles crecientes de CUGBP2 y TIA-1. Representativos de tres experimentos independientes. (C) (panel izquierdo), aumento de la unión de la unión a CUGBP2 COX-2 o ARNm de VEGF después del tratamiento curcumina. extracto de células enteras (T) a partir de células tratadas con la curcumina se inmunoprecipitaron con anticuerpo anti-CUGBP2, y el ARN de los inmunoprecipitados (P) y se aislaron sobrenadante (S) y se sometió a RT-PCR para la COX-2 y el ARNm de VEGF. Datos demuestra el aumento de la COX-2 o ARNm de VEGF en el sedimento de células curcumina tratada. (Panel derecho) de datos se cuantificó y hubo un claro aumento de la COX-2 y el ARNm de VEGF en el sedimento de células tratadas con la curcumina. MiaPaCa-2 células (D) fueron tratados con curcumina durante 2 h y la estabilidad de la COX-2 y el ARNm de VEGF se determinaron después de la adición de actinomicina D (concentración final: 10 mg /ml). La curcumina aumenta la vida media de la COX-2 mRNA de 30 min a 8 h. Del mismo modo, la curcumina aumenta la vida media del ARNm de VEGF de 30 min a 8 h. Los datos demuestran el tratamiento de cúrcuma aumentado significativamente la estabilidad del ARNm de la COX-2 o VEGF.
mediada curcumina estabilidad de la COX-2 y VEGF mRNA requiere CUGBP2
Hemos demostrado previamente que CUGBP2 unión a la COX -2 3'UTR aumenta la estabilidad de la COX-2 mRNA, mientras que la inhibición de su traducción [28]. por lo tanto, se determinó el efecto de CUGBP2 caída en la supresión de traducción curcumina mediada por la COX-2 y el ARNm de VEGF. mediciones de PCR en tiempo real demostraron que el tratamiento curcumina resultó en niveles significativamente más altos de COX-2 y VEGF mRNA, que se redujo a controlar los niveles de expresión cuando se CUGBP2 desmontables (Fig. 6A). Se determinó a continuación si había algún efecto sobre la expresión de la proteína. tratamiento curcumina disminuyó significativamente los niveles tanto de la proteína COX-2 y VEGF. Sin embargo, cuando CUGBP2 fue derribado con un siRNA específico, la COX-2 y proteínas de VEGF niveles no fueron afectados por el tratamiento curcumina (Fig. 6B). También se determinó si los efectos de la curcumina mediada sobre COX-2 y VEGF mRNA estabilidad se ven afectados por CUGBP2 caída. Mientras que el tratamiento de curcumina aumenta la estabilidad del ARNm de la COX-2 y VEGF, se produjo un efecto menor cuando CUGBP2 también fue derribado mediante siRNA. La vida media de la COX-2 mRNA se incrementó de 30 min a ~ 8 h después del tratamiento curcumina, que se redujo a ~ 2 h cuando la expresión CUGBP2 se inhibió (Fig. 6C). Se obtuvieron resultados similares para VEGF donde desmontables de CUGBP2 reduce la estabilidad curcumina mediada a partir de 8 h a 1 h (Fig. 6C). Estos datos sugieren que el aumento mediado por la curcumina en la estabilidad del ARNm de la COX-2 y VEGF se produce en parte a través CUGBP2.
(A) CUGBP2 es necesario que los niveles de COX-2 y de ARNm de VEGF curcumina inducida.