Extracto
El lamellipodium, una estructura esencial para la migración celular, juega un papel importante en la invasión y la metástasis de células cancerosas. Aunque Rac1 reconocido como un actor clave en la formación de lamelipodia, los mecanismos moleculares que subyacen a la motilidad lamellipodial no se entienden completamente. tecnología Optogenética nos permitió controlar la actividad de espaciotemporalmente fotoactivable Rac1 (PA-Rac1) en células vivas. Usando este sistema, que reveló el papel de la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) en la motilidad lamellipodial Rac1 dependiente en las células PC-3 de cáncer de próstata. A través de la irradiación láser azul local de células PA-Rac1 que expresan, se indujo de forma reversible la motilidad lamellipodial. En primer lugar, se observó la extensión hacia el exterior de un lamellipodium paralelo al sustrato. El lamellipodium extendida mostró entonces agitando la actividad en la periferia. Notablemente, PI (3,4,5) P
3 y WAVE2 se localizaron en el lamellipodium que se extiende de una manera dependiente de PI3K. Se confirmó que la inhibición de la actividad PI3K suprime en gran medida la extensión lamellipodial, mientras que la actividad ruffling fue menos afectada. Estos resultados sugieren que inducida por Rac1 motilidad lamellipodial consta de dos actividades distintas, extensión hacia fuera dependiente de PI3K y ruffling PI3K-independiente
Visto:. Kato T, Kawai K, Egami Y, Kakehi Y, Araki N (2,014 ) Rac1-dependiente lamellipodial Motilidad cáncer de próstata PC-3 células Revelado por el control Optogenética de Rac1 actividad. PLoS ONE 9 (5): e97749. doi: 10.1371 /journal.pone.0097749
Editor: Daotai Nie, Escuela de Medicina de la Universidad del Sur de Illinois, Estados Unidos de América
Recibido: 8 de Enero, 2014; Aceptado: April 24, 2014; Publicado: 21 de mayo 2014
Derechos de Autor © 2014 Kato et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyada por la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSP) KAKENHI (http://www.jsps.go.jp/english/e-grants/index.html) 25861427 a los conocimientos tradicionales; 24659087 y 23390039 de NA; 26860136 y 24890154 a KK; 25860142 de YE; 24390369 de YK. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la migración celular juega un papel importante en la organogénesis embrionaria; la cicatrización de heridas y la respuesta inmune; y la patogénesis de varias enfermedades incluyendo la invasión del cáncer y la metástasis [1], [2]. Por lo tanto, la comprensión de los mecanismos moleculares migración celular subyacente es importante para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para la prevención de la invasión tumoral y la metástasis. La migración celular implica los procesos de protrusión celular polarizado y la adhesión en la dirección del movimiento, la contracción celular, el desmontaje de los focos de adhesivo, y retracción en la periferia del borde de salida de la célula [1]. Durante la migración de células tumorales que está asociada con la metástasis del cáncer y la invasión, las células metastásicas exhiben cambios drásticos en la forma. Esta deformación es causada por la remodelación del citoesqueleto de actina, que es regulado por la familia Rho GTPasas como Cdc42 y Rac1. La familia Rho GTPasas se comportan como interruptores moleculares, un ciclo entre las formas activa unida a GTP y formas unida a GDP inactivos. La familia Rho GTPasas son activadas por factores de intercambio de nucleótidos de guanina (GEFs) y inactivados por GTPasa de la activación proteínas (BPA) [3]. Rac1, un miembro de la familia Rho GTPasas, conduce a la producción de protuberancias en forma de hoja que se hace referencia como lamellipodia o membrana volantes, mientras que Cdc42, otro miembro de la familia Rho, crea protuberancias en espiga llamados filopodios [3]. Rac1 se hyperactivated en células de cáncer de próstata metastásico [4]. Además, la inhibición de la actividad bloques Rac1 la migración y la invasión de células de cáncer de próstata [5]. Estos estudios sugieren que la formación de lamellipodial mediada Rac1 juega un papel importante en la metástasis del cáncer de próstata.
Hasta la fecha, la expresión de mutantes Rac1 como el constitutivamente activa (CA) Rac1Q61L y el dominante negativo (DN) tiene Rac1T17N sido ampliamente utilizado para la investigación de la participación de Rac1 en la formación lamellipodial y agitando [6]. Sin embargo, los datos del fenotipo de células obtenidas utilizando mutantes Rac1 deben ser interpretados con precaución. Debido a los efectos de la expresión irreversible, permanente y global en las células, es difícil decir que los fenotipos de las células que expresan mutantes Rac1 reflejan exactamente la acción de la proteína como un interruptor molecular. Para dilucidar el papel preciso de la activación espacio-temporal de Rac1, Wu et al. [7], [8] recientemente desarrollaron un Rac1 fotoactivable sistema (PA-Rac1) por fusión de una de oxígeno-tensión de la luz (LOV) de dominio y una extensión helicoidal (Jα) secuencia carboxi-terminal al extremo amino terminal de un constitutivamente Rac1 activa. LOV es un dominio de la proteína interruptor de la luz de
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phototropin 1. En la oscuridad, el dominio de unión a LOV flavina interactúa con Jα y para el sitio de unión al efector de PA-Rac1 configurando en su conformación cerrada. La irradiación con luz a 400-500 nm de luz induce la disociación de la lista de valores de dominio y hélice Jα, y conduce a la activación de Rac1. Esta activación foto-inducida es reversible. Usando este sistema, la activación de Rac1 localizada ha demostrado ser suficiente para inducir la motilidad celular y determinar la dirección del movimiento de las células [7], [8].
La relación entre Rac1 y fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) en la formación de lamellipodia es complicado porque las funciones de PI3K tanto aguas arriba y aguas abajo de Rac1 [9]. Fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfato (PI (3,4,5) P
3) se sabe que se unen Rac GEFs y luego acelerar la polimerización de actina a través de la activación de Rac1 [10]. Además, un bucle de retroalimentación positiva se ha informado entre PI (3,4,5) P
3 y Rac de la polaridad celular durante la quimiotaxis eucariotas [11], [12]. Sin embargo, en la regulación de la protrusión celular y la polaridad, los informes acerca de la función de PI3K aguas abajo de Rac1 se mezclan [13], [14]. Por lo tanto, el papel preciso de PI3K aguas abajo de Rac1 sigue siendo un tema controvertido.
Para aclarar la relevancia de PI3K de la motilidad lamellipodial Rac1-dependiente, se aplicó el sistema de PA-Rac1 a las células del cáncer de próstata. Fotomanipulación de la actividad PA-Rac1 utilizando un láser azul nos permitió distinguir dos procesos móviles lamellipodial en las células vivas: extensión lamellipodial y fruncido periférica. En particular, se encontró que los inhibidores de PI3K suprimido la iniciación de la extensión lamellipodial pero tuvo poco efecto en ruffling periférica. El presente estudio reveló que los procesos móviles lamellipodial Rac1-dependientes consisten en dos actividades disociables:. Extensión hacia fuera y PI3K-independiente fruncido periférica lamellipodial dependiente de PI3K
Materiales y Métodos
Reactivos y construcciones de ADNc
suero bovino fetal (FBS) y RPMI-1640 se obtuvieron de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). El ADN HP reactivo de transfección X-tremeGENE fue adquirido de Roche Diagnostic Systems (Basilea, Suiza). Los otros reactivos fueron adquiridos de Wako Pure Chemicals (Osaka, Japón) o Nacalai Tesque (Kyoto, Japón), a menos que se indique lo contrario.
pTriEx /mCherry-PA-Rac1Q61L (plásmido#22027) y pTriEx /mCherry- PA-Rac1 T17N (plásmido#22029) se obtuvieron de Addgene (Cambridge, MA). El Dr. Joel A. Swanson (Universidad de Michigan) proporcionó amablemente el dominio de homología pmCitrine-AKT-pleckstrin (PH) y pmCitrine-Rac1Q61L. Las construcciones de pEGFP-N1-WAVE2 fueron generosos regalos del Dr. Tadaomi Takenawa (Universidad de Kobe).
Cultivo de células y transfección
Se adquirieron células de cáncer de próstata humano PC-3 a partir de la American Type Culture Americana Collection (Rockville, MD) y se mantuvieron en medio RPMI que contiene 10% de FBS inactivado por calor, 100 U /ml de penicilina, y 100 mg /ml de estreptomicina. Las células se mantuvieron a 37 ° C en una atmósfera humidificada 5% de CO
2 incubadora. Para imágenes de células vivas, las células fueron sembradas en 25 mm cubreobjetos en placas de 35 mm a una densidad de 2,0 x 10
4 células /placa y se incubaron durante la noche antes de la transfección.
El X-tremeGENE HP ADN reactivo de transfección se utilizó para la transfección del plásmido de acuerdo con las instrucciones del fabricante. pTriEx /mCherry-PA-Rac1Q61L se añadió a las placas de 35 mm. En los tratamientos de co-transfección, se añadieron 0,01 hasta 0,5 g de los plásmidos apropiados a los platos 35 mm junto con 0,3 g del plásmido PA-Rac1.
Tratamientos farmacológicos
Determinar la papel de PI3K en la motilidad celular inducida por Rac1, las células se trataron con inhibidores de PI3K durante la irradiación. Se utilizó 50 M LY294002 (Sigma), 100 nM wortmanina (Sigma), y 1 (Bioquímicos activo) M ZSTK474 como inhibidores de PI3K. LY294002 y wortmanina, que son inhibidores de pan-PI3K, son ampliamente utilizados como herramientas para la investigación de diversos procesos de transducción de señales que implican PI3K. ZSTK474 también inhibe las cuatro isoformas de PI3K pero no inhibe quinasas relacionadas con PI3K, tales como mTOR y la proteína quinasa dependiente de ADN. Estos inhibidores se disolvieron en sulfóxido de dimetilo (DMSO), se almacena a -20 ° C, y se aplicaron a las células a las concentraciones finales indicadas. Estos inhibidores se añaden normalmente a las células 30 minutos antes de la fotoactivación, pero en algunos experimentos, se añadieron durante la fotoactivación. Para los tratamientos de control, 0,1% de DMSO se aplicó a las células.
fotoactivación y Células vivas imágenes
En 12-24 horas después de la transfección, el medio de cultivo se reemplazó con tampón de Ringer (RB ) que consiste en NaCl 155 mM, KCl 5 mM, CaCl 2 mM
2, mM MgCl 1
2, Na 2 mM
2HPO
4, glucosa 10 mM, 10 mM HEPES pH 7,2, y 0,5 mg /ml de albúmina de suero bovino. Los cubreobjetos de 25 mm se colocaron en una cámara llena RB-C en una etapa de termo-controlado 37 ° (INU Tokai Hit-ONI, Shizuoka, Japón). La fotoactivación de PA-Rac1 y imágenes de células vivas se realizaron con un microscopio invertido Axio Observador Z1 equipado con una unidad de escaneo láser (LSM700, Zeiss), como se describe anteriormente [15]. Para fotoactivar PA-Rac1, del área indicada de las células de cáncer de próstata que expresan mCherry-PA-Rac1 fue repetidamente irradiaron usando un láser de 5 mW 445 nm a una potencia de 0,2% para los períodos indicados en un modo de photobleaching. imágenes en vivo de células fueron adquiridos a través de un Plan de 63x-Apocromático /N. A. 1.4 lente cada 15 segundos utilizando un láser de 10 mW 555 nm a 0,5% -2,0% de energía para obtener fluorescencia y campo claro contraste de fase imágenes mCherry. Para visualizar PI (3,4,5) P
3 o WAVE2, las células se cotransfectaron con pmCherry-PA-Rac1 y el dominio pmCitrine-AKT-PH o pEGFP-WAVE2, respectivamente. EGFP o mCitrine imágenes de fluorescencia fueron adquiridos únicamente en los puntos primero y último de tiempo para evitar la fotoactivación no deseado por el láser de 488 nm, ya que esta longitud de onda de excitación solapa ligeramente con el espectro de fotoactivación [8]. Ajustamos el poder de 488 nm láser lo más bajo posible, por lo que la adquisición de la primera trama por el láser no afectaría la actividad PA-Rac1.
imágenes con lapso de tiempo utilizando microscopía de contraste de fase y fluorescencia eran tomada en intervalos de 15 segundos y montados en las películas de QuickTime utilizando el software Zen 2009 (Carl Zeiss). quimógrafo análisis se realizaron utilizando el software de imágenes MetaMorph (Molecular Devices). Los datos de las imágenes presentadas aquí son representativos de los resultados de al menos tres experimentos independientes.
Imagen Análisis Cuantitativo
Para el análisis cuantitativo de imágenes de la extensión lamellipodial debido a PA-Rac1 fotoactivación en ausencia o presencia de inhibidores de PI3K, que tomó mediciones de área aumenta celular restando las áreas de las células antes de la fotoactivación de los que después de la fotoactivación con software de imágenes MetaMorph
.
Para el análisis cuantitativo de mCitrine-AKT-PH y EGFP-WAVW2 contratación a las zonas fotoactivados, las intensidades de fluorescencia de las regiones de interés se midieron usando el software de imágenes MetaMorph. Las intensidades de fluorescencia de EGFP mCitrine y después de 5 min de fotoactivación se compararon con las intensidades de fluorescencia en el área correspondiente antes de la fotoactivación utilizando al menos 16 células.
Para cuantificar los efectos de los inhibidores de PI3K en lamelipodia extendido y agitando la actividad en células mCitrine-Rac1Q61L que expresan, las células se fijaron con paraformaldehído al 4% en 30 min después de la adición de los inhibidores de PI3K (50 M LY294002, 100 nM wortmannin, o 1 M ZSTK474) o el vehículo solamente (0,1% DMSO). Usando el sistema de imágenes MetaMorph, los diámetros máximos de las células que expresan Rac1Q61L se midieron antes y después de los tratamientos con fármacos para evaluar el efecto de la inhibición de PI3K en la lamellipodial extendida. Del mismo modo, los volantes periféricos por células se contaron usando un microscopio de fluorescencia para evaluar el impacto de la inhibición de PI3K en ruffling actividad. Treinta células en cada grupo se sometieron al análisis de imagen cuantitativo.
Los datos se presentan como la media ± error estándar (SE) para el número de células que se indican en el texto. El análisis estadístico se realizó utilizando la función de prueba de la t de Wilcoxon de Excel 2012. Las diferencias entre las muestras analizadas se consideraron significativas a p & lt;. 0.05
Resultados
activación local del PA-Rac1 Induce reversiblemente lamellipodial extensión y ruffling
Para dilucidar la relación entre la activación de Rac1 y la dinámica lamellipodial, introdujimos fusionado-mCherry PA-Rac1 en células PC-3. Después de confirmar la expresión de mCherry-PA-Rac1 basándose en la señal mCherry, irradiamos una región periférica de las células utilizando un láser de 445 nm durante los intervalos de adquisición de imágenes y las imágenes adquiridas de contraste de fase de las células vivas cada 15 seg por confocal microscopía. Normalmente, después de 1-4 min de irradiación con el láser de 445 nm, una delgada protuberancia en forma de hoja (es decir, un lamellipodium) se observó que se extiende paralelo al sustrato en el sitio periférico de células que se irradió por el láser 445 nm. El lamellipodium alcanzó su longitud máxima después de 5-6 minutos de la activación de AP-Rac1. En ese momento, después de la extensión hacia fuera, el lamellipodium totalmente extendida enroscó su borde de ataque para mostrar un movimiento fruncido periférica. Los movimientos ruffling continuaron durante la duración de la irradiación. Después de la irradiación cesó, tanto la extensión lamellipodial y el periférico de fruncido se retiraron rápidamente (Fig. 1 y la película S1). En nuestro estudio anterior, agitando se indujo dorsal en RAW 264 macrófagos mediante la activación PA-Rac1 [15], [16], pero dorsal ruffling no era prominente en las células PC-3.
PC-3 células fueron transitoriamente transfectadas con pTriEx /mCherry-PA-Rac1 y sometido a fotoactivación local del PA-Rac1 (área rectangular resumido por los puntos azules). imágenes con lapso de tiempo de una célula que expresa PC-3 mCherry-PA-Rac1 fueron adquiridos durante la fotoactivación mediante irradiación láser de 445 nm. Los paneles superior y medio muestran contraste de fase y fluorescencia mCherry imágenes, respectivamente. tiempos transcurridos después de la iniciación de fotoactivación se muestran en la parte superior. En el panel inferior, los contornos de la forma de la célula en los tiempos transcurridos indicados se dibujan en azul (0 min, original), (3,5 min, fase de extensión) (fase 6 min, agitando) amarillo y rojo. Los perfiles negros indican las ondulaciones de la membrana. Barra de escala, 10 micras.
Cuando irradiamos un área diferente de la misma célula, una extensión lamellipodial se genera en el área recién irradiado, lo que sugiere que estos fenómenos eran dependientes de la activación local PA-Rac1 por irradiación de luz (Fig. 2). La sobreexpresión de un mutante unida a GDP (dominante negativo) de PA-Rac1 (PA-Rac1 T17N) no indujo ya sea extensión lamellipodial o fruncido periférica después de la irradiación láser de 445 nm (no mostrado). Este hallazgo indica que los cambios morfológicos inducidos por la irradiación láser de 445 nm dependen de Rac1 GTP-cargado.
imágenes con lapso de tiempo de una célula que expresa PC-3 mCherry-PA-Rac1 fueron adquiridos durante PA-Rac1 foto-manipulación por irradiación láser local de las diferentes áreas. se muestran de contraste de fase seleccionada y las imágenes de fluorescencia mCherry. En primer lugar, la región 1 se irradió durante 10 min. A continuación, la irradiación se trasladó a la región 2. A los 25 minutos, la irradiación se apaga. Se muestran las imágenes con lapso de tiempo seleccionados de contraste de fase y fluorescencia mCherry. El lamelipodia extender y retraer se describen en rojo y amarillo, respectivamente. Barra de escala, 10 micras.
inducida por AP-Rac1 Extensión lamellipodial es dependiente de PI3K
la motilidad lamellipodial
Para examinar el efecto de la inhibición de la actividad de PI3K en PA-Rac1 inducida, nos usada LY294002, un inhibidor de la síntesis de PI3K. En primer lugar confirmó que las células que expresan PA-Rac1 exhibieron extensión lamellipodial y agitando debido a la fotoactivación. Tras el cese de fotoactivación, hemos añadido 50 M LY294002 a las mismas células. Cuando irradiado, las mismas regiones de las células 30 minutos después de la adición de LY294002, extensión lamellipodial se suprimió en gran medida por el inhibidor de PI3K (Fig. 3A y la película S2). Se realizó el mismo experimentos usando 22 células PC-3 y cuantitativamente comparó el aumento de la superficie debido a la activación PA-Rac1 en cada celda antes y después del tratamiento con LY294002 (Fig. 3B). El análisis de imagen cuantitativo demostró que el aumento de área de la célula debido a la extensión lamellipodial inducida por PA-Rac1 se suprimió significativamente por LY294002 (p & lt;. 0.01, n = 22, Fig 3B).
(A) PC- 3 células fueron transfectadas transitoriamente con pTriEx /mCherry-PA-Rac1. Las células se sometieron a fotoactivación repetido en ausencia (control) o presencia de 50 mM LY294002. El borde delantero de la lamellipodium desplegable está señalada en rojo. Barra de escala, 10 micras. (B) El aumento de la superficie celular debido a la extensión lamellipodial se cuantificó restando el área de la célula antes de la fotoactivación de la zona de la célula 7 min después del comienzo de la activación de PA-Rac1. Este aumento se verificó en 22 células PC-3. La trama de datos muestra el área incrementada debido a la expansión lamellipodial que fue inducida por PA-Rac1 fotoactivación en ausencia [LY (-)] o en presencia de LY294002 [LY (+)]. La significación de las diferencias entre LY (-) y LY (+) se confirmó con la prueba t de Wilcoxon (derecha). El aumento en el área lamellipodial en presencia de LY294002 fue significativamente menor que la de las células de control (p & lt; 0,01). análisis (C) kimográficos se realizó a una flecha de dos puntas colocado a través de la lamellipodium de una célula PC-3 que expresa mCherry-PA-Rac1 antes y después de la adición de LY294002. El área de láser irradiado se indica con un rectángulo azul. La línea blanca se describe el lamellipodium se extiende, y la línea punteada describe la forma de la célula inicial. El panel inferior muestra el quimógrafo de un lamellipodium sometidos a cambios de longitud. El quimógrafo demuestra la extensión y retracción de un lamellipodium durante la activación de AP-Rac1 (azul 1) y desactivación (negro 1), respectivamente. La flecha verde indica que la adición de LY294002. El inhibidor de PI3K tenía menos de un efecto inhibitorio sobre la extensión lamellipodial y agitando (azul 2). Sin embargo, el inicio de la extensión lamellipodial se inhibió drásticamente (2-negro azul 3). Las barras de escala, 10 micras.
Además, se realizó un análisis kimográficos para determinar los cambios en la longitud de la lamelipodia. Después de confirmar la extensión lamellipodial inducida por AP-Rac1 y agitando debido a PA-Rac1 fotoactivación, añadimos LY294002 a las células durante PA-Rac1 fotoactivación. Aunque las longitudes de la lamellipodia se cambiaron debido a ruffling periférica, el efecto inhibidor de LY294002 en la extensión lamellipodial era pequeña. ruffling periférica persistió durante la duración de la irradiación. Inmediatamente después de la fotoactivación cesó, tanto en extensión lamellipodial y fruncido periférica se retiraron por completo. Cuando nos re-irradiada la misma región, las células no muestran la extensión lamellipodial (Fig. 3C). Estos resultados sugieren que la formación de un lamellipodium es más sensible a los inhibidores de PI3K que es el mantenimiento de lamellipodia extendido y ruffling periférica.
Se obtuvieron resultados similares usando 100 nM wortmanina o 1 M ZSTK474 como inhibidores de PI3K (Fig. S1). Como control, los mismos experimentos de activación PA-Rac1 se realizaron con células tratadas con 0,1% de DMSO, el vehículo de los inhibidores. lamellipodial la formación inducida por AP-Rac1 no fue inhibida por DMSO (Fig. S2).
PA-Rac1 fotoactivación localmente pueden activar PI3K y reclutar WAVE2
Debido a la extensión lamellipodial inducida por AP-Rac1 fue inhibida por los inhibidores de PI3K, se intentó aclarar que la activación de AP-Rac1 dio lugar a la activación de PI3K. Para supervisar la producción de PI (3,4,5) P
3 por la actividad de PI3K, las células PC-3 se cotransfectaron con pmCitrine-AKT-PH y pTriEx /mCherry-PA-Rac1Q61L y se observaron utilizando un Zeiss LSM700 (Fig . 4). La intensidad de fluorescencia de mCitrine-AKT-PH en el borde de ataque lamellipodial después de 5 minutos de la AP-Rac1photoactivation se midió utilizando el software de imágenes MetaMorph y se comparó cuantitativamente con la de la misma región antes de la fotoactivación. Después de 5 min de activación local de PA-Rac1, la intensidad de fluorescencia de mCitrine-AKT-PH mostró un aumento de 125,4% ± 22,3% (n = 16) en comparación con el medido antes de la fotoactivación, lo que sugiere que los niveles de PI (3,4 , 5) P
3 en los que se extienden lamelipodia se incrementaron en gran medida por la fotoactivación local del PA-Rac1. En presencia de LY294002, no hay células mostraron un incremento en la intensidad de fluorescencia de mCitrine-AKT-PH después de la irradiación. Este hallazgo sugiere que la fotoactivación Rac1 activa PI3K para producir PI (3,4,5) P
3 de PI (4,5) P
2 en la membrana de la lamelipodia se extiende.
PC -3 células fueron co-transfectadas con pTriEx /mCherry-PA-Rac1 y mCitrine-AKT-PH. De contraste de fases, mCherry-PA-Rac1 (fluorescencia roja), y mCitrine-AKT-PH (fluorescencia amarilla) las imágenes fueron adquiridas antes y después de PA-Rac1 fotoactivación. PA-Rac1 fotoactivación se repitió en la misma región de células en ausencia (control) o presencia de 50 mM LY294002. Los niveles de PI (3,4,5) P
3 se incrementaron en el lamellipodium extiende por fotoactivación (puntas de flecha). En presencia de LY294002, PI (3,4,5) P
3 no fue aumentado en la región donde PA-Rac1 era foto-activado. El rectángulo azul punteada indica el área de fotoactivación. El lamellipodium desplegable está señalada en rojo. Las barras de escala, 10 m.
Además, se analizó la dinámica de WAVE2 durante el proceso de generación de lamelipodia, porque WAVE2 juega un papel importante en la reorganización de la actina inducida por Rac1 en asociación con PI (3,4 , 5) P
3 [17] - [19]. Después de 5 min de irradiación con luz de 445 nm, EGFP-WAVE2 localizada como una línea de puntos en el borde delantero de la lamellipodial se extiende (Fig. 5). La intensidad de fluorescencia de EGFP-WAVE2 después de la fotoactivación mostró un 315,1% ± 54,4% de aumento (n = 17) en el borde delantero de la lamellipodia extiende. Después de la adición de LY294002, ni reclutamiento EGFP-WAVE2 ni extensión lamellipodial se indujo por PA-Rac1photoactivation (Fig. 5). Estos hallazgos indican que WAVE2 es reclutado por PI (3,4,5) P
3 y contribuye a la extensión lamellipodial Rac1 dependiente través de la polimerización de actina.
PC-3 células fueron co-transfectadas con pTriEx /mCherry-PA-Rac1 y pEGFP-N1-WAVE2. De contraste de fases, mCherry-PA-Rac1 (fluorescencia roja), y EGFP-WAVE2 (fluorescencia verde) las imágenes fueron adquiridas antes y después de PA-Rac1 fotoactivación. PA-Rac1 fotoactivación se repitió en la misma región de células en ausencia (control) o presencia de 50 mM LY294002. Las puntas de flecha de color amarillo indican que WAVE2 de reclutamiento hasta el borde delantero de la lamellipodium se extiende. En presencia de LY294002, WAVE2 no fue reclutado a la periferia de las células donde se photoactivated PA-Rac1. El rectángulo azul punteada indica el área de fotoactivación. Barra de escala, 10 micras.
inhibidores de PI3K no afectan Extended lamelipodia pero hacen Mejorar periférica ruffling
Para aclarar el efecto de la inhibición de PI3K en el mantenimiento de lamelipodia extendida, se aplicó LY294002 a PC-3 células que expresan mCitrine-Rac1Q61L, un mutante constitutivamente activa Rac1. Las células mCitrine-Rac1Q61L que expresan habían lamelipodia bien extenderse alrededor de toda su circunferencia. Cuando añadimos 50 M LY294002 a estas células, el lamelipodia ampliada se redujo sólo ligeramente, incluso después de 30 min. Sorprendentemente, la actividad fruncido periférica fue notablemente reforzada por la inhibición de PI3K en las células que expresan Rac1Q61L (Fig. 6 y la película S3). El análisis cuantitativo de los cambios en el diámetro máximo de celda indica que este factor no se vio afectada significativamente por cualquier inhibidor de PI3K, mientras que el número de volantes periféricos se incrementó en gran medida después de 30 minutos de la inhibición de PI3K (Tabla 1)
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PC- 3 células fueron transfectadas con pmCitrine-Rac1Q61L. Las imágenes con lapso de tiempo de contraste de fase y fluorescencia mCitrine-Rac1Q61L fueron capturados antes (izquierda) y después (derecha) la adición de LY294002. Kymographs fueron creados para mostrar los cambios en la longitud de un lamellipodium en la posición de la línea de dos cabezas. La célula mCitrine-Rac1Q61L expresan tenía una lamellipodium extendida alrededor de toda su circunferencia. Después de la adición de 50 M LY294002, el lamellipodium extendida se había reducido sólo ligeramente, pero fue pronunciado el fruncido periférica. Los kymographs muestran los cambios dinámicos en longitud debido a fruncido mejorado después de la adición de LY294002. Las barras de escala, 10 micras
Discusión
lamelipodia se pueden clasificar en tres tipos:. El borde de ataque de una célula delgada que se extiende a lo largo de la membrana del sustrato, el periférico volantes formadas por la flexión hacia arriba del borde de ataque, y los volantes dorsales verticales que aparecen detrás del borde de ataque en la superficie dorsal de la célula [9], [20]. Sin embargo, no se han aclarado los diferentes mecanismos que regulan estos procesos móviles lamellipodial. las células PC-3 y otras células de cáncer de próstata no presentan ruffling dorsal, que se observa en los macrófagos después de la activación RAW264 PA-Rac1 [15]. Esta discrepancia es más probable debido a las diferencias entre estos tipos de células. las células PC-3 mostraron notable extensión y lamellipodial fruncido periférica tras la activación PA-Rac1. El presente estudio se realizó para caracterizar la dinámica lamellipodial y su regulación en PC-3 células de cáncer, como la motilidad lamellipodial juega un papel central en la invasión y metástasis de las células cancerosas de la próstata.
Los informes anteriores han observado que la inhibición de la la actividad de PI3K dificulta todo el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) inducida por los procesos móviles lamellipodial en fibroblastos, incluyendo la extensión, fruncido periférica, y la formación de la colmena dorsal [19]. Debido PI3K está involucrada en la etapa temprana de la transducción de señales del receptor de PDGF en fibroblastos [21], todas las respuestas a PDGF podrían ser interceptados por la inhibición de PI3K. Sin embargo, la actividad de PI3K es al parecer innecesario para fruncido inducida por M-CSF y dorsal inducida por EGF ruffling en las células A431 [22], [23]. Por lo tanto, la señalización de receptores distintos conduce a la formación de la colmena en diversos tipos de células. En nuestros experimentos con el control de la actividad optogenético Rac1, que induce directamente la actividad lamellipodial Rac1 de señalización mediada sin aguas arriba de los receptores. Debido a la implicación de PI3K en la transducción de señal temprana de diferentes tipos de receptores, por lo tanto podría ser ignorada, podríamos dilucidar el papel de PI3K en la motilidad lamellipodial aguas abajo de Rac1. El uso de imágenes de células vivas en combinación con PA-Rac1 photomanipulation, hemos podido demostrar claramente que la primera lamellipodium se extiende hacia fuera paralela al sustrato, y que el lamellipodium totalmente extendida a continuación muestra la actividad ruffling doblando el borde de ataque. Además, hemos encontrado que la extensión lamellipodial inducida por la activación de PA-Rac1 era gravemente perturbado por los inhibidores de PI3K mientras ruffling periférica no fue inhibida. Estos resultados sugieren que los dos tipos de motilidad lamellipodial, extensión y agitando, se diferencialmente regulados por las vías de señalización de PI3K-dependientes e independientes de PI3K.
Wiskott-Aldrich proteína del síndrome (WASP) y WASP-familia-verprolin proteína homóloga proteínas (OLA) de la familia son activadores de polimerización /3-dependiente Arp2 [17]. proteínas de la familia WAVE están asociados con la formación de lamellipodial a través de la vía de señalización Rac1. Para evitar la polimerización de actina desordenada, proteínas de la familia WAVE existen complejos de proteínas como heteropentamérico que dificultan sus propios sitios activos. Aunque las ondas son funcionalmente activados por Rac1 unida a GTP cuando se inicia la polimerización de actina, las ondas no pueden unirse directamente a Rac1 unida a GTP. En su lugar, IRSp53 (insulina receptor tirosina quinasa sustrato p53) funciona como una molécula de enlace para conectar Rac1 y la onda compleja [18]. Unida a GTP Rac1 induce un cambio alostérico en el complejo de onda que expone su sitio activo; WAVE2 activa entonces el complejo Arp2 /3, que se convierte en un núcleo para la polimerización de actina en el borde delantero de la lamellipodium [24] - [26].
En nuestros experimentos PA-Rac1-activación, WAVE2 se localizó en los bordes de ataque de extender lamellipodia. Sin embargo, se observó ni reclutamiento WAVE2 ni extensión lamellipodial cuando se inhibió la actividad de PI3K. Estos resultados sugieren que PI (3,4,5) P se requiere
3 para el reclutamiento WAVE2 y para la extensión de lamellipodial. Debido WAVE2 tiene un PI (3,4,5) P
secuencia [19], PI (3,4,5) P3 vinculante
3 pueden reclutar WAVE2 al borde de ataque. Suetsugu et al. [18] informaron de que la actividad del complejo WAVE2 se optimizó por IRSp53 en asociación con Rac1 activado y PI (3,4,5) P
3. Además, la unión de GTP de Rac y ácidos fosfolípidos simultáneas como PI (3,4,5) P
3 a WAVE2 se requiere para la contratación eficiente y activación de WAVE2 [17]. Estos informes anteriores refuerzan nuestra afirmación de que la inhibición de la extensión lamellipodial por PI3K inhibidores de los resultados de la perturbación de la contratación WAVE2.
En este estudio, la activación de AP-Rac1 indujo la producción de PI (3,4,5 ) P
3 y el reclutamiento de WAVE2 cuando se inició la extensión lamellipodial. Además, los inhibidores de PI3K obstaculizaron la contratación de WAVE2 y PI (3,4,5) P
3 y suprimen la extensión lamellipodial. Estos hallazgos indican que PI3K juega un papel esencial en la iniciación de la extensión lamellipodial. Además, se empleó células Rac1Q61L que expresan constitutivamente activos para observar la respuesta de la lamellipodia extendida a la inhibición de la actividad PI3K. En las células que expresan Rac1Q61L, la lamellipodia extendido eran relativamente resistentes a los inhibidores de PI3K.