Extracto
Rabex-5, un factor de intercambio de nucleótidos de guanina (GEF) para el RAB-5, está implicada en la tumorigénesis y en el desarrollo de ciertos cánceres humanos. En este caso, nos informan de que Rabex-5 promueve el crecimiento del tumor y la capacidad metastásica de las células de cáncer gástrico tanto
in vitro
y
in vivo
. Expresión de Rabex-5 es significativamente mayor en los tejidos de cáncer gástrico y se asocia con el tamaño del tumor y la metástasis de los ganglios linfáticos. Además, el silenciamiento de la reducción de Rabex-5 proliferación de células de cáncer gástrico y la formación de colonias
in vitro
dirigida a través de la inducción de una fase de la detención G0 /G1, y estimuló la apoptosis de células de cáncer gástrico. Desmontables de Rabex-5 también inhibe la cicatrización de heridas, la migración y la capacidad invasiva de las células de cáncer gástrico. Los resultados de
in vivo
experimentos con animales también fueron consistentes con estos
in vitro
hallazgos en. El silenciamiento de Rabex-5 condujo a una disminución de la expresión de VEGF. Estos resultados indican que Rabex-5 es upregulated y juega un papel oncogénico en el desarrollo del cáncer gástrico mediante la activación de la vía de señalización de VEGF
Visto:. Wang S, Lu A, Chen X, Wei L, Ding J (2014) Rabex-5 se regula positivamente y juega un papel oncogénico en el desarrollo del cáncer gástrico mediante la activación de la vía de señalización VEGF. PLoS ONE 9 (11): e113891. doi: 10.1371 /journal.pone.0113891
Editor: Xin-Yuan Guan, la Universidad de Hong Kong, China
Recibido: 3 de septiembre de 2014; Aceptado: 31 Octubre 2014; Publicado: 26 Noviembre 2014
Derechos de Autor © 2014 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Estos autores no tienen ningún soporte o financiación reportar
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia.
Introducción
a pesar de una disminución en la incidencia global en ciertas regiones del mundo, el cáncer gástrico sigue siendo la cuarta más alta de incidencia y el segundo en mortalidad entre todos los tipos de cáncer en todo el mundo [1]. Los estudios indican que los factores ambientales, tales como
Helicobacter pylori
la infección, el tabaquismo y la dieta, pueden desempeñar un papel importante en el desarrollo del cáncer gástrico [2]. cáncer gástrico en etapa inicial suele ser asintomática o con síntomas no específicos asociados, tales como dispepsia, y para cuando se presentan los síntomas, a menudo ha alcanzado una etapa avanzada. A pesar del uso común de la terapia multimodal (quimioterapia, radioterapia y cirugía), la supervivencia a los 5 años de los pacientes sigue siendo baja, a 20-40% [3]. Aunque la investigación en cáncer gástrico ha hecho grandes progresos, los mecanismos moleculares que subyacen al desarrollo de cáncer gástrico aún no se entienden.
La exocitosis y endocitosis son procesos clave utilizados por las células para mantener la función fisiológica normal, y el transporte de vesículas es un núcleo parte de este proceso. Pequeñas GTPasas desempeñan una función de conmutación en las moléculas intracelulares y un papel muy importante en la endocitosis y el transporte de vesículas, incluyendo la regulación del crecimiento celular, la transducción de señales, la construcción de la diferenciación y del citoesqueleto de actina y muchos aspectos de los otros procesos celulares [4]. En la superfamilia Ras, hay más de 50 tipos de GTPasas, incluyendo Rab, que pertenece a la subfamilia más grande [5]. Los estudios han demostrado que la mayoría de las proteínas Rab regular la orientación de transporte, la fagocitosis, y acoplamiento de vesículas de membranas específicas, mientras que un pequeño número de proteínas Rab regular la gemación de vesículas [6], [7]. La pequeña GTPasa RAB-5, que se distribuye en la membrana plasmática y los endosomas tempranos, es un regulador maestro de tráfico endocítica temprana [8]. Al igual que otras pequeñas GTPasas, RAB-5 se activa mediante un intercambio de GDP unido a GTP, catalizada por una familia de factores de intercambio de nucleótidos de guanina [9]. Rabex-5 fue identificado como un interactor de Rabaptin-5 y posee actividad GEF hacia RAB-5 y GTPasas relacionadas. Del mismo modo, tanto Rabex-5 y Rabaptin-5 son necesarias para la fusión endosoma RAB-5-driven
in vitro
[10].
Los estudios recientes han indicado que Rabex-5 de expresión es significativamente mayor en varios tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de mama [11], el cáncer de próstata [12] y el cáncer colorrectal [13]. Anormal expresión Rabex-5 en los tumores sugiere que Rabex-5 es significativo en la patogénesis y progresión del cáncer, y puede influir en el comportamiento biológico del tumor. Sin embargo, el papel y el mecanismo de acción de Rabex-5 en la carcinogénesis y la progresión del cáncer gástrico todavía no se han determinado. En este estudio, se analizaron primera expresión de Rabex-5 en tejidos de cáncer gástrico mediante la reacción inversa cuantitativa en cadena de la polimerasa (QRT-PCR) e inmunohistoquímica. Posteriormente, se examinaron los efectos de Rabex-5 en la función biológica del tumor
in vitro
y
in vivo
. Nuestros resultados demuestran que Rabex-5 se sobreexpresa y juega un papel oncogénico en el cáncer gástrico.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
Todos los experimentos con animales descritos en este estudio fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado de animales y el empleo (IACUC) de la Universidad médica de Taishan y todos los animales fueron mantenidos de acuerdo con las directrices del IACUC. La recopilación y uso de muestras humanas fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad Médica de Taishan y el afiliado Centro Médico del Hospital Central de Taian, tras el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes.
Pacientes y muestras de tejidos
Un total de 110 conjuntos de tumores gástricos y los tejidos adyacentes, no tumorales (por lo menos 5 cm del margen del tumor) se obtuvieron de los pacientes que se sometieron a cirugía curativa en el hospital central de Tai entre enero de 2010 y diciembre de 2013. Estos incluyeron 27 mujeres y 83 hombres, con una edad media de 59,3 años (rango: 32-80 años). Ninguno de los pacientes habían recibido radioterapia o quimioterapia antes de la cirugía. Se recogieron los datos clínico-patológica y la estadificación del tumor se determinó de acuerdo con el Comité Americano Conjunto sobre el Cáncer (AJCC) sistema de estadificación TNM del cáncer gástrico. clasificación histológica se realizó al menos por dos patólogos expertos, que trabajan de forma independiente en un diseño doble ciego. El estudio fue aprobado por las Juntas de Revisión Institucional de la Universidad de Medicina de Taishan y el afiliado Hospital Medical Center Taian central. escrito el consentimiento informado se obtuvo de cada paciente antes de la inscripción en el estudio.
Líneas celulares y condiciones de cultivo
líneas celulares de cáncer gástrico humano y el gástrico, inmortalizado línea celular epitelial de la mucosa, GES-1 , fueron adquiridos de los Shanghai Institutos de Ciencias Biológicas, la Academia china de Ciencias. Las líneas celulares se mantuvieron rutinariamente en medio RPMI-1640 que contenía 10% de suero bovino, penicilina (100 UI /ml) y estreptomicina (100 IU /ml) en un CO 5%
2 atmósfera a 37 ° C.
aislamiento de ARN total y QRT-PCR
ARN total fue extraído de muestras de tejidos o líneas de células usando el reactivo Trizol (Invitrogen, EE.UU.), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La transcripción inversa se realizó con 1 ug de ARN total de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega, Madison, WI, EE.UU.). PCR se realizó utilizando SYBR Green reactivo (Applied Biosystems, CA, EE.UU.) y los siguientes cebadores de PCR;
Rabex-5 gratis (hacia adelante) 5'-TTGGACAGATGGAATTGCAA-3 'y (inverso) 5'-GTTGCAGTGGTGGAGGAAGT-3';
VEGF gratis (hacia adelante) 5'-CTGTACCTCCACCATGCCAAGT-3 'y (inverso) 5'-CTTCGCTGGTAGACATCCATGA-3' y
GAPDH gratis (hacia adelante) 5'-GGACCTGACCTGCCGTCTAG-3 'y (hacia atrás) 5'-GTAGCCCAGGATGCCCTTGA-3 '. Las reacciones de PCR se realizaron con una desnaturalización inicial a 95 ° C durante 2 min, seguido de 30 ciclos de 94 ° C durante 30 s, 55 ° C durante 30 s y 72 ° C durante 30 s, con una extensión final a 72 ° C por 10 min.
GAPDH
se utilizó como control interno y todas las reacciones se realizaron por triplicado. Los coeficientes de la expresión relativa de
Rabex-5
en cada tumor se combina con muestra de tejido no tumoral se calcularon utilizando la 2
-ΔΔCt método.
La inmunohistoquímica
Parafina secciones de tejido -embedded de pacientes o ratones desnudos fueron tratadas con calor a 60 ° C durante 1 h, desparafinado en xileno, re-hidratado en una serie de etanol (100 a 50%) y se trató en 0.01 mol /L de tampón de citrato (pH 6,0 ) para la recuperación de antígenos. La actividad peroxidasa endógena fue inhibida después de la incubación con metanol que contiene 0,3% de H
2O
2 para 30 min. Las secciones fueron incubadas con anticuerpos de detección Rabex-5 (1:50, Santa Cruz Biotechnology, EE.UU.) o VEGF (1:150; Ab46154, Abcam, EE.UU.) a 4 ° C durante la noche. El siguiente procedimiento experimental se incubó con el anticuerpo secundario. Las secciones de tejido se contratiñeron con hematoxilina de Mayer. Las láminas fueron evaluados de forma independiente por dos patólogos, cegados a los datos del paciente. La intensidad de la tinción para Rabex-5 se puntuó como 0 (sin tinción), 1 (tinción leve), 2 (tinción moderada) o 3 (tinción intensa). área de tinción se puntuó como 0 (0%), 1 (1-25%), 2 (26 a 50%), 3 (51-75%) o 4 (76-100%), sobre la base del porcentaje de Las células teñidas positivamente. La puntuación de tinción final, calculado como la suma de las puntuaciones de intensidad y extensión, se dividió en tres grupos de la siguiente manera: 0-2, expresión negativa; 3-4, la debilidad de expresión; y 5-6, la expresión fuerte.
silenciamiento selectiva de Rabex-5
El Rabex 5-vector lentiviral interferencia fue adquirido de Shanghai GenePharma Co., Ltd. La secuencia del Rabex-5 interferencias oligo orientación era 5'-GGATGCAAACTCGTGGGAA-3 ', mientras que la secuencia de control no homóloga era 5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'. células SGC-7901 y NCI-N87 se sembraron en placas de 6 pocillos (5 x 10
4 células /pocillo), que se cultiva el 40% de confluencia y tratados con sobrenadante viral se titularon a una multiplicidad de infección (MOI) de 10.
El análisis de transferencia
proteínas de células enteras occidentales se extrajeron de las células utilizando tampón RIPA que contiene inhibidor de la proteasa Cocktail (Pierce, Rockford, IL, EE.UU.). La proteína se cuantificó usando un kit de ensayo de proteínas BCA (Pierce). Los extractos celulares (100 ug) se separaron por electroforesis en gel de poliacrilamida dodecil sulfato de sodio al 10%, y se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno. Las membranas se bloquearon con leche no grasa al 5% en solución salina tamponada con Tris (TBS) y se incubaron con anticuerpos primarios a 4 ° C durante la noche. Los anticuerpos primarios utilizados fueron conejo anti-Rabex-5 (1:200; Santa Cruz Biotechnology), de conejo anti-GAPDH (1:5000; Ab9485, Abcam) y el ratón anti-VEGF (1:300; Ab46154, Abcam). Las membranas se lavaron a continuación tres veces en solución de TBS-Tween durante 15 min, y se incubaron con anticuerpos secundarios. Se detectaron señales utilizando un sistema de detección de quimioluminiscencia (Amersham Bioscience, Piscataway, NJ, EE.UU.), de acuerdo con el protocolo del fabricante.
La proliferación celular ensayo
La proliferación celular se midió utilizando un kit Cell Counting -8 (CCK-8; Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japón). células SGC-7901 o NCI-N87 fueron sembradas en placas de 96 pocillos (1,5 x 10
3 células /pocillo) y se incubaron durante diversos puntos de tiempo (24, 48, 72, 96 y 120 h). a continuación, el medio de crecimiento fue retirado y reemplazado con 200 l de medio RPMI-1640 que contiene 10% de FBS y 20 l de CCK-8 y las placas se incubaron a 37 ° C durante 3 h. Se midió la absorbancia a 450 nm usando un lector de microplacas Safire2. medio RPMI-1640 que contiene 10% de FBS y CCK-8 se utilizó como control.
Colonia ensayo de formación de
Las células se sembraron en placas de 6 pocillos (1 x 10
3 células /pocillo) y medio de cultivo se sustituyó cada 3-4 días. Después de 14 días de cultivo, las colonias de células fueron fijadas con paraformaldehído al 4% durante 10 minutos, se tiñeron con cristal violeta al 0,1% durante 20 min, y se fotografiaron. Las colonias con más de 50 células se contaron en cada tablero.
Análisis del ciclo celular y la apoptosis
SGC-7901 /KD, las células NCI-N87 /KD y control de las células se recogieron y el ciclo celular y la apoptosis se evaluó por citometría de flujo. Para el análisis del ciclo celular, las células se fijaron con 75% de etanol y se almacenaron a 4 ° C durante la noche. El día siguiente, las células fijadas se lavaron con PBS, se trataron con RNasa A (50 mg /ml) y se tiñeron con yoduro de propidio (PI) (50 mg /ml) durante 30 min en la oscuridad. Las células teñidas se analizaron por citometría de flujo (FACSCalibur, Becton-Dickinson).
Para el análisis de apoptosis, una V-APC Kit Anexina Apoptosis Detección I (BD Pharmingen, EE.UU.) se utilizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. PI y Anexina V-APC doble tinción se realizó y las células se analizaron por citometría de flujo (FACSCalibur, Becton-Dickinson), utilizando el software Cell Quest (Becton-Dickinson). células V-APC-positivos y negativos PI-Anexina se definieron como la apoptosis. Todos los experimentos se realizaron por triplicado y se calcularon los valores medios de estos grupos.
la migración y la invasión Transwell ensayo
Para los ensayos de migración, 1 × 10
5 células se suspendieron en suero libre de medio RPMI-1640 y se colocaron en cámaras que no fueron recubiertas con Matrigel (Corning Costar, NY, EE.UU.). Para el ensayo de invasión, la cámara superior se recubrió previamente con Matrigel (BD Bioscience, CA, EE.UU.) de acuerdo con los protocolos del fabricante, y 1 × 10
se añadieron a la cámara de 5 células en medio RPMI-1640 sin suero. Para ambos ensayos, se añadió medio que contenía 10% de FBS a la cámara inferior como un quimioatrayente. Después de 24 h de cultivo, las cámaras se tiñeron con solución de cristal violeta 0,5% para 15 min, y se sumergieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 10 min. Las células en la cámara inferior se contaron posteriormente bajo un microscopio invertido. Los valores se expresan como media del número de células en cinco campos aleatorios de vista (200 ×).
cicatrización de heridas ensayo
Las células fueron sembradas en placas de 6 pocillos y se cultivaron hasta que alcanzaron la confluencia. Las heridas fueron rayados en la monocapa de células utilizando puntas de pipeta de 20 mL. Las placas se lavaron una vez con medio fresco para eliminar las células no adherentes después del cultivo de las células durante 0 o 48 h (medio sin suero de ternero), y se fotografiaron.
modelo de xenoinjerto
Cuatro de semana viejo macho BALB /C ratones desnudos fueron adquiridos por el Instituto de Zoología de la Academia china de Ciencias de Shanghai. Los animales fueron alojados en jaulas con ropa de cama de virutas de madera en una habitación con temperatura controlada (68-72 ° F) con un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas y 45-55% de humedad relativa, y se les permitió el acceso libre a la dieta y el agua potable. Brevemente, SGC-7901 /KD o células /NC SGC-7901 se trataron con tripsina y se resuspendieron en PBS (pH 7,4) para la inyección en un ratón, en un volumen total de 100 ul. La suspensión de células (1 x 10
6 células) se inyectó en el flanco derecho de los ratones. El tamaño del tumor se midió externamente cada 3 días usando un calibre, y el volumen del tumor se calculó utilizando la ecuación: longitud (mm) x anchura
2 (mm) x 0,52. Para aliviar el sufrimiento de los ratones observados durante estos estudios experimentales, los ratones fueron sacrificados por CO
2 de inhalación en el día 28 después de la inyección intraperitoneal, y los tumores se pesaron después de la disección. Las muestras se almacenaron en nitrógeno líquido para QRT-PCR o se fijaron en formalina al 4% para obtener las secciones embebidas en parafina. Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con el Cuidado y Uso de Animales directrices aprobadas por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de Medicina de Taishan.
El análisis estadístico
Los datos se representan como la media ± desviación estándar (SD). Las diferencias estadísticas entre los dos grupos fueron examinados por el estudiante de
t-test
. Las correlaciones entre Rabex-5 de expresión en tejidos de cáncer gástrico y parámetros clínico se analizaron mediante chi-cuadrado o la prueba exacta de Fisher.
P Hotel & lt; 0,05 fue considerado significativo, y
P Hotel & lt; 0,01 se consideró altamente significativa
Resultados
expresión Rabex-5 está regulada positivamente en. tejidos de cáncer gástrico
La expresión de
Rabex-5
se examinó en el cáncer gástrico y los tejidos no tumorales adyacentes mediante qRT-PCR. Hemos observado significativamente mayor expresión de
Rabex-5
mRNA en tejidos de cáncer gástrico en comparación con los tejidos no tumorales correspondiente (
P
. & Lt; 0,01, Fig 1A). Estos resultados fueron confirmados a nivel de proteínas por tinción inmunohistoquímica (Fig. 1B, C, D, E). Rabex-5 de expresión se localiza predominantemente en el citoplasma de las células cancerosas. Rabex-5 se reguló en el 61,8% (68/110) de los pacientes con cáncer gástrico. A continuación se investigó la relación entre Rabex-5 de expresión y las características clínico-patológicas de cáncer gástrico. La regulación positiva de Rabex-5 se asoció con el tamaño del tumor (
P
= 0,035) y la metástasis de los ganglios linfáticos (
P
= 0,006), pero no con otros factores clínico-patológicos, como el sexo, la edad o la localización del tumor (Tabla 1).
(a)
expresión mRNA Rabex-5
en tejidos de cáncer gástrico y los tejidos no tumorales adyacentes apareados se examinó por reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa (QRT-PCR ) y normalizado a
GAPDH
. Las barras representan los medios de
Rabex-5
expresión relativa en tejidos de cáncer y tejidos no tumorales, respectivamente. (B-E) Caracterización de Rabex-5 la expresión de proteínas en tejidos de cáncer gástrico humano y los tejidos no tumorales adyacentes apareados por tinción inmunohistoquímica. (B) positivo Rabex-5 Fuerte expresión en el cáncer gástrico. (C) positivo Rabex-5 débil expresión en el cáncer gástrico. (D) Negativo expresión Rabex-5 en el cáncer gástrico. (E) Negativo Rabex-5 de expresión en la mucosa gástrica no tumoral.
regulación a la baja de Rabex-5 inhibe la proliferación de células de cáncer gástrico y la formación de colonias
A continuación se investigó la expresión de Rabex-5 en líneas de células gástricas y la línea de célula no cancerosa, GES-1, por Western blot. Rabex-5 se expresó en todas las líneas celulares ensayadas, y era especialmente alta en SGC-7901 y las células NCI-N87 (Fig. 2A). Para explorar las funciones de Rabex-5 en líneas celulares de cáncer gástrico, se realizó apuntamos desmontables de Rabex-5 en las líneas celulares que expresan altos, SGC-7901 y NCI-N87. Rabex-5 expresión se redujo significativamente en las células SGC-7901 /KD y NCI-N87 /KD en comparación con células de control (Fig. 2B). En primer lugar, se examinó el efecto de la pérdida de Rabex-5 sobre el crecimiento de células de cáncer gástrico. Después de 5 días de cultivo, la tasa de crecimiento del SGC-7901 /KD y las células NCI-N87 /KD fue significativamente más lento que los grupos de control (Fig. 2C). También confirmó estas observaciones en los ensayos de formación de colonias. número de colonias se redujeron significativamente en células SGC-7901 /KD y células NCI-N87 /KD comparación con las células de control (Fig. 2D), y se observó que el tamaño de colonia fue también menor en los grupos experimentales en comparación con los controles. Estos datos sugieren que la regulación por disminución de Rabex-5 suprime la proliferación de células de cáncer gástrico.
(A) análisis de transferencia de Western de Rabex-5 expresión de proteínas en siete líneas celulares de cáncer gástrico y GES-1. (B) los niveles de proteína Rabex-5 en SGC-7901 /KD, SGC-7901 /NC, NCI-N87 /KD y las células NCI-N87 /NC se analizaron por Western blot. (C) CCK-8 para el ensayo de proliferación celular SGC-7901 /KD, NCI-N87 /KD y los grupos de control. Curvas indican un nivel significativo de la proliferación en comparación con los controles (
P
& lt; 0,05). (D) Imágenes representativas y cuantificación de los ensayos de formación de colonias en cada línea celular. *
P Hotel & lt; 0,05; **
P
. & Lt; 0,01
regulación a la baja de Rabex-5 promueve la apoptosis de las células de cáncer gástrico e induce la detención del ciclo celular G0 /G1
Los efectos observados de Rabex-5 caída en el crecimiento celular puede ser debido a cambios en la progresión del ciclo celular y la apoptosis. Por lo tanto, hemos examinado los efectos de silenciamiento Rabex-5 sobre el ciclo celular y la apoptosis
in vitro
, mediante citometría de flujo. análisis de citometría de flujo reveló que la proporción de células en la fase G0 /G1 en SGC-7901 /KD o células NCI-N87 /KD fue mayor que en SGC-7901 /NC o grupos de control /NC NCI-N87, mientras que el porcentaje de las células en la fase G2 /M se redujo significativamente en comparación con los controles (Fig. 3A, B). También se observó efecto significativo sobre la apoptosis en los grupos tratados de forma diferente (Fig. 3C, D), con regulación a la baja de Rabex-5 expresión que conduce a un aumento de la apoptosis de células de cáncer gástrico.
Proporción
(A) de las células en diversas fases del ciclo celular. (B) Histogramas representativos que muestran perfiles del ciclo celular de SGC-7901 /KD, SGC-7901 /CN, NCI-N87 /KD y las células NCI-N87 /NC. (C) fueron consideradas células con tinción positiva para anexina V-APC y negativo para yoduro de propidio (PI) para tener apoptosis experimentado. (D) Histogramas representativos que representa la apoptosis de cada grupo de células de cáncer gástrico. *
P Hotel & lt; 0,05; **
P
. & Lt; 0,01
regulación a la baja de Rabex-5 inhibe la migración, la invasión y la capacidad de curación de heridas de células de cáncer gástrico
Para investigar la influencia de Rabex-5 sobre la migración y la invasión, a continuación realizó transwell ensayos de migración e invasión. Regulación a la baja de Rabex-5 migración celular suprimida (SGC 7901-grupo /KD, 121,3 ± 6,1 células /campo; SGC-7901 /grupo de Carolina del Norte, 261,0 ± 10,5 células /campo; NCI-N87 grupo /KD, 108,7 ± 6,1 células /campo ; NCI-N87 /grupo de Carolina del Norte, 241,7 ± 10,6 células /campo;
P
. & lt; 0,05) (figura 4A, C). Resultados similares se observaron en transwell ensayos de invasión (SGC 7901-grupo /KD, 76,3 ± 6,1 células /campo; SGC 7901-grupo /NC, 108,7 ± 6,0 células /campo; grupo NCI-N87 /KD, de 60,7 ± 6,0 células /campo ; grupo NCI-N87 /NC, 119,0 ± 8,5 células /campo;
P Hotel & lt;.. 0,05) (figura 4B, D)
(A, B) Transwell ensayos. Fotografías que muestran las células después de la migración a través de membranas de microporos con o sin Matrigel. (C, D) Histogramas que muestran los números de la migración y la invasión de las células. (E) Ensayo de la curación de heridas con células de cáncer gástrico. Las imágenes fueron tomadas 0 y 48 h después de rayar la superficie de la célula. Se muestra una imagen representativa de tres experimentos independientes. (F)
VEGF
expresión del ARNm se evaluó mediante qRT-PCR. (G) expresión de la proteína VEGF se evaluó mediante Western blot. *
P Hotel & lt; 0,05; **
P
. & Lt; 0,01
Para investigar el efecto de Rabex-5 sobre la motilidad y la cicatrización de heridas, también se realizaron ensayos de curación de heridas. Hemos observado que la distancia entre bordes de la herida de SGC-7901 /KD y las células NCI-N87 /KD era marcadamente más largos que los de SGC-7901 /NC o células NCI-N87 /NC (Fig. 4E). De acuerdo con estas observaciones, los niveles de VEGF fueron regulados a la baja en los niveles de ARNm y proteínas en las células KD (Fig. 4 F, G).
El silenciamiento de Rabex-5 inhibe el crecimiento del cáncer gástrico
in vivo
sobre la base de la
in vitro
hallazgos descritos anteriormente, se examinó el efecto de silenciamiento Rabex-5 sobre el crecimiento tumoral
in vivo mediante la inyección de
SGC7901 /o KD SGC7901 /NC células por vía subcutánea en las regiones flanco derecho de ratones desnudos. El tamaño del tumor se monitorizó cada 3 días con un calibre. El volumen del tumor se redujo significativamente en los ratones 2 semanas después de la inyección de las células SGC-7901 /KD en comparación con células de control (
P
& lt; 0.05; Fig. 5A). El volumen de los tumores de xenoinjertos de derivado del grupo SGC-7901 /KD era comparable a la del grupo /NC SGC-7901, que exhibe una marcada disminución en el volumen del tumor de 4 semanas después de la inoculación de células tumorales (
P
& lt; 0,05, Fig. 5B, C). Además, el peso de los tumores derivados de células SGC-7901 /KD fue significativamente menor que la de los controles (
P
& lt; 0.05; Fig. 5D). A continuación examinó la expresión de VEGF en las muestras tumorales trasplante de QRT-PCR e inmunohistoquímica. Como se muestra en la Fig. 5E y 5F, los niveles de VEGF ARNm y proteínas se disminuyeron en el grupo SGC-7901 /KD en comparación con SGC-7901 de control /NC. Estos
in vivo
datos son consistentes con nuestros
in vitro
observaciones en y confirman que el silenciamiento de Rabex-5 inhibe el crecimiento del cáncer gástrico y la progresión de la modulación de la actividad transcripcional de VEGF. En resumen, Rabex-5 desempeña un papel oncogénico en el cáncer gástrico.
volúmenes de los tumores (A) se midieron a diferentes puntos de tiempo en ratones inoculados con células SGC-7901 infectadas con Rabex-5 knockdown vector lentiviral (SGC- 7901 células /KD). (B) Los tumores recogidos de ratones 4 semanas después de la inyección con SGC-7901 /KD células (C) Los volúmenes tumorales individuales para cada ratón después de la disección. (D) El peso final del tumor se midió al final del experimento. (E) Expresión de
VEGF
mRNA en tumores derivados de ratones desnudos. (F) El análisis inmunohistoquímico de la expresión del VEGF en tumores derivados de SGC-7901 /CN y SGC-7901 /grupos KD. *
P Hotel & lt; 0,05; **
P
. & Lt; 0,01
Discusión
Aunque estudios previos han demostrado que Rabex-5 desempeña un papel en la tumorigénesis en varios tipos de cáncer [11 ] - [14], su papel en el cáncer gástrico no se había investigado. En el presente estudio, encontramos que Rabex-5 expresión está regulada positivamente de manera significativa en los tejidos de cáncer gástrico en comparación con el tejido normal adyacente, lo que indica que Rabex-5 puede contribuir a la tumorigénesis del cáncer gástrico. Además, la expresión de Rabex-5 se asoció significativamente con el tamaño del tumor y la metástasis de los ganglios linfáticos. En contraste, no hubo correlaciones significativas entre anormal expresión Rabex-5 y el sexo, la edad o la localización del tumor. Este es el primer estudio para dilucidar el significado clínico-patológica de Rabex-5 de expresión en pacientes con cáncer gástrico.
Para investigar el papel de Rabex-5 en la promoción de tumores, A continuación realizó un extenso análisis de pérdida de función en RABEX- 5-líneas celulares de alta expresión, SGC-7901 y NCI-N87. inhibición exitosa de Rabex-5 expresión se logró mediante la tecnología de ARNi, y desmontables se confirmó por Western blot. Nuestros análisis revelaron que la proliferación celular se redujo significativamente en las células y resultados similares SGC-7901 /KD y NCI-N87 /KD fueron obtenidos en ensayos de formación de colonias. Es importante destacar que,
in vivo y modelos de xenoinjertos en estos apoyaron
in vitro
observaciones. Este fenotipo puede ser causada por Rabex-5 la regulación de genes específicos y las vías de señalización, lo que afecta el ciclo celular y la apoptosis. En transwell ensayos, menos células SGC-7901 /KD y NCI-N87 /KD migrado a la cámara inferior a las células de control, lo que sugiere que Rabex-5 mejora la migración y la invasión en las células de cáncer gástrico. La cicatrización de heridas también se redujo significativamente después de silenciamiento de Rabex-5. Estos resultados verifican el importante papel de Rabex-5 en el crecimiento de células de cáncer gástrico y el comportamiento metastásico. Sin embargo, sigue siendo desconocido el mecanismo molecular exacto por el cual Rabex-5 ejerce estos efectos, ya que estudios con Rabex-5 son limitadas.
Estudios anteriores han demostrado que Rabex-5 puede unirse específicamente a la forma activa de conejos 5, regulando de este modo el acoplamiento y fusión de las membranas endosomal, la motilidad de los endosomas y transducción de señales intracelulares [15]. La expresión de proteínas Rab-5 se ha asociado con el desarrollo de diversos tumores malignos [16] - [18] y es capaz de promover la migración de las células tumorales [19], [20]. La angiogénesis juega un papel clave en la tumorigénesis [21], y está regulado por varios factores tales como el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) [22]. La vía de señalización de PI3K /Akt puede ser regulada tanto por VEGF y PDGF. Por ejemplo, el VEGF aumenta la proliferación neuroblastoma mediante la activación de PI3K /Akt señalización [23]. Del mismo modo, los estudios han demostrado que el PDGF puede afectar a la capacidad de migración de las células a través de la vía PI3K /AKT [24]. La activación de la señalización de PI3K /Akt puede inhibir la apoptosis celular inducida por diversos estímulos [25] - [29], y promover la progresión del ciclo celular [30], [31], promoviendo así la supervivencia y la proliferación celular. Esta vía también participa en la angiogénesis [32], [33], y juega un papel importante en la formación de tumores, invasión y metástasis [34], [35]. Nuestro estudio muestra que Rabex-5 silenciamiento provoca una disminución en la expresión de VEGF. Por lo tanto, la hipótesis de que Rabex-5 promueve el crecimiento y la capacidad metastásica de las células de cáncer gástrico a través de la activación de VEGF y sus vías de señalización corriente abajo
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En conclusión, hemos demostrado que Rabex-5 promueve la proliferación, la formación de colonias, la migración y la invasión, lo que sugiere que Rabex-5 puede ser un oncogén en el cáncer gástrico, y sus efectos pueden estar mediados parcialmente por la modulación de la activación de VEGF. por lo tanto Rabex-5 puede representar un nuevo marcador diagnóstico y pronóstico y una nueva diana terapéutica en el cáncer gástrico. Se debe hacer mayores esfuerzos para aclarar las vías de señalización que subyacen a estos fenómenos biológicos.