Extracto
Ingenol-3-angelato (I3A) es un no tumoral promover compuesto similar a un éster de forbol identificado en la savia de
Euphoria peplus.
similares a tumor promoción de ésteres de forbol, I3A es un análogo de diacilglicerol (DAG) que se une con alta afinidad a los dominios C1 de PKC, recluta PKC a las membranas celulares y promueve la activación de la enzima. Numerosas actividades contra el cáncer se han atribuido a I3A y atribuido a los efectos del I3A sobre PKC. Mostramos aquí que I3A también se une y activa los miembros de la familia Ras RasGRP de activadores que conducen a la fuerte elevación de Ras-GTP y la participación de la cascada de la quinasa Raf-MEK-ERK. En respuesta a I3A, las proteínas recombinantes que consisten en GFP fusionado por separado a de longitud completa RasGRP1 y RasGRP3 fueron reclutados rápidamente a las membranas celulares, en consonancia con la unión directa del compuesto al dominio C1 de RasGRP. En el caso de RasGRP3, el tratamiento IA3 llevó a la fosforilación reguladora positivo en T133 y la activación de la quinasa reguladora del candidato PKC. I3A el tratamiento de líneas celulares de linfoma B seleccione no Hodgkin resultó en cambios cuantitativos y cualitativos en proteínas miembros de la familia Bcl-2 y la inducción de la apoptosis, como se ha demostrado previamente con el Bryostatina analógica DAG 1 y su pico análogo sintético. Nuestros resultados ofrecen nuevas perspectivas sobre las propiedades anticancerígenas de I3A, apoyar la idea de que RasGRPs representan posibles objetivos terapéuticos de cáncer junto con la PKC, y ampliar la gama conocida de ligandos para la regulación RasGRP
Visto:. Canción X, Lopez- Campistrous A, Sun L, Dower NA, Kedei N, Yang J, et al. (2013) RasGRPs son el objetivo de la Lucha contra el Cáncer Agente Ingenol-3-angelato. PLoS ONE 8 (8): e72331. doi: 10.1371 /journal.pone.0072331
Editor: P. Jin Cheng, H.Lee Moffitt Centro de Cáncer & amp; Research Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 25 Febrero, 2013; Aceptado: July 8, 2013; Publicado: 21 Agosto, 2013
Este es un artículo de acceso abierto, libre de todos los derechos de autor, y puede ser reproducido libremente, distribuir, transmitir, modificar, construir, o de otra forma utilizado por cualquier persona para cualquier propósito legal. El trabajo está disponible bajo la advocación de dominio público Creative Commons CC0
Financiación:. La investigación fue apoyada por subvenciones a JCS de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR MOP14630 subvención, http: //www.cihr-irsc .gc.ca), la Sociedad canadiense Instituto de Investigación del cáncer (CCSRI subvención 018.453, http://www.cancer.ca/Research.aspx), Fundación del cáncer de Alberta (ACF conceder 26050, http://albertacancer.ca), y Alberta Soluciones para el ingenio-Salud (200100408 http://www.aihealthsolutions.ca). La investigación también fue apoyada por el Programa de Investigación Intramural del Centro para la Investigación del Cáncer, Instituto Nacional del Cáncer, de los Institutos Nacionales de Salud (Proyecto Z1A BC 005270). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
diacilglicerol (DAG) es un segundo mensajero potente que se genera en las células en respuesta a la estimulación del receptor de membrana de metabolismo de los fosfolípidos. análogos de DAG y DAG como PMA (forbol 12-miristato 13-acetato) formas convencionales y novedosos de vinculación de la proteína quinasa C (PKC) a través de un dominio conservado llamado C1. Este proceso contribuye a la PKC localización de la membrana y la activación de la enzima. La exposición prolongada a los análogos de DAG también puede afectar negativamente a la actividad de PKC mediante la degradación enzimática inducida. Algunos análogos de DAG, tales como PMA, son promotores de tumores potentes. Otros análogos de DAG, como prostratina y briostatina 1, son los promotores no tumorales o de hecho pueden inhibir el desarrollo de tumores. análogos de DAG medicinales tales como briostatina 1 ejercen una variedad de células anti-cáncer y efectos moduladores inmunes. Basado en el fomento de los datos preclínicos, briostatina 1 ha sido objeto de ensayos clínicos de cáncer extensa (http://clinicaltrials.gov/ct2/results?term=bryostatin).
Otro análogo DAG medicinal de interés clínico es ingenol -3-angelato (I3A). I3A fue identificado como un agente activo en la savia de
Euphorbia peplo
, que tiene una historia de uso en la medicina tradicional, incluyendo el tratamiento de los cánceres de piel [1]. Pep005, una formulación de aplicación tópica de I3A, está siendo evaluado en ensayos clínicos vigorosamente (http://clinicaltrials.gov/ct2/results?term=pep005&pg=2). Pep005 se ha mostrado eficaz en el tratamiento de la queratosis actínica [2] y está siendo desarrollado para el tratamiento del carcinoma de células basales y el carcinoma de células escamosas [1]. En diferentes modelos experimentales, I3A puede inducir necrosis de las células tumorales principal [3], la apoptosis [4] y la senescencia [5]. De células tumorales extrínseca efectos contra el cáncer de I3A incluyen alteración de la vasculatura del tumor [6], el reclutamiento de neutrófilos tumoricidas [7] y la generación de células T citotóxicas con actividad regresión de tumor [8]. I3A purificada se une a isoformas de PKC clásicas y novedosas
in vitro
[9]. I3A el tratamiento de las células cultivadas resultados en rápida reubicación de estas enzimas a las membranas celulares [9]. Por lo tanto, algunos de los efectos biológicos probablemente surgen de la activación de la PKC I3A en las células vivas.
A pesar de que las primeras investigaciones sobre DAG DAG y análogos se centraron en su regulación de los miembros de la familia de PKC, ahora está claro que las familias adicionales de proteínas existen con los dominios C1-DAG unión homólogos y que estas familias sirven papeles biológicos críticos [10], [11]. Los RasGRPs son reguladores positivos de la pequeña GTPasa Ras. Los chimerins funcionan como reguladores negativos de la pequeña GTPasa Rac, que regula el citoesqueleto de actina. (Relacionado quinasa-quinasa distrofia miotónica vinculante Cdc42) MrCk señales aguas abajo de la pequeña GTPasa Cdc42, controlar la formación de filopodios y que influyen en la invasión tumoral. Munc13 miembros de la familia regulan fusión de la membrana de la vesícula sináptica y la actividad sináptica. miembros de la familia D proteína quinasa desempeñan un papel clave en la proliferación celular y la viabilidad. quinasas DAG convierten DAG a ácido fosfatídico, la atenuación de señalización a través de las familias de proteínas de DAG-sensible anteriores, así como la mejora de las vías de señalización potencialmente sensible a ácido fosfatídicos. La comprensión de la selectividad de los agentes terapéuticos dirigidos a los dominios C1-DAG de unión de estas otras clases de proteínas de unión a DAG tanto, es importante para la comprensión de su potencial terapéutico y sus mecanismos de acción.
Una expresión de alto nivel de RasGRP1 y RasGRP3 muestra la distribución tisular restringida, con la expresión prominente en los linfocitos [12]. Un creciente cuerpo de evidencia apoya la hipótesis de que un papel clave de estas proteínas es funcionar aguas abajo de los receptores de las células inmunes en B y T [12]. la estimulación del receptor inmune conduce a la activación de la fosfolipasa C y la acumulación de DAG en las membranas. DAG influye RasGRP1 y RasGRP3 a través de dos mecanismos coordinados. En primer lugar, los dominios C1 de RasGRP1 y RasGRP3 unen DAG y éster de forbol [13], [14], haciendo que los RasGRPs a ser reclutados para las membranas celulares donde se encuentran con su sustrato, lipidada Ras. La deleción del dominio C1 causa la pérdida de éster de forbol de respuesta [15]. Además, RasGRP1 y RasGRP3 se someten a una activación de la fosforilación por PKC, en sí activadas por DAG [16] - [19]. la activación de Ras por RasGRPs es importante para la diferenciación de timocitos, la función efectora de células T, y de linfocitos homeostasis [12]. RasGRP4, como RasGRP1 y RasGRP3, también es probable que se une y activa DAG Ras [20], [21], aunque la regulación por la PKC no se ha documentado. RasGRP4 muestra la expresión prominente en los mastocitos [21], pero también se encuentra en otros linajes mieloides y principios de los timocitos [22], [23].
Hemos argumentado que RasGRPs podrían constituir dianas farmacológicas viables que pudieran ser manipulados con DAG análogos a los extremos clínicamente beneficiosos [24]. En particular, hemos demostrado que seleccionan líneas celulares derivadas de ciertas formas de linfoma de B-no-Hodgkin (LNH-B) experimentan apoptosis cuando RasGRPs se estimulan con análogos de DAG como briostatina 1 o el análogo de "pico" sintético. Al principio, nos centramos en DAG apoptosis inducida analógica en la línea celular de Toledo, lo que probablemente surgió de un tumor maligno derivado de centro germinal. Hemos demostrado que la apoptosis se produjo dentro de las 48 horas e involucró a la fosforilación de pro-apoptóticos de la BH3-única proteína Bim través de la vía RasGRP-Ras-Raf-MEK-ERK [25]. Más recientemente, hemos descubierto un segundo mecanismo de la apoptosis inducida por la que fue visto en el linfoma de Burkitt línea (BL) -derivado celular, BL-2, y el linfoma de células en 5 de 6 manto (MCL) -derivado líneas celulares [26]. La mayoría de estas líneas celulares se Bim deficientes y el mecanismo de apoptosis se asoció lugar con los cambios cuantitativos en otros miembros de la familia Bcl-2: expresión de la BH3-only pro-apoptóticos miembro de la familia Bik generalmente aumenta mientras que la de los miembros anti-apoptóticos de Bcl XL y MCL-1 disminuyó. Este segundo mecanismo procedió mucho más lenta que la observada en las células Toledo.
A continuación, se muestra que RasGRPs son objetivos de I3A en células cultivadas. Además, el tratamiento I3A de líneas de células B-NHL representativos activa los dos mecanismos RasGRP acoplada previamente documentadas que conduce a la apoptosis.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
Los experimentos con animales habían sido hechas de acuerdo a los protocolos aprobados por el Comité de política de Ciencias de la Salud y Bienestar Animal de la Universidad de Alberta, de acuerdo con el Consejo canadiense para el Cuidado de Animales Directrices.
Reactivos
Ingenol-3-angelato fue comprado de Calbiochem (La Jolla, CA) y se disolvió en DMSO a 1 mM. La madre se diluyó a una concentración final de 100 nM en medio salvo indicación en contrario y en comparación con DMSO diluido de modo similar. inhibidores de MEK y reactivos para la apoptosis que estudian se han descrito anteriormente [25], [26]. El PMA fue de los laboratorios de LC (Woburn, MA), Gö6983, cóctel proteasa conjunto 1 y NP-40 eran de Calbiochem (Billerica, MA).
estaban manipulados Cell Cultura y las células
Rat2 para expresar pBabePuro el vector de retrovirus o los derivados vector que contiene ADNc que codifican RasGRP1, RasGRP3 o RasGRP4 como se describe anteriormente [15]. células Rat2 fueron cultivadas en DMEM que contiene 10% de suero bovino fetal inactivado por calor complementado con penicilina, estreptomicina y glutamina (Gibco, Burlington, ON, Canadá). líneas celulares de linfoma humano se cultivaron en medio RPMI-1640 (Gibco) suplementado como anteriormente. Los orígenes de las líneas celulares se han publicado [25], [26]. La línea celular Ramos B, LNCaP línea celular de próstata y HEK-293 que expresan GFP-RasGRP3 [28] fueron cultivadas en medio RPMI-1640 suplementado con 10% de FBS y glutamina 2 mM (ATCC, Manassas, VA).
ratones
Rasgrp1 - /- ratones
se han descrito anteriormente [27] y se mantuvieron en el C57BL /6J. Ratones C57BL /6J se utilizaron como controles de tipo salvaje.
I3A in vitro Estudios de unión
afinidades de unión de I3A al dominio RasGRP1 C1 y a RasGRP3 se determinaron como se describe anteriormente [13], [ ,,,0],14]. La temperatura de incubación, optimizado para la estabilidad de las proteínas en condiciones de unión, fue de 37 ° C para el dominio RasGRP1 C1 y 18 ° C para RasGRP3.
Análisis de proteínas por inmunotransferencia
Análisis de activo y el total de Ras, pErk1 /2, los miembros de Erk1 /2 y Bcl-2 de la familia, a menos que se indique lo contrario, que se describió anteriormente [25], [26]. Para analizar la fosforilación RasGRP3, células Ramos se trataron con PMA, I3A o DMSO vehículo de control como se indica por 30 minutos después de lo cual se recogieron en tampón de lisis (1% NP-40 en PBS con cóctel inhibidor de proteasa Set 1). En algunos casos, se trataron previamente las células durante 30 min con el inhibidor de pan-PKC Gö6983 (5 M). La inmunotransferencia se realizó como se describe anteriormente [28] utilizando los siguientes anticuerpos: pRasGRP3T133 (Epitomics ab124823), RasGRP3 (Cell Signaling,#3334), PKC (Santa Cruz, sc-937), pPKCδ Ser299 (Epitomics ab133456), pErk1 /2 ( T202 /Y204, Señalización celular,#9106), ERK1 /2 (Cell Signaling,#9102), β-actina (Santa Cruz, sc-47778). Después del desarrollo de las señales por ECL (quimioluminiscencia potenciada), las películas fueron escaneados y cuantificación de la señal se ha realizado mediante ImageJ (National Institutes of Health).
Microscopía Confocal
La translocación de GFP RasGRP1 en las células LNCaP se evaluó como se describe [29]. 60.000 células LNCaP se sembraron en ibidi mu-platos (ibidi LLC, Verona, WI) y después se transfectaron 48 h más tarde con GFP-etiquetados plásmido RasGRP1 codifican usando reactivo Lipofectamine en combinación con Plus reactivo de acuerdo con el fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA recomendaciones). Después de 24 horas, las células se trataron con 1,000 nM de PMA o I3A en medio confocal (de Eagle modificado por Dulbecco sin rojo fenol suplementado con 1% de FBS), y las imágenes con lapso de tiempo se recogieron cada 30 s usando el software Zeiss AIM. Imaging fue con un sistema de microscopía confocal Zeiss LSM 510 o Zeiss LSM 710 (Carl Zeiss, Inc.) con un microscopio invertido Axiovert 100 M que opera con un láser de argón 25 mW sintonizado a 488 nm. A 63 × 1,4 NA Zeiss Plan-Apocromático objetivo de inmersión en aceite se utiliza junto con diversos zooms (de 1,4 a 2 veces). Para crear un vector para estos estudios se insertó hRasGRP1 (NM-005739) en el vector de pQB125-Fn1 por clonación clásica utilizando
Nhe
escisión con enzimas de restricción. Las secuencias de ADN de los constructos se confirmaron por análisis de secuencia (ADN, Minicore, CCR, NCI, NIH).
Membrana de fraccionamiento
HEK-293 que expresan GFP-RasGRP3 [28] fueron tratados con PMA o I3A (1000 nM o 100 nM) durante 30 min o DMSO como control del vehículo. Al final del tratamiento las células se lavaron en PBS, eliminado de las placas por rascado y se sedimentaron por centrifugación a baja velocidad (5000 rpm durante 5 min en una microcentrífuga Eppendorf refrigerada). Las células se sometieron a ultrasonidos (3 × 6 seg) en PBS suplementado con un cóctel inhibidor de la proteasa conjunto 1 y después se centrifugó a baja velocidad como anteriormente para eliminar las células intactas. Las alícuotas de este sobrenadante en representación de "proteína total" se reservaban para el análisis. A continuación, el resto del sobrenadante se sometió a centrifugación a alta velocidad (100.000 xg durante 1 hr) para producir un sobrenadante "fracción citoplásmica". El sedimento de alta velocidad se lavó, se disolvió en 1% de Triton X-100, y el material insoluble en detergente se eliminó por centrifugación a alta velocidad, como antes. El sobrenadante final resultante representa la "fracción de membrana". Las fracciones de proteínas totales, citoplásmicos y de membrana fueron sometidas a electroforesis de poliacrilamida SDS e inmunotransferencia, con la misma proteína cargada en cada carril.
apoptosis y la proliferación de células Los ensayos
Los métodos para el estudio de apoptosis inducida por fármacos y el ensayo MTT para la acumulación de células viables se han publicado [26].
Resultados
la unión de I3A a RasGRP1 y RasGRP3 in vitro
Tanto el RasGRP1 y la RasGRP3 C1 dominios anteriormente se muestra de obligar a los análogos de DAG que incluyen ésteres de forbol [13], [14]. Modeling indica que Ingenol 3-ésteres se unen a los dominios C1 de una manera similar a los ésteres de forbol y DAG [30]. De acuerdo con ello, se evaluó la unión de I3A usando un ensayo de competición utilizando [
3H] forbol 12,13-dibutirato, en presencia de 100 mg /ml de fosfatidilserina (Tabla 1). RasGRP1 (C1 dominio) y RasGRP3 (de longitud completa) unido I3A con 2- y 9- veces mayor afinidad, respectivamente, que ataron el éster de forbol PDBu. En comparación con PKCa, RasGRP1 y RasGRP3 obligado I3A con afinidades aproximadamente similares, lo que indica que no hubo selectividad entre estas dos familias de objetivos, al menos
in vitro.
I3A Activa RasGRPs en cultivos de fibroblastos y células T Jurkat
fibroblastos Rat2 no lo hacen de forma detectable RasGRPs endógenos exprés. Así, las células Rat2 ingeniería genética para expresar RasGRPs individuales, en comparación con las células de ingeniería genética para expresar el vector vacío, proporcionar un sistema conveniente para determinar si un análogo de DAG puede activar RasGRPs. En comparación con las células que expresan el vector vacío, las células que expresan Rat2 RasGRP1 mostraron robusta activación de Ras como se evaluó utilizando un ensayo desplegable que se recuperó de Ras-GTP unido al dominio de Raf1 (fig. 1A) Ras vinculante. I3A fue tan eficaz como PMA en este ensayo. Del mismo modo, la expresión de RasGRP3 en las células Rat2 confería una capacidad de activar Ras en respuesta tanto a análogos de DAG (Fig. 1B). células T Jurkat expresan endógenamente RasGRP1 pero no cantidades apreciables de RasGRP3 o RasGRP4. tratamiento I3A provocó la activación de Ras reproducible reproducible en las células Jurkat T, similar a la observada con PMA (Fig. 1C).
A. Los cultivos de células Rat2 ingeniería ya sea con el vector vacío o cDNA RasGRP1-expresión de vector fueron tratados con I3A o PMA durante 10 minutos y se compararon con los cultivos de control usando el ensayo de pull-down Ras-GTP. Los resultados son representativos de tres experimentos independientes. B. En un solo células Rat2 que expresan RasGRP3 cDNA experimento se analizaron de manera similar. Se analizaron las células C. Jurkat T para la activación de Ras DAG analógicas inducida en tres experimentos independientes. D. Un número igual de ratones C57BL /6J (WT, de tipo salvaje) y
Rasgrp1
- /- (KO, knockout) timocitos fueron tratadas con DMSO (control negativo), I3A o PMA, como se indica por 10 minutos y las proteínas los lisados se compararon usando el ensayo de señalización de fosfo-ERK. Los resultados son representativos de experimentos por duplicado. La cuantificación de los coeficientes de RasGTP /Ras o p-ERK1 /2 /ERK1 /2 se presentan a continuación los paneles individuales.
Anteriormente puso de manifiesto que RasGRP1 era esencial para la activación DAG analógico inducida por Ras en timocitos de ratón;
Rasgrp1 CD - /- timocitos eran completamente defectuosos, mientras que de tipo salvaje (C57BL /6J) timocitos mostraron una fuerte activación de Ras [27]. Porque teníamos un número limitado de células, se utilizó el ensayo de fosfo-Erk más sensible como un sustituto para la activación de Ras. Como era de esperar, los timocitos mutantes demostraron disminuido mucho la señalización de ERK después de PMA o con tratamiento I3A (Fig. 1D). En conjunto, estos resultados demuestran que I3A, como PMA, puede activar RasGRP1 y RasGRP3. Un nivel basal alta Ras-GTP en las células no tratadas frustrado experimentos similares dirigidos a evaluar RasGRP4 en las células Rat2. Sin embargo, usando un ensayo de la morfología celular se recogieron evidencia indirecta de que I3A y PMA cada RasGRP4 pueden activar en las células Rat2. RasGRP4 células que expresan Rat2 incubadas durante 48 horas en PMA o I3A asumido una morfología transformada, tal como se describe anteriormente para las células que expresan RasGRP1 Rat2 [15]. Este efecto no se observó con células vector vacío o células Rat2 RasGRP4 que expresan no tratados (datos no mostrados)
análogos DAG activan RasGRPs por la fosforilación mediada por PKC, así como por el reclutamiento directo a las membranas celulares [16]. - [19]. El uso de la línea celular Ramos B, se determinó la dependencia de la dosis del I3A y PMA para inducir la fosforilación de RasGRP3 endógena en T133. En paralelo, se analizó tanto la activación de la PKC, lo que podría ser evaluado a partir de su estado de fosforilación en S299 [31], así como la respuesta de aguas abajo de la fosforilación de Erk. Para quinasas como PKC que están sujetos a la regulación alostérica y posicional, mediciones de la actividad de la quinasa aislada no son una medida fiable del nivel de
in vivo
actividad. Para PKC, la fosforilación en S299 aparece reportar su activación dependiente de ligando [31]. Desafortunadamente, los anticuerpos no están disponibles comercialmente para los sitios de fosforilación que reflejan la activación de otras isoformas de PKC, a diferencia de los muchos anticuerpos que informan sobre la fosforilación de PKC en el bucle de activación, a su vez motivo, y el motivo hidrófobo. Estos últimos sitios están implicados en la maduración de PKC que lo hacen capaz de ser activado después de la unión del ligando. Por lo tanto, sólo se analizó la activación de la PKC en respuesta a I3A y PMA. Otras isoformas de PKC reportados para células Ramos incluyen PKCa, β, ε, y θ [32].
En este sistema de células, se observó que I3A y PMA mostraron potencias aproximadamente iguales para la activación de PKC δ y para Erk ( Fig. 2A). fosforilación RasGRP3 en T133 fue detectable a una concentración ligeramente menor de cualquiera de ligando, lo que sugiere la participación de otras isoformas de PKC, además de PKC. Para confirmar la participación de la PKC en la fosforilación RasGRP3, hemos examinado la capacidad del inhibidor general de PKC Gö6983 bloquear estos eventos de fosforilación (Fig. 2B). Por sí mismo, el pretratamiento con Gö6983 tuvo poco efecto. En contraste, las respuestas al tratamiento con I3A o PMA se redujeron drásticamente. En particular, la fosforilación de RasGRP3 en T133 fue casi completamente abolida, consistente con la inhibición de la fosforilación de PKC, como era la respuesta aguas abajo de la fosforilación de Erk. Del mismo modo, en las células T Jurkat la sartén inhibidor de PKC-bis indolemaleimide que abolió la respuesta a I3A aguas abajo de la fosforilación de Erk (Fig. 2C). Además, se confirmó que este inhibidor de PKC disminuye en gran medida la formación de Ras-GTP en respuesta a I3A, demostrando directamente que el efecto de I3A sobre la fosforilación de Erk fue aguas arriba de Ras y compatible con el requisito conocido para la activación mediada por PKC de RasGRP1 además a la exigencia de la unión del ligando al dominio RasGRP1 C1 [15], [18], [19].
a. Las células Ramos se trataron durante 30 minutos con las concentraciones indicadas de I3A o PMA seguido de análisis de los lisados celulares mediante inmunotransferencia. DMSO indica el control del vehículo. Las barras indican la cuantificación (media ± SEM) de los resultados de tres experimentos independientes. A inmunoblot representativo se ilustra. Cabe señalar que, aunque el anticuerpo RasGRP3 no está dirigida contra un sitio de fosforilación RasGRP3, produce consistentemente cierto aumento en la señal bajo condiciones de fosforilación RasGRP3. células B. Ramos se trataron con 3 nM I3A o PMA, en algunos casos, después del pretratamiento con Gö6983 (5 mM durante 40 min), y se analizaron como anteriormente. Las barras indican la cuantificación (media ± SEM) de los resultados de dos experimentos independientes. A inmunoblot representativo se ilustra. Un experimento adicional realizado en condiciones similares dio resultados similares. células C. Jurkat T se estimularon en un solo experimento con I3A durante 10 minutos con o sin 10 min pre-incubación con el inhibidor de pan-PKC bisindolymaleimide I (4,6 M), seguido de análisis de Ras-GTP, el total de Ras, pErk1 /2 y los niveles totales de ERK1 /2.
I3A activa RasGRPs en líneas celulares Select B-NHL
anteriormente puso de manifiesto que los análogos de DAG como briostatina 1 y el pico análogo sintético podrían activar RasGRPs en líneas de células B-NHL que se han caracterizado como sensibles a la inducción de la apoptosis por estos mismos compuestos [25], [26]. Después de haber confirmado anteriormente que I3A actuó como un análogo de DAG en RasGRP1 /3, hemos querido explorar con más detalle la capacidad de este compuesto para provocar la activación de Ras en líneas de células B-NHL sensibles representante analógicas DAG. Breve tratamiento de BL2 (linfoma de Burkitt), Jeko-1, Z138 (tanto linfoma de células del manto) y Toledo (germinal linfoma centro) resultó en la activación robusta de Ras (Fig. 3).
En un solo experimento, las células fueron tratadas con 100 nM I3A o DMSO de control durante 10 minutos, seguido por análisis de Ras-GTP por el ensayo de tirar hacia abajo. Se cuantificó la relación de Ras-GTP /Ras.
Tratamiento I3A Causas intracelular Re-distribución de RasGRP1 y RasGRP3
análogos DAG se unen a una hendidura hidrófilo en el dominio C1, completando una superficie hidrófoba y la inserción de membrana de conducción de este modo del análogo DAG - dominio complejo C1 [33]. así DAG y DAG análogos contribuyen a la activación RasGRP en parte haciendo que estas proteínas para volver a localizar a las membranas celulares donde pueden interactuar físicamente con lipidada Ras [34]. Por lo tanto, hemos examinado la capacidad del I3A para inducir la redistribución de proteínas utilizando tanto
In situ Opiniones y enfoques de fraccionamiento subcelular.
En
In situ
estudios, GFP-RasGRP1 se expresó en LNCaP Células. Después del tratamiento con I3A o PMA, los cambios en el patrón intracelular de la proteína marcada se visualizaron mediante microscopía confocal. Se eligieron células LNCaP porque su morfología bien distribuidas-facilita imágenes. Son fáciles de transfectar y hemos tenido una amplia experiencia con los efectos de diversos ésteres de forbol en la translocación de PKC en este sistema [29]. Antes del tratamiento, GFP-RasGRP1 se distribuyó por todo el citoplasma (Fig. 4). Al PMA (1000 nM) Además, GFP-RasGRP1 transloca a la membrana plasmática dentro de 2 minutos. I3A igualmente indujo una respuesta rápida, pero el patrón fue marcadamente diferente, con la agrupación pronunciada en sitios internos.
Las células que expresan GFP-RasGRP1 se trataron con 1,000 nM PMA o I3A. El patrón de translocación se examinó en células vivas como una función del tiempo. Se muestran los resultados de experimentos duplicados con I3A. Las imágenes que se muestran son representativos de cuatro experimentos independientes. La barra de escala representa 10 micras.
Como un enfoque complementario, expresamos GFP-RasGRP3 en células HEK-293, tratadas con I3A o PMA, las células sometidas a fraccionamiento subcelular, y examinamos los cambios en la distribución de GFP-RasGRP3 entre las fracciones de membrana y citoplásmicos (Fig. 5). GFP-RasGRP3 se detectó tanto con un anticuerpo dirigido contra sí misma RasGRP3, así como con un anticuerpo contra la etiqueta GFP. A modo de comparación, también examinamos los cambios en la distribución de PKC endógeno.
HEK-293 que expresan GFP-RasGRP3 fueron tratados durante 30 minutos con PMA o I3A a las concentraciones indicadas. sonicados celulares se sometieron a fraccionamiento subcelular y los niveles de PKC y RasGRP3 se analizaron por inmunotransferencia. Para RasGRP3, se detectó la expresión de ambos con un anticuerpo anti-RasGRP3 y con un anticuerpo contra la etiqueta GFP. Las barras indican la cuantificación (media ± SEM) de los resultados de tres experimentos independientes. se ilustra un inmunoblot representativo.
El tratamiento con I3A indujo un claro aumento en el nivel de GFP-RasGRP3 recuperado en la fracción de membrana, que se detectó con anticuerpo, se asemeja a la respuesta observada con PMA. La pérdida de GFP-RasGRP3 partir de la fracción citoplasmática era menos evidente, pero estos resultados debe ser atemperada por la observación de que la proteína detectada en la muestra de proteína total fue ligeramente más elevada en las muestras tratadas con análogos de DAG, por razones desconocidas. En el mismo experimento, tanto I3A y PMA indujo redistribución de PKC a la fracción de membrana.
Tratamiento I3A Afecta proteínas Bcl-2 en líneas celulares Select B-NHL
En nuestros estudios anteriores se compararon la línea celular analógica sensible DAG Toledo a RL, un tipo de línea de centro germinal DAG analógico resistente LNH-B de células [25]. Nos informó que la apoptosis inducida por análogos de DAG en las células Toledo B-NHL era dependiente de la BH3-only pro-apoptóticos proteína Bim [25]. En las células Toledo B-NHL, el tratamiento con briostatina 1 o pico resultó en RasGRP-Erk señalización y la fosforilación de Bim en un sitio pro-apoptótica que es común a ambos BimEL y formas de empalme BIML. También demostramos que la fosforilación anti-apoptótica de los sitios únicos para BimEL llevó a la proteolisis eficaz de una manera dependiente de proteosoma en el análogo resistente RL línea celular DAG. Sin embargo, este mecanismo anti-apoptótica fue menos evidente en Toledo. Nuestros resultados actuales con I3A muestran exactamente el mismo patrón: BIML asumieron una movilidad electroforética reducida, indicativo de la fosforilación, después del tratamiento I3A en tanto RL y Toledo (Fig 6A.). I3A también provocó la fosforilación de BimEL tanto en RL y Toledo. Sin embargo, BimEL baja regulación en Toledo era relativamente ineficaz después del tratamiento I3A (Fig. 6A), al igual que hemos descubierto previamente para briostatina 1 y pico [25].
Las líneas celulares indicadas fueron tratados o tratados durante 3 día (BL2, UPN1, Z138) o durante 24 horas (RL y Toledo). Proteína lisados se analizaron mediante inmunotransferencia con anticuerpos para las proteínas indicadas. Los paneles A y B se obtuvieron a partir de geles duplicados. Erk se utilizó como control de carga.
Más recientemente hemos demostrado que el tratamiento pico indujo apoptosis en línea celular de linfoma de Burkitt BL2 y en 5 de 6 líneas celulares de linfoma de células del manto, la mayoría de los cuales eran Bim- deficiente [26]. En estos casos, la apoptosis se asoció con el aumento de expresión de Bik y disminución de la expresión de MCL1 y Bcl-XL. En los presentes estudios, se encontró que Bik fue inducida por tratamiento I3A en BL2 y Z138, una célula de manto línea celular de linfoma representante (Fig. 6B). Especialmente en BL2, gran parte de la Bik expresado había aumento de la movilidad electroforética. Este fenómeno, que puede reflejar mRNA de empalme alternativo o modificación posterior a la traducción, fue visto previamente en las células tratadas con pico [26]. Por el contrario, la línea celular UPN1 MCL DAG análogo resistente no mostró expresión Bik inducida por I3A. Tanto BL2 y Z138 mostraron IA3 inducida por disminución de la expresión de MCL1 y Bcl-XL, pero estos efectos no fueron tan evidentes en UPN1 células (Fig. 6B). En todos los aspectos, los resultados obtenidos aquí con I3A paralelo a los obtenidos con briostatina 1 y su pico analógica en nuestros estudios anteriores [25], [26].
I3A induce la apoptosis en Select B-NHL líneas celulares
para determinar si I3A puede inducir la apoptosis en líneas celulares de B-NHL previamente demostrado ser sensible a la briostatina 1 y /o su pico análogo, se utilizó tres protocolos de marcado de células diferentes y citometría de flujo, como se describe anteriormente [25], [26]. Además de las líneas celulares mencionadas anteriormente, se incluyeron en el análisis de las líneas celulares de MCL-DAG analógicas sensibles previamente caracterizadas Mino, REC1 y Sp53 y la resistencia de Burkitt línea celular de linfoma Daudi. La incapacidad de las células para acumular TMRE (éster etílico de tetrametilrodamina) se utilizó para detectar la pérdida del potencial de membrana mitocondrial externa (Fig. 7A). En algunos casos, se incluyeron los inhibidores U1026 o PD184352 Mek para evaluar el papel de la vía canónica de señalización Ras en la apoptosis. Un pseudo-sustrato de caspasa fluorescente se utiliza para detectar la actividad de caspasa mundial (Fig. 7B). Se empleó ADN de fin de etiquetado utilizando dUTP y transferasa terminal (TUNEL) para controlar la fragmentación del ADN nuclear (Fig. 7C). resultados representativos se presentan en la Figura 7 y los resultados se resumen en la Tabla 2. En general, I3A inducida extensa apoptosis en DAG analógicas sensibles a líneas de células (Toledo, BL2, Jeko-1), pero mucho menos en las líneas de células resistentes (RL , UPN1 y Daudi). La pérdida de la tinción inducida por TMRE I3A en células Toledo fue abrogada en gran medida por los inhibidores de MEK (Fig. 7A), pero este efecto era menos dramático en algunas de las líneas celulares de MCL (datos no mostrados).
A. células RL y Toledo se trataron durante 24 horas, se incubaron con TMRE, y se analizaron para la captación de tinción por citometría de flujo. En algunos casos, los cultivos se incubaron ya sea con U0126 o PD184352 para evaluar los efectos de la inhibición Mek. B. UPN1 y células Jeko-1 se incubaron con DMSO o 100 nM I3A para 4 días y luego se analizaron con CaspACE ™ para detectar la activación de caspasas.