Extracto
El desarrollo de un suministro de sangre independiente por un tumor es esencial para mantener el crecimiento más allá de cierto tamaño limitado y para proporcionar un portal para diseminación metastásica. Las células huésped derivadas endoteliales (EC) que residen en y comprometiendo la vasculatura del tumor se originan a través de distintos procesos conocidos como brotación angiogénesis y vasculogénesis. Más recientemente ECs origina directamente de las células tumorales en sí han sido descritos, aunque la base de este fenómeno sigue siendo poco conocida. Aquí describimos
in vitro
condiciones que permiten a las células de pulmón y cáncer de ovario a someterse a una transición rápida y eficiente en los EC que son indistinguibles de los obtenidos
in vivo
. Una variedad de métodos se utilizaron para establecer que los fenotipos adquiridos y los comportamientos de estos EC derivado del tumor (TDECs) se parecen mucho a los de la auténtica EC. Xenoinjertos derivados de
in vitro células
-derivado TDECs y tumorales co-inoculadas fueron también más altamente vascularizado que los tumores de control; Por otra parte, sus vasos sanguíneos eran en promedio más grandes y con frecuencia contenida mezclas de EC derivadas del huésped y TDECs derivados del inóculo inicial. Estos resultados demuestran que las células cancerosas pueden ser manipulados en condiciones bien definidas-
in vitro
condiciones para iniciar una transición tumor de células-a-CE que es en gran parte por células autónomas, altamente eficiente y se asemeja mucho a la
in vivo
proceso. Estos estudios proporcionan un medio adecuado que permita su identificación y quizás modificar los primeros pasos en la generación TDEC
Visto:. Elster JD, McGuire TF, Lu J, Prochownik EV (2013) Rápido
in vitro
Derivación del endotelio directamente de las células de cáncer humano. PLoS ONE 8 (10): e77675. doi: 10.1371 /journal.pone.0077675
Editor: Ken Arai, General de Massachusetts /Hospital Medical School de Harvard, Estados Unidos de América
Recibido: 28 de mayo de 2013; Aceptado: September 11, 2013; Publicado: 9 Octubre 2013
Derechos de Autor © 2013 Elster et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el NIH subvención RO1 CA140624 a EVP y por la beca de la post-doctoral del St. Baldrick a J.D.E. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
En sus primeras etapas, un tumor incipiente cumple su metabolismo necesita por simple difusión de nutrientes y productos de desecho [1-3]. Al llegar a una cierta masa crítica, sin embargo, la difusión ya no es suficiente para este propósito y un mayor crecimiento requiere el desarrollo de una vasculatura independiente [3,4]. Sin esto, la latencia del tumor se produce y puede persistir durante años en los que la proliferación celular tumoral tiempo adicional es equilibrada por la muerte de apoptosis o necrosis [5,6]. La inducción de un "cambio angiogénico", mediante el cual un suministro vascular ya no es limitante de la velocidad, es ahora reconocida como un determinante fundamental del crecimiento de un tumor posterior, su comunicación con la circulación sistémica, y su diseminación metastásica [3,4]. De acuerdo con estos hallazgos, la densidad vascular es un factor pronóstico bien reconocido en muchos tipos de cáncer, incluyendo cáncer de mama, neuroblastoma, y astrocitoma /glioblastoma [7-10].
El cambio angiogénico es un proceso complejo que implica la elaboración por el tumor avascular de citoquinas y factores de crecimiento incluyendo el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento de fibroblastos (bFGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) , factor de crecimiento transformante beta (TGF-β), y una variedad de angiopoyetinas [1,11-13]. Algunos de estos son quimioatrayentes que movilizan tanto en células endoteliales maduras y progenitoras (ECS) de la médula ósea e impulsan su maduración y organización en los vasos sanguíneos ( "vasculogénesis"), mientras que otros inducen el endotelio de los vasos sanguíneos adyacentes a proliferar e invadir el tumor (el "brote angiogénesis") [14-16].
El origen extra-tumoral de la neovasculatura implica que sus células componentes son tanto genéticamente normales y estables y por lo tanto en gran medida inmunes al desarrollo de la resistencia a la quimioterapia que se presenta comúnmente dentro de la población de células tumorales genómicamente inestable. De hecho, las terapias anti-angiogénesis se basan en parte en el supuesto de que la vasculatura del tumor conserva la estabilidad genómica de la población de células precursoras [17,18]. Bevacizumab, el primer inhibidor de la angiogénesis clínicamente útil, es un anticuerpo monoclonal anti-VEGF humanizado (mAb) que mostró promesa temprana en el tratamiento de una variedad de cánceres avanzados [19-22]. Sin embargo, prácticamente todas las respuestas son incompletas y /o transitoria como tumores, finalmente, volver a vascularizan y dejan de responder a un tratamiento adicional con el mAb. Como resultado, la supervivencia global del paciente ha mejorado modestamente, en todo caso [19-23].
Recientemente, nosotros y otros han proporcionado una posible explicación para las respuestas incompletas a agentes anti-angiogénesis, demostrando que una significativa sub-población de los EC asociados a tumores derivan directamente de las propias células tumorales [24-28]. Estos "derivado de un tumor EC" (TDECs) expresan una variedad de marcadores de la CE, regular por disminución marcadores epiteliales y forman vasos funcionales
in vivo
donde mezclar con EC extra-tumorally derivados. Debido a que contienen los mismos cromosomas marcadores como la población de células tumorales, se sugirió que, al igual que las propias células tumorales, TDECs eran genómicamente inestable [24-28]. De acuerdo con esta idea, el paso en serie de TDECs conduce a la eventual aparición de poblaciones derivadas clonalmente-que expresan cada vez más robustas fenotipos CE y están genéticamente relacionados con, pero distinta de las células tumorales y TDECs-pasaje temprana [24]. TDEC de han sido identificados en un modelo murino de glioblastoma [27] y en xenoinjertos de glioblastoma humano [26,28]. A principios de los estudios no concluyentes, pero también habían sugerido la presencia de TDECs en otros tumores humanos primarios [29-31]. Estos hallazgos sugieren que la generación de TDEC es un fenómeno generalizado, si no universal y que la resistencia a las terapias anti-angiogénicas puede surgir como resultado de la inherente inestabilidad genómica TDEC.
El hallazgo de que TDECs constituyen una población funcionalmente significativa y distinta CE plantea una serie de preguntas que son difíciles o imposibles de abordar mediante el estudio de los tumores primarios o xenoinjertos tumorales. Estos incluyen la naturaleza y la importancia relativa de las señales que inician la célula tumoral a la transición TDEC, el marco de tiempo durante el cual se produce esto, si el desarrollo y el mantenimiento son TDEC célula autónoma y si todas las células dentro de un tumor son capaces de generar TDECs. Se describe aquí el desarrollo de un
in vitro
sistema que nos permita abordar estas cuestiones. El uso de condiciones que favorecen el crecimiento de los ECs y imitan la hipoxia y microambiente tumoral en nutrientes privado, se muestra que un robusto fenotipo CE se puede generar fácilmente a partir de las células tumorales y que la inducción óptima requiere la cooperación sinérgica de estos factores. Las propiedades de
en vitro-
derivada TDECs son prácticamente indistinguibles de los aislados directamente de tumores. Además, su co-inoculación con células tumorales conduce al desarrollo de xenoinjertos con una vasculatura tumoral densa y, en algunos casos, una tasa de crecimiento más rápida. Por tanto, estos estudios proporcionan un medio simple y cuantitativos mediante el cual la ontogenia TDEC puede ser estudiado y manipulado desde su creación en condiciones definidas.
Resultados
Expresión de marcadores de la CE en células tumorales humanas bajo definen
in vitro | condiciones actuales
inicialmente se trató de identificar las condiciones que promueven una célula tumoral a la transición TDEC
in vitro
. Para estos estudios, se utilizó el cáncer CaLu1 no pequeñas de pulmón de células H460 humano y, el cáncer de próstata PC3 y las líneas celulares de cáncer de ovario OVCAR3. En la elección de las condiciones de cultivo, la hipótesis de que una combinación de EC-específica medio de crecimiento y la hipoxia moderada, tal vez junto con la disminución de ciertos nutrientes, podría recapitular el
in vivo
ambiente que proporciona la señal (s) para TDEC iniciación. Las células tumorales se cultivaron por lo tanto, ya sea en EC-específico medio EGM-2 + normoxia (condición 1), medio estándar de crecimiento + hipoxia (condición 2) o una combinación de medio EGM-2 + hipoxia (condición 3). Para OVCAR3 células, que también se utiliza medio Glutamax suplementado con factores específicos de la CE idénticas a las de medio EGM2 pero privados de asparagina, ácido aspártico, glutamina y prolina + hipoxia (condición 4) o el mismo medio + normoxia (condición 5). Nos referimos a este conjunto de condiciones colectivamente como "EC-promover". Las células tumorales se mantienen en su nivel recomendado medio de crecimiento en condiciones de normoxia sirvieron como controles de los puntos de partida. Los lisados celulares se prepararon a partir de estas muestras y se analizaron por inmunotransferencia para la expresión del factor de von Willebrand (vWF), que se induce de forma fiable durante la célula tumoral a TDEC transición
in vivo
[24,25]. Como se muestra en la Figura S1, la mayoría de las líneas de células tumorales cultivadas bajo condiciones estándar mostraron poca o ninguna expresión de vWF. Por el contrario, el vWF fue inducido a varios grados bajo diferentes condiciones EC-promueven con los niveles más altos y sostenidos por lo general siendo vistos bajo condiciones 3. A pesar de que el tiempo para lograr la inducción máxima varió entre las líneas ensayadas y, a veces era transitoria, por lo general era máxima entre los días 3-5 y no aumentó posteriormente.
Una vez establecido condiciones en que para lograr la expresión vWF máxima en cada línea celular, hemos ampliado nuestro análisis inicial para incluir marcadores EC-específicos adicionales utilizando ensayos basados en inmunofluorescencia, tal como se describe anteriormente [24,25]. Para estos estudios, nos concentramos en las células H460 y OVCAR3 cultivadas durante 5 días en condiciones 3 y 4, respectivamente. Las proteínas EC-específicos analizados nuevamente incluidos vWF, así como VEGFR1, VEGFR2, VE-cadherina y la molécula de adhesión CE selectivo (ESAM). Además, la unión de
Ulex europeus
lectina (E-lectina), la captación de la lipoproteína de baja densidad acetilada (AcLDL), y la morfología se siguieron como indicadores de los fenotipos de la CE más complejos. Las citoqueratinas 7 (CK7) y 19 (CK19) se examinaron también como marcadores para el fenotipo epitelial. Como se muestra en la Figura 1, todos los marcadores de la CE se indujeron en ambas líneas celulares, mientras que ambas citoqueratinas fueron notablemente regulados hacia abajo. Estos cambios implicados tanto el porcentaje de células que se tiñeron para los marcadores, así como la intensidad de la tinción de células positivas. Por lo tanto, los patrones de expresión de todos los marcadores de cerca imitaban las observadas con TDECs derivados de xenoinjertos de tumores reales [24,25].
(
A
) H460 células se hicieron crecer durante 5 d bajo condición 3 . (
B Opiniones) se cultivaron células OVCAR3 durante 5 días bajo condiciones 4. la tinción de anticuerpos para los marcadores específicos EC-vWF, VEGFR1, VEGFR2, VE-cadhherin, ESAM, unión de la e-lectina y la captación de acetilada AcLDL se realizaron en ambos conjuntos de células como se ha descrito anteriormente [24,25]. marcador tinción epitelial se realizó para CK7 y CK19. Contratinción con DAPI se realizó para visualizar los núcleos. También se incluyen imágenes de campo claro de las células tumorales y TDECs. Las imágenes se obtuvieron en cualquiera de 40-60X ampliación (confocal) o aumento de 10X (campo brillante). Los números en la esquina superior derecha de cada panel indican el porcentaje de cada población que demostró ninguna evidencia de tinción, independientemente de su intensidad. Se obtuvieron resultados similares en al menos tres experimentos independientes. Barra de escala = 25 um.
Análisis funcional de
in vitro
-derivado TDECs
Para comparar, asimismo, los fenotipos de la CE de
en vitro-
derivada TDECs con los de xenoinjertos tumorales reales, se examinaron las antiguas celdas por su capacidad para formar estructuras tubulares en medio semisólido. Para estos estudios, células H460 se cultivaron en condiciones de crecimiento estándar (control) o en condiciones de 1-3 para 5 d momento en el que se sembraron en medio semisólido y se cultivaron bajo normoxia durante 5 días adicionales. En ambas condiciones estándar y EC-promoción de 1 o 2, H460 células persistieron como células individuales o acinos amorfas formadas, mientras que el cultivo en la condición 3 mucho mayor formación del tubo (Figura 2A). La cuantificación de este mostró la formación de tubos por las células H460 que se aumentó en un 10 a & gt; 50 veces sobre la observada en condiciones de 1 o 2 y en cerca de 25 veces sobre la de condiciones estándar (Figura 2B). Aunque el número de tubos formados y su calidad eran inferiores a los procedentes de vena umbilical humana ECs (HUVECs) (Figura 2C), que eran indistinguibles de los tubos formados por
in vivo
-derivado TDECs [24,25 ]. Estas observaciones indican que TDECs H460 derivados podrían formar tubos en las condiciones de normoxia en que se desarrolló el ensayo tubo de formación y sugirió que el fenotipo TDEC podría ser estable. Para probar esto, células H460, primero expuestas a condición 3, se sembraron directamente en medio semi-vendido como se describe para la Figura 2A o se mantuvieron en condiciones estándar para un 7 d adicional antes de chapado en un ensayo de formación de tubo. Sorprendentemente, bajo este último régimen, la capacidad de formación de tubo de TDECs fue no sólo mantiene pero los tubos resultantes más de cerca se parecía a los formados por HUVECs (Figura 2C). Por lo tanto, mientras que TDEC potencial de formación de tubo mostraron la necesidad de hipoxia, que se mantuvo durante al menos 2 semanas después de un retorno a las condiciones de crecimiento estándar.
(
Un
) fueron inducidos células tumorales H460 para formar TDECs por 5 d de la exposición a las condiciones indicadas. 2 x 10
4 células de cada grupo se sembraron sobre Matrigel en un ensayo de formación de tubos en condiciones de normoxia a 5 d, como se ha descrito anteriormente [24,25]. células H460 tratadas crecidas en condiciones estándar sirvieron como controles. Se muestran los campos microscópicos típicos de luz. Todas las fotos se muestran en ampliaciones idénticos. (
B Opiniones) Los resultados mostrados en (
Un
) se representan gráficamente como el número medio de tubos, completamente encerrado por campo ± SEM. los valores p se obtuvieron usando ANOVA de una vía (**: p & lt; 0,01). (
C
) células tumorales H460 se cultivaron en condiciones estándar o la condición 3 para los tiempos indicados. La mitad de las células se sembraron inmediatamente en Matrigel y se hicieron crecer en condiciones de normoxia para un 6 d adicional. El resto de las células se volvió a condiciones estándar de 7 d antes de ser chapada en Matrigel para 6 d para evaluar la persistencia del potencial de formación de tubo. HUVECs fueron utilizados como control positivo para la formación del tubo. fotografías de campo claro se tomaron a un aumento de 10X. Se obtuvieron resultados similares en cuatro experimentos independientes (A) y dos experimentos independientes (C). Barra de escala = 100 um.
Un ensayo basado en biosenser para vigilar
in vitro
TDEC inducción Hoteles en
Para confirmar y cuantificar mejor el
in vitro
transición cellTDEC tumor, que genera poblaciones separadas de células H460 y OVCAR3 expresan de forma estable la proteína verde fluorescente mejorada (EGFP) bajo el control del receptor de la angiopoyetina EC-específico (Tie2) promotor [32]. En condiciones de crecimiento estándar, estas células expresan EGFP poco, incluso cuando evaluó por citometría de flujo (Figura 3). Después de la inducción TDEC bajo condición 3 para células H460 y la condición 4 para las células OVCAR3, 3-5 veces los aumentos de la señal de EGFP se observaron rutinariamente (Figura 3). Por lo tanto, la inducción Tie2-EGFP sirve como un simple, reproducible y cuantificable ensayo sustituto para la diferenciación TDEC que, en células vivas, refleja con precisión los resultados obtenidos por más ensayos estándar de fenotipo CE. También proporciona una evidencia directa de la transcripción de la regulación de al menos algunos de los marcadores durante el curso de la diferenciación TDEC y ayuda a comprobar su coordinar la regulación durante un marco de tiempo de 4-5 días (Figura S2).
cultivos separados de células tumorales H460 y OVCAR3 fueron establemente cotransfectadas con Tie2-EGFP plásmido y pFR400 que codifica una forma mutante de la dihidrofolato reductasa [36,37] y seleccionado en G-418 y concentraciones crecientes de metotrexato para permitir la amplificación de los dos vectores integrados en tándem y una intensidad de señal de EGFP aumento correspondiente. Las células se expusieron a condiciones mostradas anteriormente para inducir el fenotipo máxima TDEC (es decir, condición 3 para H460 de y la condición 4 de OVCAR3) y en comparación con las células de control cultivadas bajo condiciones estándar. (
Un
) micrografías de fluorescencia de cada línea celular después de cinco días de crecimiento en cada conjunto de condiciones. (
B Opiniones) Flujo de análisis de citometría de las mismas células. Los resultados representativos de al menos tres experimentos independientes se representan. Barra de escala = 25 um.
Los resultados anteriores, junto con las representadas en la figura 2, sugieren que la mayoría de las células tumorales se vea plasticidad suficiente para permitir su
in vitro
transición hacia TDECs. Para probar esto directamente, se examinaron 80 clones de células individuales derivados de células H460 y OVCAR3 para determinar el grado en que se podrían expresar marcadores de la CE. Como se muestra en la Tabla 1, virtualmente cada clon mostró captación de alto nivel de AcLDL, la unión E-lectina y la expresión EGFP impulsada por Tie2 en condiciones que promueven la EC-mientras que sólo el débil expresión de estos marcadores puede ser detectada en células mantenidas en condiciones estándar. Por lo tanto, como se sugirió anteriormente para
en Vivo-
TDECs derivados [25], la adquisición del fenotipo CE no se limita a cualquier subconjunto celular particular.
H460
OVCAR -3
% + células (Std Estado /Condición 3)
% + células (Std Estado /Condición 4) guía Clon Nº
E-lectina
AcLDL
Clon Nº
Tie-2-GFP
Clon Nº
E-lectina
AcLDL
Clon No.
Tie-2-GFP
1<3/90-95<3/>9521<3/90-9541<3/80<3/9061<3/>952<3/90-95<3/>9522<5/90-9542<3/90<3/9062<3/>9535/80<3/90-9523<5/>9543<3/>95<3/9563<3/<345/>95<3/>9524<3/>9544<3/>95<3/9064<3/>9555/>95<3/80253-5/>9545<3/>95<3/9065<3/>9565/>95<3/90-9526<3/>9546<3/90<3/9566<3/>9575/90-95<3/>9527<3/<347<3/80<3/9567<3/>9585/>955/90-9528<3/>9548<3/90<3/9068<3/<395/>955/>9529<3/90-9549<3/90<3/9069<3/>95105/80-855/>9530<3/>9550<3/50<3/9070<3/<31110/>955/90-9531<3/>9551<3/>95<3/9571<3/>9512<3/>95<3/>9532<3/<352<3/<3<3/5072<3/>95135/>95<3/>9533<3/>9553<3/30-40<3/9573<3/>951410/>953/>95345/>9554<3/30-40<3/8074<3/<31510/90-95<3/>9535<3/>95555/90-95<3/9575<3/<316<3/90-953/>9536<3/>95565/>95<3/9576<3/>9517<3/90-95<3/>9537<3/>95575/>95<3/9577<3/>95185/>953/>9538<3/<3585/90-95<3/9578<3/>95195/>95<3/>9539<3/<3595/>95<3/9579<3/<320<3/>95<3/90-95405/>9560<3/>95<3/9580<3/>95Table diferenciación 1. endoteliales de la línea de tumor humano clones de células individuales. Ordenando de células se utilizan para sembrar H460 individuo y las células OVCAR3 en placas de 96 pocillos. 20 clones derivados de cada tipo de células se expandieron y se evaluaron en condiciones estándar o EC-promueven para E-lectina de unión y la captación AcLDL. También se evaluaron otros 20 clones adicionales cada derivadas de células OVCAR3-Tie2-GFP H460-Tie2-GFP y para la expresión de GFP. El porcentaje de células positivas para cada uno de estos marcadores EC-específicos siguientes 5 días de propagación se mide en condiciones o condiciones 3 o 4 estándar y los dos valores obtenidos están separados por el "/". Estos estudios no tienen en cuenta las grandes diferencias en la intensidad del marcador que se produjeron tras la propagación de hipoxia, que se ilustran en la figura S2. Descargar CSV CSV
TDECs incorporan en la vasculatura del tumor, mejorar el crecimiento del tumor y aumentar la densidad de los vasos
Nuestros hallazgos previos de que
en Vivo-
TDECs derivados pueden incorporar en el tumor y la neo-vascularización aumentar la densidad de los vasos sanguíneos [24,25] sugirió que
in vitro
-derivado TDECs podría comportarse de manera similar. células tumorales H460 Para abordar esto, etiquetados-EGFP [25] se cultivaron bajo condición 3 para 5 d, se mezcla con un exceso de 20 veces de
Discosoma
sp.
proteína fluorescente roja (DsRed )-etiquetados H460 células tumorales y propagada tal como xenoinjertos subcutáneos en ratones inmunodeficientes. Las inyecciones control se realizaron de forma idéntica pero con la población EGFP + cultivadas bajo condiciones estándar. Los tumores que surgen de la anterior mezcla de células crecieron significativamente más rápidamente que las de este último (Figura 4A). La microscopia de fluorescencia de las secciones congeladas también mostró que los vasos sanguíneos de los tumores antiguos que se enriquecen de EGFP + EC (Figura 4B), lo que indica una predilección por
in vitro
-derivado TDECs para incorporar en la vasculatura tumoral. Por último, los vasos sanguíneos de los antiguos tumores eran más densas y más grandes que los de los últimos tumores (Figura 4C-4F). Experimentos similares realizados con células OVCAR3 mostraron que los xenoinjertos de tumores resultantes, mientras que no está creciendo mucho más rápido que sus homólogos de control, contenían una mayor proporción de EGFP + TDECs luminales y una vasculatura densa (Figura S3). Por lo tanto, la co-inyección de
in vitro-
deriva TDECs facilita la neovascularización tumoral, la cual, en algunos casos, permite el crecimiento del tumor acelerado.
H460 se mantuvieron células EGFP-etiquetados para 5 d bajo la condición 3. el TDECs resultantes se mezclaron luego con un exceso de 20 veces de las células tumorales H460 etiquetados-DsRed cultivadas bajo condiciones estándar y un total de 10
6 células se inocularon por vía subcutánea en los flancos de ratones desnudos y se propagan como tumor xenoinjertos. tumores de control consistieron en la misma mezcla de células tumorales marcadas con DsRed y células tumorales EGFP-tagged propagadas en condiciones estándar. (
Un
) Representación gráfica de crecimiento del tumor. Los volúmenes tumorales se determinaron en los tiempos indicados y se representaron gráficamente las medias (± SEM). El
valor de p
registrado en el volumen del tumor el día 17 se obtuvo utilizando la prueba t de Student de una cola. (
B Opiniones) imágenes de fluorescencia confocal de secciones congeladas Los tumores de cada uno de los dos grupos. Barra de escala = 25 um. (
C
) de baja potencia con tinción de hematoxilina-eosina secciones de tejido incluidas en parafina representativas tomadas de tumores típicos en cada uno de los dos grupos. (
D
) Representación gráfica de la media de vasos sanguíneos tumorales por campo (± SEM) en los campos generales de cada tipo de tumor. El número total de campos examinados fue de 32 para ver estado 3 tumores y 24 para ver estado tumores estándar. Sólo los buques que presentan lúmenes distintos y que contienen las células rojas de la sangre, indicados por
negro
flechas
, se contaron. (
E
) representación gráfica de la superficie de sección transversal de los vasos sanguíneos media (± SEM) en los dos tipos de tumores. El número total de buques medidos fue de 85 tumores de la condición estándar y 248 de la Condición 3 tumores. (
F
) La media del número de vasos sanguíneos tumorales con áreas de sección transversal (± SEM) que eran pequeñas (30 a 499 um
2), media (500 a 1.999 um
2) , amplio (2000-4999 um
2), y muy grande (≥ 5000 um
2), tal como se mide utilizando el software ImageJ. El análisis estadístico se realizó utilizando
t
un test de Student de una cola (*,
p Hotel & lt; 0,01; **,
p Hotel & lt; 0,001; ***,
p Hotel & lt; 0,0001). Se obtuvieron resultados similares en dos experimentos independientes.
Discusión
Las observaciones recientes en una variedad de diferentes tipos de cáncer han indicado que los EC que comprende el tumor neo-vascularización puede provenir directamente del tumor células propias y coexistir con EC derivados de fuentes extra-tumoral [24-28]. Al igual que sus predecesores de células tumorales, estas son TDECs genómicamente inestable [24]. Esto puede conferir una ventaja de supervivencia en la cara de las terapias anti-angiogénesis, por lo tanto quizás en cuenta los efectos transitorios de estos agentes [19-22]. De hecho, hemos observado que
en vitro-
derivado TDECs tales como los descritos aquí pueden ser derivados en medio EGM2 que carecen de VEGF y por lo tanto parecen ser independientes de este factor de crecimiento, incluso en ausencia de la selección previa. Por otra parte, los niveles extremadamente bajos de transcritos de VEGF que se detectaron en células H460 y OVCAR3 de tiempo real QRT-PCR, no cambiaron significativamente después de la inducción del fenotipo TDEC (no mostrado).
Nuestros hallazgos indican que tumor Las células pueden ser manipuladas
in vitro
en condiciones definidas para generar TDECs que son tanto bioquímica y funcionalmente similares a las que se originan
in vivo
[24,25]. Que prácticamente todas las células tumorales pueden adquirir EC-como propiedades (Tabla 1), mientras que perder sus características epiteliales es coherente con nuestra anterior conclusión de que los clones de una sola célula derivadas de células tumorales pueden generar TDECs
in vivo
[25]. Por lo tanto, la capacidad para la generación de TDEC parece ser un común, si no universal, rasgo que es compartida por la mayoría de la población de células tumorales y de células es autónomo. La proporción variable de TDECs encontrado en diferentes tumores [25] puede por lo tanto ser menos indicativo de cualquier capacidad generacional inherente de los procesos competidores, como el que brota la angiogénesis y vasculogénesis, condiciones sub-óptimas para la inducción TDEC y la falta de otras presiones selectivas como antes terapéutica intervenciones. La propiedad parece estar confinado a poblaciones de células tumorales como no hemos observado ECs a surgir a partir de células no transformadas, tales como riñón humano embrionario o primaria o bronquial inmortalizadas y células epiteliales de la glándula mamaria, cuando se cultiva en condiciones idénticas a las descritas en el presente documento (no se muestra).
la capacidad de generar TDECs bajo definidos
in vitro | condiciones actuales respuestas a varias preguntas que no se pueden tratar fácilmente utilizando
in vivo y modelos en el microambiente tumoral es a menudo heterogénea , sujeta a cambios rápidos [1,33] y donde la formación TDEC es probable que competir con los procesos de remodelación vascular adicionales. Estas preguntas incluyen la naturaleza y las interrelaciones de las señales inductivas para TDECs y su calendario. Los candidatos obvios para tales moléculas de señalización incluyen factores EC-específicas de crecimiento tales como VEGF, bFGF y TGF-beta, así como la hipoxia, todas las cuales son fuertes inductores de la neovascularización tumoral [3-5,11-14]. Nuestros resultados indican que, al menos
in vitro
, ni los factores de crecimiento suministrados por EC-específica medio de crecimiento ni la hipoxia solos son especialmente potentes inductores de la célula tumoral a la transición TDEC pero que, en combinación, son altamente sinérgico. Esto no es totalmente inesperado ya que estos factores han sido conocido durante mucho tiempo que es necesario para la generación y mantenimiento de la neovasculatura del tumor que surge a partir de fuentes más tradicionales [34,35]. En algunos casos, como se ejemplifica por nuestros resultados con células OVCAR3, otros factores, tales como la privación de nutrientes selectiva o acidosis pueden desempeñar funciones de apoyo adicionales y aún no se han explorado más a fondo. La naturaleza precisa de estos efectores y su importancia relativa para la generación de TDEC es probable que sean bastante depende de las propiedades inherentes de los tipos de tumores específicos, cambios secundarios adquiridos y de otros factores ambientales que compiten y cooperantes. También es probable que la longitud de la exposición a varios factores inductivos, así como cuando durante la célula tumoral a período de transición TDEC que son operativos jugará un papel importante. Todas estas preguntas deben ser direccionable usando los tipos de ensayos descritos aquí, que permiten el control preciso y el momento de las señales ambientales potenciales
.
Nuestros estudios previos habían indicado que tanto la expresión de marcadores específicos de CE y la la función de
in vivo
-derivado TDECs fuera de línea celular dependiente y esto fue confirmado por los estudios actuales. Quizás el ejemplo más obvio de esto fue ilustrada por las diferencias entre H460 y OVCAR3 TDECs con respecto a su capacidad de afectar a las tasas de crecimiento de xenoinjertos de tumores y el tamaño del vaso (Figuras 4 y S3). Si esto refleja las diferencias funcionales intrínsecas de TDECs, los patrones de crecimiento de las células tumorales propiamente dichas, las interacciones estroma o una combinación de estos factores es actualmente desconocido. La evidencia definitiva para este tipo de relaciones causa-efecto espera la confirmación futuro.
La capacidad de recapitular la célula tumoral a la transición TDEC eficiente, rápido y bajo evaluaciones más exhaustivas bien definidos y fácilmente alterables condiciones ahora deben permitir de las funciones precisas desempeñado por los factores de inducción individuales para facilitar este proceso, así como su importancia relativa. La facilidad con que TDECs se puede generar también sugiere que pueden servir como reactivos valiosos para ser utilizado en la identificación de nuevos agentes que impiden este proceso.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
Todos los estudios del ratón de acuerdo con la Ley de Bienestar Animal y la política de Servicio de Salud Pública y aprobados por la Universidad de Cuidado de Animales institucional de Pittsburgh y el empleo Comisión (IACUC) (Número de Permiso: 0812276). Los animales fueron alojados en unidades libres de patógenos en el Hospital de Niños de Pittsburgh, en cumplimiento de la normativa del IACUC.
Animales
La edad y ratones nu /nu se compraron de Harlan Sprague-Dawley Laboratorios género coincide con ( Indianápolis, IN). Se realizaron estudios de xenoinjertos de tumores como se describe anteriormente [24,25].
in vitro
crecimiento de inducción de TDECs y xenoinjerto de tumor
carcinoma de pulmón humano NCI-H460 (H460) , Calu-1 de carcinoma humano de pulmón, cáncer de próstata PC3, y líneas celulares de cáncer de ovario OVCAR3 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA) y se mantuvieron en condiciones de normoxia "estándar" como se ha descrito anteriormente [24,25]. El medio de cultivo incluye alfa medio esencial mínimo ( "MEM") para H460 y PC3 y medio 5A de McCoy para Calu-1 y OVCAR3, tanto suplementado con 10% de suero fetal bovino, glutamina 2 mM, 110 ug /piruvato ml, mínimo no esencial aminoácidos, 100 ug /ml de estreptomicina y 100 unidades /ml de penicilina G). células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) y de medio de crecimiento EC-específica EGM-2 fueron adquiridos de Cambrex Bio Science (Walkerville, MD). Todas las líneas celulares se mantuvieron en un CO 5%
2 atmósfera a 37ºC. Para la mayoría de las líneas tumorales, la inducción de un fenotipo CE se consiguió mediante el cultivo de células bajo una variedad de condiciones. Estos incluyeron medio EGM-2 en condiciones de normoxia (condición 1); medio estándar en condiciones de hipoxia [1% de O
2 en una incubadora hipóxico de guantera (Coy Laboratory Products Inc., Grass Lake, MI)] (condición 2); o medio EGM2 + hipoxia (condición 3). Para algunos experimentos, la inducción óptima Adicionalmente se requiere deficiente en nutrientes medio [medio D-MEM que carece de la Glutamax aminoácidos no esenciales asparagina, ácido aspártico, glutamina, y prolina (Invitrogen, Inc.)] en condiciones de hipoxia pero por lo demás que contiene el crecimiento idéntico factores y suplementos como medio EGM-2 (condición 4). Una condición final incluyó el medio deficiente en nutrientes anterior más normoxia (condición 5). envasado y las infecciones de lentivirus para producir EGFP o DsRed-etiquetados células se realizaron como se describe anteriormente [25].
xenoinjertos de tumores subcutáneos se obtuvieron mediante la inoculación de 10
6 células tumorales, que se componen de TDECs EGFP-etiquetados y células tumorales DsRed-etiquetados (1:20), por vía subcutánea en los flancos de ratones nu /nu como se describe anteriormente [25]. mediciones de volumen del tumor se realizaron cada 2-3 días hasta que el diámetro máximo permitido de ca. 2 cm se alcanzó (típicamente 4-6 wks tanto para células H460 y OVCAR3) momento en el que los tumores se extirparon. fragmentos separados de tumores se usaron para la preparación de secciones congeladas y embebidos en parafina.
Apoyo a la Información
Figura S1.