Extracto
adenocarcinoma ductal pancreático (PDA) es una enfermedad altamente letal, que por lo general se diagnostica en una etapa avanzada. Hemos establecido ratas transgénicas que llevan un K-
ras
gen mutado controlada por la activación Cre /loxP. Los animales desarrollan PDA que es histopatológicamente similar a la de los seres humanos. Anteriormente, se informó de que los niveles séricos de N-ERC /mesotelina fueron significativamente mayores en ratas portadoras de PDA que en los controles. En el presente estudio, para determinar si los niveles séricos de N-ERC /mesotelina correlacionado con el tamaño del tumor, se midieron los niveles de N-ERC /mesotelina en ratas portadoras de PDA. El aumento de los niveles séricos de N-ERC /mesotelina correlacionado con el aumento del tamaño del tumor. Este resultado indica una interrelación entre el nivel sérico de N-ERC /mesotelina y tamaño del tumor. A continuación se investigó el efecto de la quimioterapia en los niveles séricos /mesotelina N-ERC. células de cáncer de páncreas de rata se implantaron subcutáneamente en el flanco de ratones NOD-SCID. En los ratones tratados con 200 mg /kg de gemcitabina, el peso del tumor y el nivel sérico de N-ERC /mesotelina se redujo significativamente en comparación con los controles. Estos resultados sugieren que las mediciones /mesotelina suero N-ERC podrían ser útiles para monitorizar la respuesta al tratamiento
Visto:. Fukamachi K, Iñigo M, Hagiwara Y, K Shibata, Futakuchi M, Alexander DB, et al. (2014) Rata N-ERC /mesotelina como marcador de
En Vivo
selección de fármacos contra el cáncer de páncreas. PLoS ONE 9 (10): e111481. doi: 10.1371 /journal.pone.0111481
Editor: Mohammad Saleem, Hormel Institute, Universidad de Minnesota, Estados Unidos de América
Recibido: 2 de Junio, 2014; Aceptado: September 25, 2014; Publicado: 27 Octubre 2014
Derechos de Autor © 2014 Fukamachi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del sus Archivos de soporte de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por el Programa de transferencia adaptable y Tecnología sin fisuras a través orientado a los objetivos R & amp; D (A-PASO) de Japón Ciencia y Agencia de tecnología; una subvención-en-Ayudas a la Investigación Científica (C) de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia; una subvención-en-Ayudas a la Investigación en la Universidad de la Ciudad de Nagoya; la Fundación de Investigación del Cáncer de Aichi; el Programa para el desarrollo del sistema de apoyo para la mejora de la educación y la investigación del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología; y una subvención-en-Ayudas a la Investigación del Cáncer (17S-6, 20S-8) del Ministerio de Salud, Trabajo y Bienestar. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Yoshiaki Hagiwara es un empleado de los Laboratorios de Inmuno-biológicos. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales. El resto de autores declaran no tener intereses financieros en competencia.
Introducción
N-ERC /mesotelina es una proteína de 31 kDa que forma el fragmento N-terminal de los de larga duración de 71 kDa ERC /proteína mesotelina y se secreta en la sangre de los pacientes con mesotelioma [1] - [3]. La rata
Erc
(expresada en carcinoma de células renales) gen fue identificado como un gen altamente expresado en el carcinoma de células renales de la rata Eker [4], [5]. El homólogo humano de rata
Erc
es el
La mesotelina
/
factor de megacariocitos potenciar gratis (
MPF
) de genes [6] - [8]. ERC /mesotelina se expresa también en el tejido de ovario y carcinoma de páncreas en seres humanos [9] - [12]. N-ERC /mesotelina se considera que es relevante en el monitoreo de respuesta a la quimioterapia en pacientes con mesotelioma [13], [14].
adenocarcinoma ductal pancreático (PDA) lleva el pronóstico más sombrío de todos los tumores sólidos [15] . Hemos establecido líneas de ratas transgénicas que llevan un humano H
ras
G12V (Hras250) [16] o una K humana
ras
G12V (Kras301, Kras327) [17] oncogén en el que la expresión del transgén está regulada por el sistema Cre /loxP. la activación dirigida del transgén se logra mediante la inyección de un Cre recombinasa llevar a adenovirus (AxCANCre) en los conductos pancreáticos a través del conducto biliar común. lesiones neoplásicas en las ratas transgénicas exhiben morfológico [16], [18] y biológico [17], [19] - [21] similitudes con los observados en las lesiones de páncreas humano. Hemos informado anteriormente de que la N-ERC /mesotelina es fácilmente detectado en el suero de ratas portadoras de páncreas ductal adenocarcinomas [17]. En el presente estudio se reporta el uso de N-ERC /mesotelina como un marcador de suero para la evaluación de la eficacia de la quimioterapia.
Materiales y Métodos
Animales
Hombre K
ras
G12V transgénico (Kras301) ratas (JCL: fondo de ratas SD) se establecieron como se informó anteriormente [17], [18]. ratas homocigóticas se generaron por la cría de ratas machos heterocigotos con ratas hembras heterocigóticas. ratas transgénicas homocigóticas se identificaron mediante PCR semicuantitativa y luego confirmados por pruebas genéticas. Kras301 ratas fueron criados para obtener progenie transgénica homocigotos viables y fértiles. Fisher344 (/DuCrlCrlj F344) ratas fueron adquiridos de Charles River Japan, Inc. (Yokohama, Japón). Sprague-Dawley (SD) ratas (JCL: SD) se obtuvieron de CLEA Japón (Tokyo, Japón). SD (Slc: SD) y Wistar (Slc: Wistar /ST) ratas se obtuvieron de Japan SLC, Inc. (Hamamatsu, Japón). Las ratas se mantuvieron en jaulas de plástico en una habitación con aire acondicionado con un /12 h oscuridad ciclo de 12 h de luz. Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las Directrices para la Experimentación Animal de la Escuela de Graduados de Nagoya City University of Medical Sciences, y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Escuela de Graduados de Nagoya City University of Medical Sciences (H21-02, H22M-24) .
inducción de tumores y el examen patológico
Cre-expresando vectores de adenovirus se amplificaron en células HEK293 y luego purificaron usando Vivapure Adenopack (Vivascience, Hannover, Alemania) como se informó anteriormente [17]. tumores de páncreas se indujeron como se describe anteriormente [16] - [22]. El páncreas se fijó en paraformaldehído al 4% y se procesó para la observación histológica. Anti-rata C-ERC /mesotelina (306) se adquirió de Immuno-Biological Laboratories (Gunma, Japón), y la tinción se realizó tal como se describe anteriormente [17].
Trasplante de una línea y el tratamiento con células páncreas de rata con gemcitabina
una línea celular de carcinoma de páncreas (634NOD) se estableció a partir de un tumor de páncreas de una rata Hras250 [17], [23]. células tumorales 634NOD (2 × 10
6) se trasplantaron por vía subcutánea en 6 semanas de edad ratones NOD-SCID macho (CLEA Japan, Tokyo, Japón). Una semana después, los ratones NOD-SCID recibido gemcitabina (2 ', 2' desoxicitidina-difluoro; dFdC) hydrochroride (Eli Lilly Japan K.K., Kobe, Japón) en solución salina cuatro veces dentro de los nueve días mediante inyección intraperitoneal. Los tumores se midieron por la longitud (a) y la anchura (b) en milímetros usando calibres, y se calcularon los volúmenes tumorales (V) de acuerdo con la relación V = ab
2/2, donde "a" era el más largo de los dos mediciones [24]. Siete semanas después del trasplante, los ratones fueron sacrificados bajo anestesia con isoflurano profunda y se eliminaron los tumores y se pesaron y se recogió suero para el análisis de N-ERC /mesotelina.
Serum prueba
El nivel sérico de rata N-ERC /mesotelina se cuantificó por ELISA (Código No.27765, Kit Rat N-ERC Ensayo /mesotelina, IBL, Gunma, Japón) como se describe anteriormente [25].
resultados
los niveles séricos de N-ERC /mesotelina en ratas Kras301
Para determinar si el nivel sérico de N-ERC /mesotelina es diferente en el tipo salvaje JCL: ratas SD y heterocigotos y homocigotos Kras301 ratas, que ensayaron N niveles -ERC /mesotelina tipo salvaje en JCL: ratas SD y heterocigotos y homocigotos ratas Kras301 a la edad de 10 semanas: ratas F1 heterocigóticos fueron generados por la cría de ratas macho homocigotos Kras301 con JCL femeninos: ratas SD. No hubo diferencia significativa en el peso corporal entre los machos o las hembras de los diferentes genotipos (datos no mostrados). Los niveles séricos de N-ERC /mesotelina fue significativamente diferente entre los tres genotipos (P & lt; 0,0001): 28,3 ± 4,0 ng /ml (n = 19) en el tipo silvestre JCL: ratas SD, 51,5 ± 9,2 ng /ml (n = 19) en las ratas Kras301 heterocigóticos, y 77,9 ± 8,2 ng /ml (n = 13) en los homocigotos Kras301 ratas (Figura 1A). Por otra parte, el nivel sérico de N-ERC /mesotelina en ratas F1 heterocigóticos fue claramente superior a las ratas heterocigóticos originales [17]
ratas Heterocigotos Kras301 se generaron por la cría de ratas Kras301 homocigotos de tipo salvaje con JCL:. Ratas SD . (A) Los niveles séricos de N-ERC /mesotelina tipo salvaje en JCL: ratas SD y heterocigotos y homocigotos Kras301 ratas. (B) Los niveles séricos de N-ERC /mesotelina en masculina (barra cerrada) y hembra (barra libre) de tipo salvaje JCL: SD ratas y ratones homocigotos y heterocigotos Kras301. *, ** Y #, P & lt;. 0,0001 en comparación con los demás
No hubo diferencias significativas en los niveles séricos de N-ERC /mesotelina entre hombres (30,3 ± 4,2 ng /ml, n = 9 ) y mujeres (26,4 ± 2,8 ng /ml, n = 10) de tipo salvaje JCL: ratas SD. En contraste, no hubo una diferencia significativa en los niveles séricos de N-ERC /mesotelina entre ratas macho y Kras301 F1 heterocigotos hembras (machos, 59,2 ± 8,0 ng /ml, n = 8; hembra, 45,9 ± 5,0 ng /ml, n = 11: P & lt; 0,0001) y ratas Kras301 homocigotos (masculino, 83,4 ± 6,2 ng /ml, n = 6; mujeres, 73,2 ± 6,7 ng /ml, n = 7: P & lt; 0,05) (Figura 1B): perfil.
los niveles séricos de N-ERC /mesotelina en diferentes cepas de ratas
Para determinar si los antecedentes genéticos afectó los niveles séricos de N-ERC /mesotelina, los niveles de N-ERC /mesotelina en el suero eran medido en tres diferentes cepas de ratas: F344 /DuCrlCrlj, Slc: Wistar /ST y SLC: SD. Los niveles de N-ERC /mesotelina fueron significativamente diferentes entre las cepas de ratas (P & lt; 0,0001) (Figura 2A). Los niveles de N-ERC /mesotelina fueron 45,0 ± 1,5 (n = 12) en F344 /DuCrlCrlj, 31,4 ± 5,9 (n = 12) en Slc: SD y 19,6 ± 3,0 (n = 12) en Salt Lake City: ratas Wistar /ST . Los niveles de N-ERC /mesotelina también fueron significativamente diferentes entre los machos de las diferentes cepas y las hembras de las diferentes cepas (Figura 2B). En las cepas individuales, no hubo diferencia significativa entre varones (n = 6) y hembra (n = 6) ratas (Figura 2B). Por otra parte, no hubo diferencias significativas entre JCL: SD (n = 19) y SLC:. Ratas SD (n = 12): perfil
(A) la cepa diferencias en los niveles séricos de N-ERC /mesotelina. (B) Los niveles séricos de N-ERC /mesotelina en los hombres (barra cerrada) y mujeres (barra abierta) de las diferentes cepas de ratas. *, P & lt; 0,0001; **, P & lt; 0,005; #, P & lt;. 0,0001 en comparación con los demás
Los niveles séricos de N-ERC /mesotelina correlacionado con el tamaño del tumor en ratas
Para determinar si los niveles séricos de N-ERC /mesotelina correlacionado con el tamaño del tumor, que analizaron los niveles de mesotelina N-ERC /Kras301 en ratas homocigotos teniendo páncreas ductal adenocarcinomas. Ratas adultas Kras301 homocigotos machos murieron 4 semanas después de la inyección de AxCANCre recombinante en el conducto pancreático a través del conducto biliar común: ver Fukamachi et al. 2013 [22] para una descripción detallada de la activación mediada por AxCANCre del oncogén Kras en ratas Kras301. Se observaron muchos nódulos tumorales macroscópicas visibles blanquecinas por todo el páncreas en las ratas transgénicas. El examen histológico mostró que estos nódulos eran adenocarcinomas, como se ha informado anteriormente [16], [17]. lesiones neoplásicas no se encontraron en ningún otro órgano. Los estudios inmunohistoquímicos demostraron una expresión más alta de ERC /mesotelina en lesiones de carcinoma en comparación con el tejido normal circundante, como se ha informado anteriormente [17]. Por otra parte, los estudios inmunohistoquímicos mostraron ERC /mesotelina También se expresó positivamente en la neoplasia intraepitelial lesiones pancreáticas (PanIN) (Figura 3).
La inmunotinción de ERC /mesotelina en PanIN1 (A y B), PanIN2 (C y D) y PDA (e y F) las lesiones. A, C, E, H & amp; E tinción; B, D, F, ERC /tinción mesotelina. . Bares = 100 micras
Un aumento en el nivel sérico de N-ERC /mesotelina correlacionado con el aumento del tamaño del tumor (R = 0,89665, P & lt; 0,0001, n = 14) (Figura 4). Este resultado indica una interrelación entre el nivel sérico de N-ERC /mesotelina y el tamaño del tumor en estas ratas
.
El nivel sérico de N-ERC /mesotelina en ratas Kras301 homocigotos teniendo páncreas carcinomas ductales. El nivel sérico de N-ERC /mesotelina correlacionada con el aumento de peso del tumor (R = 0,897).
N-ERC /mesotelina como marcador del efecto quimioterapéutico de un medicamento contra el cáncer
a continuación se investigó si los niveles en suero N-ERC /mesotelina se vieron afectados por el tratamiento del adenocarcinoma de páncreas con la gemcitabina fármaco quimioterapéutico. 634NOD células [17], que se derivan de un adenocarcinoma de páncreas ductal de una rata Hras250, se implantaron subcutáneamente en el flanco de ratones NOD-SCID. Después de 1 semana los ratones se les administró gemcitabina (200 mg /kg, i.p.) cuatro veces dentro de nueve días mediante inyección intraperitoneal. Desde la semana 1 a la semana 7 el tamaño del tumor continuó aumentando en el control y en los ratones tratados con gemcitabina (Figura 5A). Aunque, debido a la gran dispersión de los tamaños de los tumores, no había una diferencia significativa en el tamaño del tumor entre los dos grupos, el tamaño medio del tumor fue significativamente menor en los ratones gemcitabina tratados en comparación con los ratones de control de semana 3 a semana 7 ( Figura 5A). Al final de la semana 7, los ratones se sacrificaron y los tumores se retiraron y se pesaron; el peso del tumor en los ratones tratados con gemcitabina (0,33 ± 0,26 g, n = 9) se redujo significativamente en comparación con los ratones de control (1,60 ± 1,37 g, n = 10) (P & lt; 0,05) (Figura 5B). No había ninguna diferencia morfológica entre los tumores de los ratones tratados con gemcitabina y de control (datos no mostrados). Al final de la semana 7, el nivel sérico de N-ERC /mesotelina se redujo significativamente (P & lt; 0,01) en ratones tratados con gemcitabina (22,4 ± 22,6 ng /ml, n = 9) en comparación con los ratones de control (123.7 ± 100.6 ng /ml, n = 10) (Figura 5C). Por el contrario, ni el peso ni los niveles séricos tumorales de N-ERC /mesotelina fueron significativamente diferentes del control (n = 10) en ratones tratados con 75 (n = 10) o 150 (n = 9) mg /kg de gemcitabina (Figura S1 ). Aunque debido a la gran dispersión de los tamaños de los tumores y los niveles /mesotelina N-ERC, no había una diferencia significativa en el tamaño del tumor o los niveles /mesotelina N-ERC entre los ratones tratados con 75 ó 150 mg /gemcitabina kg y los ratones de control, el promedio de ambos valores fue menor en los ratones tratados con gemcitabina en comparación con los ratones de control. Por lo tanto, el nivel de suero N-ERC /mesotelina correlaciona bien con el efecto de gemcitabina (R = 0,96597, P & lt; 0,0001). (Figura 5D)
células de cáncer de páncreas de rata (634NOD células) se implantaron por vía subcutánea en el flanco de los ratones NOD-SCID. Después de 1 semana los ratones se les administró gemcitabina (0 o 200 mg /kg, i.p.) cuatro veces dentro de nueve días mediante inyección intraperitoneal. (A) la observación periódica de los tumores en los ratones NOD-SCID tratados con gemcitabina (0 mg /kg, círculos abiertos; 200 mg /kg, círculos cerrados). (B) El peso del tumor y (C) nivel sérico de N-ERC /mesotelina se redujo significativamente por el tratamiento con gemcitabina (200 mg /kg, círculos cerrados) en comparación con el control (círculos abiertos) (P & lt; 0,05, P & lt; 0,01 respectivamente ). (D) La correlación del peso del tumor y los niveles séricos de N-ERC /mesotelina. El nivel sérico de N-ERC /mesotelina correlacionado con el peso del tumor y el tratamiento de gemcitabina (R = 0,966). Los círculos abiertos, 0 mg /kg; círculos cerrados, 200 mg /kg.
Discusión
Hemos informado anteriormente de que el nivel sérico de N-ERC /mesotelina correlaciona con el tamaño del tumor en ratones con células de cáncer de páncreas de ratas trasplantadas (634NOD células) [17]. En el presente estudio, de acuerdo con nuestro informe anterior, el nivel sérico de N-ERC /mesotelina correlacionado con el tamaño del tumor de páncreas en ratas (Figura 4). Estos resultados mostraron que el tamaño relativo del tumor de páncreas podría estimarse a partir de la concentración sérica de N-ERC /mesotelina sin sacrificar los animales. También demostramos que la N-ERC /mesotelina en el suero era un biomarcador que podría ser utilizado para monitorizar la respuesta a la quimioterapia. Cuando los ratones con tumores derivados de 634NOD células trasplantadas se trataron con gemcitabina, el peso del tumor y el nivel de N-ERC /mesotelina en el suero se redujeron en comparación con el control. El nivel sérico de N-ERC /mesotelina en correlación con el efecto terapéutico del fármaco anti-cáncer (Figura 5). Por lo tanto, N-ERC /mesotelina se puede utilizar para el análisis cuantitativo del efecto terapéutico de los agentes contra el cáncer en el cáncer de páncreas en los modelos animales utilizados en este estudio.
El nivel sérico de N-ERC /mesotelina en ratas Kras301 homocigotos fue significativamente mayor que los de las ratas de tipo salvaje. El nivel sérico de N-ERC /mesotelina en F1 heterocigóticos de ratas homocigóticas también fue significativamente mayor que en las ratas de tipo salvaje. Sin embargo, el nivel sérico de N-ERC /mesotelina en las ratas heterocigóticos originales no eran diferentes de tipo salvaje JCL: ratas SD [17]. Las ratas se mantuvieron Kras301 homocigotos por la cría de ratas hembras homocigotos macho homocigotos y. Es probable que las ratas con niveles elevados de N-ERC /mesotelina fueron seleccionados por accidente en el transcurso del establecimiento de las ratas Kras301 homocigotos
.
El nivel sérico de N-ERC /mesotelina fue significativamente diferente entre las cepas de ratas (F344 /DuCrlCrlj, Slc: SD y Slc: Wistar /ST). Estos resultados sugieren que los antecedentes genéticos de diferentes cepas de ratas afecta el nivel basal de suero N-ERC /mesotelina. Por lo tanto, para la evaluación de las respuestas quimioterapéuticos utilizando suero N-ERC /mesotelina, es importante la utilización de controles apropiados.
N-ERC /mesotelina se detectó en los sobrenadantes de células de cáncer de páncreas humanas cultivadas y correlacionada con la niveles de expresión de ERC /mesotelina [26]. ERC /mesotelina se expresa frecuentemente en el carcinoma ductal, pero no en páncreas normal [11], [26] - [28]. Así, la expresión /mesotelina ERC se puede encontrar tanto en el páncreas humano y de rata de adenocarcinoma ductal. Sin embargo, contrariamente a lo esperado, no hubo diferencia significativa en las concentraciones séricas de N-ERC /mesotelina entre pacientes con cáncer de páncreas y los grupos de control sanos [26]. Por lo tanto, mientras que N-ERC /mesotelina se puede utilizar como un biomarcador de suero para el carcinoma de páncreas ductal en los modelos animales utilizados en el presente estudio, no es adecuado para los seres humanos.
Actualmente, no hay ningún fármaco eficaz contra cáncer de páncreas; Por lo tanto, el uso de modelos animales para probar la capacidad de respuesta de cáncer de páncreas para la terapia sigue siendo de suma importancia. El uso de la rata N-ERC /mesotelina como un marcador de suero reside en su capacidad para distinguir entre las ratas con o sin cáncer de páncreas sin abrir la cavidad abdominal. La gemcitabina se considera generalmente que constituyen la terapia de primera línea para el cáncer de páncreas. La dosis máxima tolerada de gemcitabina en ratas fue de 50 mg /kg una vez a la semana. Esta dosis no tuvo efecto sobre el tamaño del tumor en ratas Kras301. Por lo tanto, el nivel sérico de N-ERC /mesotelina no se vio afectada de manera significativa en estos animales (nuestros resultados no publicados). Cabe destacar que en los ratones tratados con gemcitabina, los niveles de gemcitabina, que no afectaron significativamente el tamaño del tumor no afectaron el nivel sérico de N-ERC /mesotelina (Figura S1). Mientras que la gemcitabina sola no muestra efectos anti-cáncer en el cáncer de páncreas endógenamente desarrollado en ratas (nuestro resultado sin publicar) o en modelos de ratones [29], los resultados presentados aquí demuestran la utilidad de la N-ERC /mesotelina como marcador sérico en el monitoreo preclínica ensayos para la terapia en modelos de ratones y ratas de páncreas adenocarcinoma ductal: serodiagnóstico en modelos animales se pueden utilizar para mejorar la detección de agentes quimioterapéuticos candidatos que podrían ser evaluados para el uso humano
Apoyo a la Información
Figura S1..
Efecto de la gemcitabina en ratones NOD-SCID con 634NOD células trasplantadas. El nivel de peso del tumor y suero de N-ERC /mesotelina no se redujo mediante el tratamiento con 100 o 150 mg /kg de gemcitabina
doi:. 10.1371 /journal.pone.0111481.s001 gratis (TIFF)