Extracto
ultrasonografía endobronquial guiada punción transbronquial (PA guiada ) y Trans-esofágico exploración por ultrasonido con aspiración con aguja fina (EUS-FNA) son importantes, nuevas técnicas para el diagnóstico y estadificación del cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) que se han incorporado a las directrices de estadificación del cáncer de pulmón. Para guiar y optimizar las decisiones de tratamiento, especialmente en pacientes con NSCLC en estadio III y IV,
EGFR
y
A menudo se requiere KRAS
estado de la mutación. La tasa de concordancia del análisis de la mutación entre estos aspirados citológicos e histológicos de muestras obtenidas por la clasificación quirúrgica es desconocido. Por lo tanto, se estudió el grado en el que específico de alelo cuantitativa en tiempo real PCR con sondas de hidrólisis se puede realizar de forma fiable en USEB y EUS aspirados con aguja fina mediante la comparación de los resultados con material histológico del mismo paciente. Se analizó una serie de 43 pacientes con CPNM para los que se disponía de material citológico e histológico. Hemos demostrado que estas técnicas moleculares estándares se pueden aplicar con precisión en los aspirados con aguja fina citología de pacientes con CPNM. Es importante destacar que, se muestra que todas las mutaciones detectadas en el material histológico de tumor primario también se identificaron en las muestras citológicas. Llegamos a la conclusión de que el perfil molecular se puede realizar de forma fiable en finas aspirados de aguja de citología de pacientes con CPNM
Visto:. Van Eijk I, J Licht, Schrumpf M, Talebian Yazdi M, D Ruano, Forte GI, et al. (2011) Rápido
KRAS
,
EGFR
,
BRAF
y
Análisis FODA PIK3CA mutación de aspirados con aguja fina de no pequeñas de pulmón de células Utilización alelo-específica qPCR. PLoS ONE 6 (3): e17791. doi: 10.1371 /journal.pone.0017791
Editor: Ralf Krahe, Universidad de Texas MD Anderson Cancer Center, Estados Unidos de América
Recibido: 26 Octubre, 2010; Aceptado: 11 Febrero 2011; Publicado: 8 Marzo 2011
Derechos de Autor © 2011 van Eijk y col. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue financiado por el Centro Médico de la Universidad de Leiden. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es la principal causa de mortalidad por cáncer en el mundo occidental [1]. Para fines clínicos y terapéuticos, cáncer de pulmón se subdivide tradicionalmente en células pequeñas (SCLC) y el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). Considerando SCLC es tratado por quimioterapia y /o radioterapia, NSCLC se trata principalmente a través de la resección; Sin embargo, sólo el 30% de los pacientes con CPNM tiene una enfermedad resecable (fase I /II) en el momento de la presentación [2]. Esto pone de relieve la importancia de la información precisa estadificación del mediastino, preoperatorio en la prevención de las resecciones innecesarios. La estadificación preoperatoria se puede realizar a través de la transbronquial (PA guiada) o transesofágica (EUS-FNA) la aspiración de los ganglios linfáticos del mediastino. Estos procedimientos citológicos son menos invasivos que mediastinoscopia rutina seguida de biopsia de los ganglios linfáticos, pero [3] una alta especificidad y sensibilidad similar - [9] se logran. La ecografía se ha incorporado a las directrices de estadificación del cáncer de pulmón como una alternativa para la estadificación quirúrgica del mediastino [10], [11].
En muchos casos, el aumento del uso de estas técnicas mínimamente invasivas es suficiente para diagnosticar y etapa el paciente correctamente. Aunque la cantidad de material celular obtenido por estos procedimientos es relativamente pequeño, la información solicitada por los médicos está creciendo rápidamente, por ejemplo, para el NSCLC, inmunohistoquímica y patología molecular se han convertido en parte de la atención estándar [12].
Además de este cambio en los procedimientos de estadificación, el rápido desarrollo de nuevos tratamientos médicos para los pacientes con CPNM ha tenido lugar. Un subconjunto de los cánceres de NSCLC puede albergar una mutación de activación en el dominio quinasa de EGFR [13]. Los tumores con estas mutaciones son con frecuencia sensibles a los inhibidores de tirosina quinasa (TKIs). Por otra parte, la activación de mutaciones en
KRAS
están asociados con la resistencia a TKIs. Aunque la mayoría de las publicaciones dan cuenta de que estas mutaciones son mutuamente excluyentes [14] - [19], la evidencia sugiere [20] que un tumor puede albergar simultáneamente un activador
EGFR
mutación y mutaciones aguas abajo de la vía en el
KRAS
gen, lo que significa que la inhibición aguas arriba de EGFR no tendrá ningún efecto terapéutico en estos casos. Además, las mutaciones en
BRAF
y
PIK3CA ¿Cuáles son reportados en el CPNM. Sin embargo, se requiere más investigación para determinar el grado en que estas mutaciones pueden tener consecuencias para el tratamiento [21], [22].
Debido a estos acontecimientos y el deseo de los pacientes y los médicos para minimizar el retardo de la administración , se necesitan técnicas moleculares rápidos y sensibles. Preferiblemente, estas técnicas deben ser aplicables en, (FFPE) muestras citológicas en parafina fijados con formol [23] - [25] ya que las muestras de aspiración PA guiada y EUS-FNA son a menudo el primer material que se adquiere a partir de pacientes con NSCLC. Específica de alelo cuantitativa en tiempo real PCR (qPCR) con sondas de hidrólisis es una técnica fiable y sensible que puede utilizarse para este propósito. La detección de mutaciones en
EGFR
,
KRAS
,
BRAF
y
PIK3CA
con sondas de hidrólisis se ha descrito previamente en pacientes con NSCLC [23] - [26 ]. La sensibilidad de los ensayos también supera el conjunto de la propuesta de sensibilidad al 1% para
KRAS
pruebas de mutación [27].
La mayoría de los
EGFR
mutaciones son p.L858R, la hotspot mutación en el exón 21 y deleciones en el exón 19, que se presentan a comprender hasta el 36% de todas las mutaciones activadoras [15], [28].
KRAS
está mutado en el 10% -30% de los carcinomas de pulmón y más del 95% de todas las mutaciones activantes en
¿Cuáles son KRAS situado en el exón 1 (codones 12 y 13) [28], [ ,,,0],29]. El
BRAF mutación
p.V600E punto de acceso se informa en el 3% de NSCLC y altera residuos importantes en la fosforilación de AKT mediada BRAF, lo que sugiere que la alteración de la inhibición de BRAF AKT inducida juega un papel en la transformación maligna [28] , [30]. Tres mutaciones de punto de acceso en
PIK3CA
puede ser otra causa de la sobre-activación de la vía PI3K-AKT, que promueve la transformación maligna de las células epiteliales de las vías respiratorias humanas y se ha informado en aproximadamente el 4% de los carcinomas de pulmón [28 ], [31].
en el presente estudio, se compararon los ensayos de qPCR alelo-específicas para la activación de las mutaciones más frecuentes en
EGFR
,
KRAS
,
BRAF
y
PIK3CA
en los aspirados con aguja fina citología-tumorales positivas contra material histológico de los tumores primarios.
con este enfoque, nuestro propósito es determinar en qué medida específica de alelo con qPCR sondas de hidrólisis se pueden realizar en material de aspiración citológica mediante la comparación del estado de la mutación y entonces la observación de la tasa de concordancia entre la citológico y material histológico y entre los tumores primarios y metástasis.
materiales y Métodos
Declaración de Ética
necesidad específica de la aprobación ética del comité no era necesario para este estudio. Todas las muestras fueron manejadas de acuerdo con las directrices éticas médicas descritas en el Código correcto uso secundario de Tejidos Humanos establecida por la Federación Holandesa de Ciencias Médicas (www.federa.org, consultado el 27 de octubre de 2010). De acuerdo con estas directrices todo el material humano utilizado en este estudio se ha anónima ya que no se utilizaron los datos clínicos. Debido a que no es necesario el permiso de este procedimiento en forma anónima individuales de los pacientes.
Selección de la muestra
El material de 43 pacientes con CPNM para el que tanto positiva al tumor citológico y material histológico fue disponibles se selecciona de entre el Departamento de Patología en el Centro Médico de la Universidad de Leiden (LUMC) e identificado mediante una búsqueda en la base de datos PALGA; muestras citológicas no ginecológicas entre 2005 y 2009 se realizaron búsquedas utilizando las cuerdas de búsqueda "pulmón, células malignas y cáncer de pulmón no de células pequeñas" y "mediastino, las células malignas y cáncer de pulmón no de células pequeñas". De las 447 muestras citológicas únicas, se seleccionaron los casos en los que el material histológico de tumor positivo del tumor primario también estaba disponible (cuadro complementario S1). De los 43 pacientes, 33 pacientes fueron en subtipos: 14 carcinomas de células escamosas, 15 adenocarcinomas, 3 carcinomas adenoescamosos y 1 carcinoma de células grandes. Los 10 pacientes restantes habían sido clasificados NSCLC solamente.
se obtuvo el ADN de 42 muestras FFPE de control de la sección de Diagnóstico Molecular (MD) del Departamento de Patología en el LUMC. Para fines de validación, una serie de muestras de ADN de 10, de los cuales 9 habían demostrado un
EGFR
exón 19 de su eliminación mediante secuenciación de ADN, fue proporcionada por el Instituto del Cáncer de Holanda -. El Hospital Antoni van Leeuwenhoek
el aislamiento de ADN
Antes de aislamiento de ADN, se enriquecieron las células tumorales para obtener los porcentajes & gt de células tumorales; 70% (Figura 1). Los bloques tumorales FFPE fueron enriquecidas para células tumorales guiadas por un hematoxilina y eosina (H & amp; E) de diapositivas teñidas teniendo punzones de tejido 0,6 mm desde el centro del tumor en el bloque de FFPE mediante el uso de un microarrayer tejidos (Beecher Instruments, Sun Prairie, WI , ESTADOS UNIDOS). Antes de aislamiento de ADN, el tejido se desparafinaron en xileno y se lavó en etanol al 70%. Para los bloques de celdas, 10 portaobjetos de 10 micras se tiñeron con hematoxilina. Las células tumorales se caracterizan por guiar con un 5 micras H & amp;. E diapositivas y los campos tumorales correspondientes en las diapositivas de hematoxilina se microdissected
detalle microscópico de un frotis citológico obtenido por aspiración con aguja fina de un ganglio linfático meadiastinal de un paciente NSCLC. Los focos tumorales están marcadas en la parte trasera de cada portaobjetos con una punta de diamante. Posteriormente los cubreobjetos se retiran y focos tumorales se rasparon de la corredera usando una hoja de bisturí (no mostrado).
En los frotis de citología, se inició microdisección mediante el marcado de los focos del tumor con una aguja de diamante en la parte de atrás de la corredera con tinción de Giemsa. Posteriormente, cubreobjetos se retiraron por incubación en xileno a temperatura ambiente en tubos de 50 ml separados para evitar la contaminación. La incubación se realizó durante una noche o hasta que se retiró la hoja de la cubierta (a veces hasta una semana). Posteriormente, los portaobjetos se lavaron en alcohol, tres veces en 100%, una vez en el 70% y una vez en el 50%, para rehidratar el tejido. El uso de una hoja de bisturí, la focos tumorales de las áreas marcadas se rasparon y se recoge en tubos de micro para el aislamiento de ADN.
ADN se aisló utilizando el kit de purificación de ADN genómico XS NucleoSpin Tissue (Machery-Nagel, Düren, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El rendimiento promedio de ADN de los frotis y bloques de células fue 282 ng y 280 ng, respectivamente. Sin embargo, los frotis de citología se fijaron usando metanol en lugar de formalina, por lo que se esperaba que el ADN aislado a ser de mayor calidad. El rendimiento promedio de ADN de las biopsias fue considerablemente mayor (985 ng).
Antes del análisis, las muestras de ADN se diluyeron por 5 o 15 veces. Hemos observado que el ADN diluido más de 15 veces en general dieron un ciclo de cuantificación (Cq) & gt; 35 (datos no mostrados); Por lo tanto, en los ensayos posteriores, se utilizaron 5 × diluciones de stock de ADN en agua estéril.
Mutación de detección
Los ensayos para la detección de siete diferentes
KRAS
, tres
PIK3CA
y uno
BRAF
variante se obtuvieron a través de la herramienta Custom TaqMan® diseño de ensayo (Applied Biosystems, Nieuwerkerk a /d IJssel, Países Bajos). sondas de hidrólisis fueron diseñados con modificaciones menores aglutinante Grove (MGB) en el extremo 3 '. Estas sondas modificadas tienen la ventaja de que las sondas relativamente cortos pueden ser diseñados con una mayor temperatura de fusión (Tm) y el aumento de la estabilidad del dúplex y la especificidad en comparación con las sondas convencionales [32]. El
EGFR
ensayos fueron descritos anteriormente [33]. qPCR reacciones se llevaron a cabo en reacciones de 10 l que contenía 5 l de Comienzo Acelerado universal Sonda Master (Roche Applied Science), 1 l de 10 × soluciones de cebadores y sondas de hidrólisis, 2 l de 5 × ADN diluido y 2 l de agua estéril en un recipiente sellado LightCycler 480 placa de múltiples pocillos 384 (Roche Applied Science) en un sistema LightCycler 480 (Roche Diagnostics) de la siguiente manera: 10 minutos a 95 ° C y 45 ciclos de 15 segundos a 92 ° C, 60 segundos a 60 ° C y 10 segundos a 72 DO. Para la validación, se realizó la secuenciación de Sanger utilizando cebadores M13 directo como se describe anteriormente [34] en el núcleo secuenciación del genoma del Centro de Tecnología de Leiden. Primer secuencias se enumeran en la Tabla S2 complementario. Todo secuenciación de ADN se terminó de genes conocidos y se terminó ninguna nueva secuenciación.
Los datos en bruto desde el software LC480 se importaron en una hoja de cálculo en la empresa creada por Microsoft Excel 2003 para definir el estado de la mutación. Se utilizó el ciclo de cuantificación (Cq) para la evaluación de la calidad y las muestras con valores superiores a 35 Cq (CQ & gt; 35) en el canal de tipo salvaje fueron rechazadas y excluidas para su posterior análisis. Para determinar la presencia o ausencia de una mutación, la relación de fluorescencia de punto final R
m /R
en peso se calculó después de restar la señal de fondo promedio de tres controles negativos. La hoja de cálculo está disponible bajo petición. Para
BRAF
,
PIK3CA
y
EGFR
p.L858R, estado de la mutación fue discriminada directa (Figura 2a). Las mutaciones se identificaron cuando el
m /R relación
R peso fue mayor que 0,7, mientras que una proporción menor que 0,3 indicó la ausencia de una mutación. No se observaron valores intermedios. En
KRAS
muestras de tipo salvaje, se observó un aumento de la señal de fondo para la c.34G & gt; T (R
m /R
en peso ± 0,4) y c.38G & gt; C (R
m /R
en peso ± 0,6) de ensayo en el canal de la sonda mutante. Esto fue probablemente causada por hibridación imperfecta de estas sondas al alelo de tipo salvaje. El ajuste para identificar la mutación fue correctamente c.34G & gt; TR
m /R
p & gt; 0,7, mientras que el c.38G & gt; se identificó T mutante cuando un
m /R
relación en peso de I se utilizó de corte de 0,8. La
EGFR
exón 19 sonda de deleción resultó en un descenso en la fluorescencia de punto final, mientras que en una muestra de tipo salvaje, ambas sondas dieron una señal. Para analizar
EGFR
exón 19 supresiones, R
m /R
p & gt; 0,8 y Cq & lt; 32 se consideraron de tipo salvaje y R
m /R
wt≤0.6 y Cq & lt; 32 indican una deleción. Los valores intermedios, con R relación
m /R
en peso entre 0,6 y 0,8 y Cq & lt; 35, la confirmación mediante secuenciación de Sanger requieren
El panel A muestra el ensayo de EGFR p.L858R.. Todas las muestras presentan una señal de tipo salvaje (control), VIC, panel inferior (líneas verde y azul), mientras que sólo el grupo 2 (línea azul) muestra una señal FAM mutante. El panel B muestra el ensayo de mutación de EGFR exón 19. El panel inferior muestra la señal VIC tipo salvaje para todas las muestras (rojo, verde y líneas de color púrpura). Los paneles superiores muestran la señal FAM mutante. Grupo 1 (líneas rojas) muestra la señal de tipo salvaje, Grupo 2 (rojo y púrpura) muestra los posibles mutantes con disminución de la fluorescencia, el grupo 3 (línea verde) muestran una señal desaparecido casi por completo lo que indica una deleción. Las imágenes se obtuvieron a partir de la versión de software 1.5.0 LC480. El eje y muestra la fluorescencia relativa para la FAM (465-510 nm) y sondas de Vic (533-580nm), eje x muestra los ciclos de PCR.
Resultados y Discusión
diseño de ensayo y validación
en
BRAF
, un único ensayo fue diseñado que detecta la mutación activadora p.V600E punto de acceso, que resulta de la c.1799T & gt; una sustitución [35]. Para
PIK3CA
, hemos diseñado sondas para las tres sustituciones más comunes [36]: c.1624G & gt; A (p.E542K), c.1633G & gt; A (p.E545K) y c.3140A & gt; G ( p.H1047R). Aunque estos tres ensayos detectan más de 85% de todas las mutaciones en NSCLC, algunas de las sustituciones poco frecuentes en las regiones de punto de acceso eran potencialmente perdidas. Para
KRAS
, hemos diseñado ensayos para los siete más frecuentes sustituciones de pares de bases en los codones 12 y 13: c.34G & gt; A (p.G12S), c.34G & gt; C, (p.G12R), c .34G & gt; T, (p.G12C), c.35G & gt; A, (p.G12D), c.35G & gt; C, (p.G12A), c.35G & gt; T (p.G12V) y c.38G & gt; A (p.G13D). En conjunto, estos ensayos detectan casi todas las sustituciones en
KRAS
, aunque algunas variantes raras podrían perderse. Para detectar el punto de acceso y el exón 19 p.L858R deleciones en
EGFR
utilizamos ya se ha informado ensayos [33]. La
EGFR
mutación p.L858R se detectó utilizando una mezcla de sondas que contiene una sonda de tipo salvaje y dos sondas mutantes diferentes: uno para la variante más común (c.2573T & gt; G) y una para la rara c complejo .2573_2574TG & gt; GT inversión
análisis de la mutación hotspot en el material de la citología con CPNM pacientes
para abordar la medida en que el análisis de mutaciones se puede realizar de forma fiable en PA guiada y material de la aspiración EUS-FNA. , hemos realizado los ensayos de 13 en 43 pacientes con CPNM para el cual tanto del tumor primario (ya sean biopsias o resecciones de material histológico) y material citológico de tumor positivo se había recogido. El material a partir de los 43 pacientes representa 29 núcleos de tejido obtenidas por extracciones histológicos, 23 biopsias microdissected biopsias y 3-sección entera que se compararon con 45 frotis citológicos microdissected y 17 bloques de células microdissected (Tabla S1).
Seis pacientes presentado con un
KRAS
mutación: c.34G & gt; T (N = 2), c.34G & gt; a, c.35G & gt; a, c.35G & gt; C y c.38G & gt; a. Un paciente lleva una deleción en el exón 19 del
EGFR gratis (c.2238_2252del15) y dos pacientes mostraron
PIK3CA mutaciones
: c.1633G & gt; A y c.3140A & gt; G. El último caso mostró un
KRAS mutación
(p.34G & gt; T) adicional. No hay mutaciones en
BRAF
se observaron.
Para algunos pacientes, histológico y /o múltiples muestras citológicas se analizaron. En diferentes muestras para el mismo paciente, no se observaron resultados en conflicto para el mismo tipo de material. Por lo tanto en la Tabla 1 a cada paciente se representa sólo una vez, donde para cada tipo de material de la información de todas las muestras del paciente se fusiona. Esto significa que la señal más clara para cada ensayo tenía prioridad. En la tabla 1, las llamadas restantes que faltan, debido a las señales de baja se indican con "?".
La tasa global de llamadas en los 13 ensayos, después de la fusión, asciende a 95% (58 resultados indeterminados fuera de 1118 pruebas). El tipo de referencia para el material histológico es sustancialmente superior al 99% (8 indeterminada de 559) que en el material citológico al 91% (48 de 559). Dentro del material citológico, el tipo de interés para los tumores primarios es menor (84%) que para las metástasis (96%). Tenga en cuenta que estas observaciones se mantienen si se retira del paciente con los resultados de calidad más baja (muestra 21). Dentro del material histológico se observa la misma diferencia en la tasa de llamadas, pero en un grado mucho menor (98% para los tumores primarios frente a 99% para las metástasis). Al comparar las tarifas de llamadas por ensayo, se observó que los tres ensayos en el
PIK3CA
gen realizaron menos (entre el 88 y el 91%) que los otros 10 ensayos (entre el 94 y el 99%).
Como se pudo observar, cuando el material citológico se obtuvo de los tumores primarios, los resultados de mutación para la histología y la citología fueron concordantes en todos los casos en los que se determinaron ambos resultados. Cuando el material citológico se obtuvo de la metástasis, en un paciente (nr 40) con un /carcinoma adenocarcinoma broncoalveolar celular (BAC), un c.34G KRAS & gt; A se identificó la mutación en el ganglio linfático mediastinal que no fue detectado en el tumor primario. Esto podría explicarse por la divergencia genética comúnmente observado de la metástasis de su tumor primario. En este caso, el lapso de tiempo es de 18 años entre el tumor primario y la metástasis. En general, la tasa de discordancia es solamente 0.20% (1 ensayo de 503, donde se determinan tanto los resultados histológicos y citológicos).
porcentaje de células tumorales y la calidad del ADN
A partir de biopsias y citología, sólo una pequeña focos tumorales pueden microdissected. Esto resulta en un bajo rendimiento de ADN que, en caso de fijación con formalina, también es parcialmente degradado. Para el estudio de la calidad del ADN, se comparó el rendimiento de ADN para la realización del ensayo. Hemos observado que la cantidad promedio de ADN aislado (295 ng) fue menor en el grupo (n = 15) en el que dos o más ensayos fracasaron [en comparación con el grupo sin ensayos de defecto (n = 102, 2 973 ng)]. Sin embargo, en este último grupo, el 44% de las muestras (n = 45) también tenía una cantidad de ADN de menor que 295 ng. Esto indica que los valores Cq son un mejor indicador de la calidad del ADN y el rendimiento de las mediciones de concentración de ADN.
alelo-específica qPCR con sondas de hidrólisis se ha informado de superar el nivel de sensibilidad 1% [27]. Sin embargo, teniendo en cuenta que la eficiencia qPCR también depende de la fragmentación del ADN, el ADN aislado de muestras de FFPE precisión podría ser analizado en un nivel de sensibilidad de 10% [26]. Se determinó el límite de detección en diluciones seriadas de ADN de dos tumores que lleva un
KRAS
c.34G & gt; T o una c.35G & gt; A mutación. Esto demostró que el ADN de entrada mínima debe ser de al menos 32 pg, el equivalente de 4-6 células de ADN de alto peso molecular, para dar valores Cq. & Lt; 35 (Figura 3)
El panel superior muestra el mutante señal (FAM) para una gama de diferentes cantidades de ADN de entrada en pg lleva la c.34G & gt; T mutación KRAS. No hay señal "mutante" se observa en un ADN de tipo salvaje (línea verde) y el control del agua (línea gris). En el panel de tipo salvaje (VIC) todo el show de ADN una señal de tipo salvaje, mientras que el control del agua es negativo (línea gris). Las imágenes se obtuvieron a partir de la versión de software 1.5.0 LC480. El eje y muestra la fluorescencia relativa para la FAM (465-510 nm) y sondas de Vic (533-580nm), eje x muestra los ciclos de PCR.
Además, se validó en los ensayos una serie de ADN aisladas de muestras FFPE microdissected cuando se conoce la
KRAS
,
PIK3CA
,
BRAF
o variantes EGFR como se determina mediante secuenciación de Sanger. Encontramos una correlación del 100% con los ensayos de sondas de hidrólisis.
Hemos validado el ensayo de
EGFR
exón 19 en una serie de 10 muestras con una posible secuencia del exón 19 supresiones verificado y un porcentaje de tumor mas de 50%. Las muestras se ensayaron sin conocimiento previo del estado de la mutación. Los resultados del ensayo de hidrólisis se compararon con los resultados de secuencias de ADN y las nueve muestras que contienen una deleción del exón 19 fueron identificados y distinguida de la muestra de tipo salvaje correctamente (figura 2b). En un caso, hubo una inserción de 18 pb en el exón 19. Debido a que este cayó fuera del área de detección de las sondas, el mutante no fue detectado por el ensayo de eliminación (IDMuestra 1012 en el cuadro complementario S3). Estos resultados muestran que todas las mutaciones de punto de acceso y
EGFR
exón 19 supresiones se pueden detectar usando las sondas de hidrólisis.
La reactividad cruzada
Las mutaciones en
KRAS
y
PIK3CA
clúster en los puntos críticos. Para
KRAS
, los siete ensayos hibridado con los codones 12 y 13 (nucleótidos c.34G, c.35G y c.38G), mientras que para
PIK3CA
dos ensayos detectan cambios exón 9 (c .1624G & gt; A y c.1633G & gt; A). A medida que las sondas potencialmente hibridaron en la misma región, la reactividad cruzada entre los diferentes
KRAS
o
PIK3CA
ensayos puede ser observado como resultado del aumento de las lecturas de fluorescencia de las sondas o cebadores imperfectamente coincidentes [26 ]. Además, la reactividad cruzada podría ser el resultado de (raros) sustituciones de pares de bases que no están cubiertos por los ensayos utilizados.
La reactividad cruzada fue estudiado en una serie de 42 muestras MD lleva un
KRAS
mutación en la posición 34, 35 o 38. se realizaron un total de 294 ensayos (42 × 7). Se identificó el estado de la mutación correcta cuando un R
m /R
relación en peso de corte & gt; se utilizó 0,7; sin embargo, en 68 ensayos, se observó una señal de reactividad cruzada. Cinco señales de reactividad cruzada tenían R
m /R
en peso & gt; 0,7, pero en estos casos, el ensayo para la mutación genuina tenía R
m /R
en peso & gt; 1,0. La reactividad cruzada se observó sólo para las sondas que cubren la misma posición de pares de bases (en la posición 34 o 35). La reactividad cruzada entre las señales de par de bases 34 o 35 y la posición 38 no se observó (Tabla S4). Por lo tanto, es probable que no se observaron efectos de reactividad cruzada para los dos diferentes
PIK3CA
sondas.
La práctica clínica
Los métodos descritos se pueden implementar en la práctica clínica. Los resultados de las pruebas de diagnóstico molecular se pueden generar en un tiempo corto. En la práctica diaria, la citológico PA guiada por aspiración o material EUS-FNA se escriben morfológicamente por los patólogos. Posteriormente, las muestras se agrupan para microdisección sobre una base semanal. Microdisección es esencial para obtener los porcentajes altos de células tumorales para detectar el exón 19 de EGFR eliminación, y para permitir que otros análisis con menor sensibilidad que el método descrito, por ejemplo secuenciación de Sanger. Después de aislamiento de ADN, los ensayos de sondas de hidrólisis se llevan a cabo en las diluciones de ADN. Al final de la segunda día, los resultados qPCR se analizan en una herramienta de análisis basada en Microsoft Excel en-casa-desarrollado para interpretar los resultados, por ejemplo, determinar el estado de la mutación de cada sonda e interpretar el efecto de la reactividad cruzada. Los resultados se exponen posteriormente a la clínica. Una limitación de análisis de punto de acceso es, por definición, que sólo las mutaciones de punto de acceso se detectan, mientras que la secuenciación de Sanger se puede identificar todas las mutaciones en el amplicón PCR. En algunos casos, en los que el análisis de la mutación no cumple con los parámetros de calidad, se llevará a cabo la secuenciación de Sanger. Para la secuenciación de Sanger, las reacciones de PCR adicionales, purificaciones de productos de reacción y la electroforesis se deben realizar, lo que requerirá dos días adicionales en el análisis de tuberías.
Conclusión
Se concluye que el análisis de mutación somática punto de acceso para
KRAS
,
PIK3CA
,
BRAF
y
EGFR Red de aspiraciones con aguja fina de los ganglios linfáticos del mediastino en pacientes con CPNM es precisa y fiable. Análisis de la mutación somática punto de acceso para
KRAS
,
PIK3CA
,
BRAF
y
EGFR
fiable se puede realizar utilizando qPCR específica de alelo con sondas de hidrólisis; la mutación es consecuencia de muestras citológicas y los tumores primarios son muy concordantes.
análisis de la mutación somática en el CPNM para la estadificación molecular y la orientación de las decisiones de tratamiento se puede realizar en el EBUS y EUS aspirados con aguja fina, que son procedimientos menos invasivos para el paciente que la mediastinoscopia rutina.
Nuestros hallazgos indican que el análisis genético molecular de NSCLC debería incorporarse a los procedimientos EBUS y EUS estándar. Este enfoque combinado resultará en el diagnóstico preciso y puesta en escena de los pacientes y también ayudará a guiar las decisiones de tratamiento óptimo, especialmente en la etapa III y IV NSCLC.
Apoyo a la Información sobre Table S1. .
General Información general del doi: 10.1371 /journal.pone.0017791.s001 gratis (XLS)
Tabla S2. .
Primer secuencias
doi: 10.1371 /journal.pone.0017791.s002 gratis (XLS) sobre Table S3.
EGFR exón 19 experimento de validación
doi:. 10.1371 /journal.pone.0017791.s003 gratis (XLS) sobre Table S4.
reactividad cruzada en ensayos de KRAS
doi:. 10.1371 /journal.pone.0017791.s004
(XLS): perfil
Reconocimientos
Agradecemos a los técnicos en las Molecular Diagnostics grupo en el Departamento de Patología LUMC para el ensayo de los protocolos en diferentes entornos biológicos y solución de problemas de los diversos aspectos del estudio.