humano
Extracto
La sobrecarga de hierro se ha asociado con la carcinogénesis en humanos. La administración intraperitoneal de nitrilotriacetato férrico inicia una reacción de Fenton en los túbulos proximales renales de roedores que en última instancia conduce a una alta incidencia de carcinoma de células renales (CCR) después de tratamientos repetidos. Se realizó alta resolución microarrays de hibridación genómica comparativa para identificar las características de los perfiles genómicos de esta oxidativos RCC rata inducidos por el estrés. Los resultados revelaron extensas alteraciones genómicas a gran escala con una preferencia por deleciones. Las deleciones y amplificaciones fueron numerosos y algunas veces fragmentada, demostrando que una reacción de Fenton es una causa de tales alteraciones genómicas
in vivo
. trazado de frecuencia indica que dos de los loci más comúnmente alterado correspondieron a un
CDKN2A
/
2b
deleción y un
Met
amplificación. tamaños de los tumores se asociaron de forma proporcional con
Met
expresión y /o amplificación y análisis de la agregación confirmaron los resultados. Por otra parte, hemos desarrollado un procedimiento para comparar los patrones genómicos enteros de las alteraciones del número de copias entre las diferentes especies basándose en la relación syntenic cromosómicas. Los patrones de los RCC ratas mostraron la similitud más fuerte para los RCC humanos entre los cinco tipos de cánceres humanos, seguido por mesotelioma maligno humano, una plancha cáncer de sobrecarga asociada. Por lo tanto, una reacción química Fenton dependiente del hierro provoca alteraciones genómicas a gran escala durante la carcinogénesis, que pueden resultar en perfiles genómicos distintos. Sobre la base de las características de extensas alteraciones del genoma en el cáncer humano, nuestros resultados sugieren que esta reacción química puede jugar un papel importante durante la carcinogénesis humana
Visto:. Akatsuka S, Yamashita Y, Ohara H, Liu YT, Izumiya M , Abe K, et al. (2012) Reacción de Fenton cáncer inducido en ratas de tipo salvaje recapitula Genómica alteraciones observadas en el cáncer humano. PLoS ONE 7 (8): e43403. doi: 10.1371 /journal.pone.0043403
Editor: Kamaleshwar Singh, de la Universidad Tecnológica de Texas, Estados Unidos de América
Recibido: March 2, 2012; Aceptado: July 19, 2012; Publicado: August 29 de, 2012
Copyright: © Akatsuka et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por la princesa Takamatsu Cancer Research Fund (10-24213); una subvención-en-Ayudas a la Investigación del Cáncer del Ministerio de Salud, Trabajo y Bienestar de Japón; y una subvención-en ayudas del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología de Japón. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer es una enfermedad de alteraciones genómicas acumulados, presumiblemente causada por un proceso sistemático durante la lesión celular y reparación. agentes causantes de la carcinogénesis son numerosas incluyendo γ-radiación, la radiación ultravioleta, la inflamación, los productos químicos y la sobrecarga de hierro [1]. los datos genómicos de una variedad de cánceres humanos se analiza actualmente, ya sea con la hibridación genómica comparativa basada en matrices (CGH) [2] o secuenciación de próxima generación [3], [4]. Estos proyectos se llevan a cabo para encontrar mutaciones genéticas causantes que conduzcan a la identificación de nuevos productos químicos o anticuerpos dirigidos a las interacciones de las moléculas de señalización responsables. Se espera que estos esfuerzos para dar lugar a desarrollos de fármacos eficaces. Sin embargo, la prevención del cáncer en la vida diaria es tan importante como su terapia.
En el presente estudio, hemos tratado de resolver los roles de estrés oxidativo mediado por hierro durante la carcinogénesis utilizando CGH basada en matrices. El estrés oxidativo es constitutivamente causada por el metabolismo de oxígeno molecular [5], pero se rige principalmente por diversos sistemas antioxidantes. Sin embargo, en una variedad de condiciones patológicas, las cargas de estrés oxidativo exceden la capacidad antioxidante [6]. El hierro es el metal pesado más abundante en mamíferos, tales como roedores y seres humanos. Mientras que el hierro es esencial para el transporte de oxígeno como un componente de la hemoglobina, el exceso de hierro se ha asociado con la carcinogénesis [7], [8], presumiblemente a través de una reacción de Fenton [9]. formas iónicas de hierro son apenas soluble a un pH neutro, pero nitrilotriacetato férrico (Fe-NTA), un quelato de hierro, es soluble a pH 7,4 y es un agente catalítico eficiente para la reacción de Fenton [10]. En la década de 1980, nuestro grupo estableció que las repetidas administraciones intraperitoneales de Fe-NTA inducen una alta incidencia de carcinoma de células renales (CCR) en roedores [11], [12]. Más tarde, se demostró que la lesión renal se produce a través de una reacción de Fenton con una variedad de productos químicos mediados por radicales hidroxilo, tales como 8-hidroxi-2 'desoxiguanosina [13], [14] y 4-hidroxi-nonenal [15] , [dieciséis]. Se establece que una sobrecarga de hierro en muchos procesos patológicos que se asocia con la presencia de hierro catalítico [17], [18].
De acuerdo con ello, mediante la evaluación de todo el genoma de los CRC, no pudimos encontrar un principio general para la alteraciones genómicas bajo condiciones estresadas oxidativamente. Reportamos un
CDKN2A /2b
eliminación mediante análisis de microsatélites en este modelo [19]. En este estudio, evaluamos todo el genoma de los CRC de rata inducida por Fe-NTA y sus líneas celulares utilizando CGH basadas en matrices. Por otra parte, transformamos los datos en un genoma humano a través de la relación syntenic cromosómicas y analizó la asociación.
Resultados
Genoma de toda Vistas de ADN el número de copias Las alteraciones en inducida por Fe-NTA RCC Rata
Quince muestras de ADN de rata RCC, que incluyeron 13 muestras de tumores primarios y 2 muestras de líneas celulares, se hibridaron en Agilent microarrays de ADN para CGH con 181.978 loci del genoma (GEO adhesión: GSE36101). La comparación de diferentes perfiles de CGH basadas en matrices de una manera cuantitativa es difícil. Un cambio en el número medio de copia es causada por la poliploidía y la contaminación de las células normales. Por lo tanto, hemos desarrollado un método estadístico que tenga en cuenta estos factores para estimar el número de copias cromosómicas (Métodos S1). En este trabajo, los análisis de datos de perfiles de CGH basada en matrices se basan en el número de copias estimadas utilizando este método.
Array basado en perfiles de CGH revela que los genomas de los RCC de rata inducida por Fe-NTA son a menudo complejas y tienen muchas grandes alteraciones cromosómicas (Figs. 1A y S1). Todo un análisis de frecuencia de genoma con 15 muestras identificadas regiones recurrentes de una aberración número de copias en los RCC-NTA inducida por Fe (fig. 1B). Copiar aberraciones numéricas se determinaron sobre la base de la distribución de los valores de la relación log2 que se volvieron a calcular con el número de copias estimado para un conjunto de 13 tumores primarios y 2 líneas de células (Fig. S2). En esta distribución, los umbrales que representaban la ganancia y la pérdida se eligieron a ± 0,377. Una amplificación que representa umbral fue elegido en 0.811 mientras que una deleción homocigótica (pérdida completa) fue asignado a la posición en la que se estimó el número de copias como 0. La función global más característica no cubierto por el análisis de frecuencia era una predisposición a perder una amplia ampliamente región de los cromosomas, en especial para los cromosomas 3, 5, 6, 8, 9, 14, 15, 17 y 20. La segunda característica es una amplificación frecuente sobre una región pericentromeric largo en el cromosoma 4.
(a) los perfiles de CGH basadas en matrices representativas de dos tumores RCC. Las líneas rojas muestran log2 ratios del número de copias estimado para el cáncer de ploidía inferido contra la posición genómica para todas las sondas de microarrays de CGH. (B) Distribución de frecuencias de las aberraciones del número de copias en todo el genoma de la rata. Las frecuencias relativas de amplificación (rojo oscuro), la ganancia (tomate), la pérdida (verde amarillo) y la eliminación homocigótica (verde oscuro) dentro de los 13 tumores RCC y dos líneas celulares de RCC se representan en cada posición genómica. Dos loci relacionados con el cáncer,
Met
y
CDKN2A
, que con más frecuencia se ve afectada por el número de copias aberraciones están indicadas por las flechas.
cromosómico frecuente pérdida de rata cromosoma 5 y la eliminación homocigótica en el
CDKN2A /2b
Locus
cromosoma 5 se sometieron a una extensa pérdida en el número de copias, no inferior a la de otros cromosomas (por ejemplo, los cromosomas 6, 8 y 20 ) (Fig. 1B). Lo que se refiere a la pérdida extensa, deleciones homocigóticas se observaron con mayor frecuencia en el
CDKN2A /2b
locus en el cromosoma 5 (Fig. 2A). Esta región incluye comúnmente suprimido dos loci (
CDKN2A
y
CDKN2B
) para los tres genes supresores de tumores distintos (
p16
y
p19 Hoteles en
CDKN2A
;
p15 Hoteles en
CDKN2B
) (figura 2B).. Cierre de
p16 /p19
y
expresión de p15
ARNm se confirmó en las muestras que contenían una deleción homocigótica en el
CDKN2A /2b
locus (Fig. 2C y 2D) . En las muestras con una deleción hemizygous en el
CDKN2A
locus (es decir, FB32-4, FB28-7),
p16
y
p19
expresiones se downregulated, presumiblemente debido a la se metilado regiones promotoras de los alelos restantes. Sin embargo, algunas de las muestras, ya sea con un hemizygous o no su eliminación (por ejemplo, FB14-3; BF51-1; FB14-6; FB30-5 y FB33-7) mostró una sobreexpresión marcada de
p16
y
p19
.
(a) El gráfico de barras representa las regiones de la pérdida cromosómica eliminación (verde amarillo) y homocigotos (verde oscuro) a lo largo del cromosoma 5 durante 13 tumores RCC y dos líneas celulares de RCC. La línea roja vertical en el fondo indica la posición de la
CDKN2A locus
. (B) vista del gráfico de barras se centró en el
CDKN2A /2b
loci magnificada. Las regiones genómicas de todos los genes RefSeq incluidos en el rango que se muestra del cromosoma se representan como barras verticales en el fondo. (C) Análisis de la expresión de
CDKN2A gratis (
p16
Ink4a
y
p19
Arf
) durante 13 tumores RCC y dos líneas celulares de RCC, utilizando reales -tiempo PCR con pares de cebadores específicos para cada una transcripción diferente. Los valores en el
y
eje x indican el nivel de expresión de mRNA relativa en comparación con un promedio de aquellos en los riñones normales de tres ratas de control. análisis (D) Expresión de
CDKN2B gratis (
p15
INK4B
) durante 13 tumores RCC y dos líneas celulares de RCC por PCR en tiempo real. Los valores en el
y
eje x indican el nivel de expresión de mRNA relativa en comparación con un promedio de aquellos en los riñones normales de tres ratas de control.
Las amplificaciones frecuentes sobre la región del cromosoma 4 pericentromeric la amplificación y en el
Met
Locus
Durante un largo porción de la región pericentromeric en el cromosoma 4, se observaron copia frecuente el número de ganancia y amplificación (Fig. 1B). amplificación genómica y la expresión génica en las áreas correspondientes del cromosoma 4 eran en su mayoría proporcional (Fig. S3). Un diagrama de barras de la región amplificada a lo largo de la región en el cromosoma 4 pericentromeric reveló que
Met
reside oncogenes en la sección de solapamiento genómico más común (Fig. 3A). La sección más de solapamiento con una longitud de aproximadamente 222 kb consistía en una región amplificada en 11/15 muestras y contenía sólo un gen RefSeq-curada (
Met
) (Fig. 3B). Un aumento mayor de 5 veces en la
se observó Met
la expresión de ARNm en 6 muestras entre los 9 tumores que contenían una amplificación genómica de
Met
(Fig. 3C).
(a) El gráfico de barras representa las regiones de amplificación a lo largo de una región pericentrometic 65 Mb del cromosoma 4 de 13 tumores RCC y dos líneas celulares de RCC. Existen cuatro grados de amplificación se indican mediante barra de gradación de color; más oscuro es el color rojo, cuanto mayor sea la amplitud. (B) una vista ampliada de la gráfica de barras de arriba muestra las proximidades de la región más de superposición. Las regiones genómicas de todos los genes RefSeq incluidos en el rango que se muestra del cromosoma se representan como barras verticales en el fondo. análisis (C) Expresión de
Met Opiniones de 13 tumores RCC y dos líneas celulares de RCC por PCR en tiempo real. Los valores en el
y
eje x indican el nivel de expresión de mRNA relativa en comparación con un promedio de aquellos en los riñones normales de tres ratas de control.
En conjunto, con respecto a las aberraciones cromosómicas en estos dos cáncer -relacionado loci, cada carcinoma examinados incluyendo las dos líneas celulares contenida dentro de
Met
amplificación o la
CDKN2A /2b
deleción (Tabla 1, Figs. 2B y 3B). Otras alteraciones genéticas comunes se resumen en la Tabla S1 (20 genes suprimidos, común en los tumores RCC 2-4) y en la Tabla S2 (340 genes amplificados, comunes en 2-9 tumores RCC). Entre los
Zbtb38
amplificación fue confirmada por la sobreexpresión (Fig. S4).
El tamaño del tumor de los CRC inducida por Fe-NTA está regulada por las características genéticas
examinado las asociaciones entre alteraciones genéticas y diversos rasgos RCC incluyendo los que se resumen en la Tabla 1. entre todas las relaciones examinado,
Met
expresión y el tamaño del tumor se asociaron de forma proporcional (Fig. 4A). Además, una agrupación jerárquica de los tumores basados en patrones enteros de cambios cromosómicos reveló que un grupo de tumores de gran tamaño (es decir, FB7-7, FB30-5 y FB33-7) correspondió a un grupo distinto (Fig. 4B). Por lo tanto, un rasgo de tumor, el tamaño en el momento del tumor fue clínicamente manifiesta, se asoció con la totalidad de los perfiles de CGH basadas en matrices.
(A)
Met
expresión se correlaciona significativamente con el tamaño del tumor . coeficiente de correlación de Pearson (r) y el valor de p correspondiente se escriben en el área de trazado. (B) La agrupación jerárquica de los tumores RCC basado en los patrones enteros del genoma de los cambios de número de copias. Los tumores de gran tamaño forman un grupo distinto.
Comparación de los perfiles de número de copias alteración en cáncer de genomas entre ratas y humanos
Para determinar el principio general de los cambios genómicos a gran escala en el cáncer en todas las especies de mamíferos, se compararon los genomas del cáncer de ratas y seres humanos como todo un espectro de alteraciones cromosómicas. En primer lugar, hemos transformado los perfiles de CGH-array basados en la rata cromosomas humanos de acuerdo con un synteny entre las dos especies. A partir de entonces, se compararon los patrones enteros basado en el número de copias estimados utilizando los métodos de análisis de datos multidimensionales. Se encontró que el RCC rata inducida por Fe-NTA fue más similar a los CRC humanos, seguido de mesotelioma maligno humano (Figs. 5A y 5B).
(A) La trama de color representa una matriz de similitud en todos los RCC de rata y varios tipos de cáncer humanos. RRCC, rata carcinoma de células renales; hPDAC, adenocarcinoma ductal pancreático humano; hTALL, de células T humanas de leucemia linfoblástica aguda; hGBM, multiforme de glioblastoma humano; HRCC, carcinoma de células renales humano. (B) resumen numérico de la matriz de similitud. El número en cada cuadrado indica un valor promedio de índice de similitud (definida entre -1000 y 1000). Consulte la sección de Materiales y Métodos para más detalles.
Discusión
En este estudio, se presenta por primera vez los análisis de todos los datos de CGH-array basado aplica a un Fenton carcinogénesis química inducida en un modelo de riñón de rata [20]. Se encontró que el estrés oxidativo provoca graves alteraciones genómicas en el genoma del cáncer inducido a nivel cromosómico (fig. 1A). Es bien sabido que la mayoría de los tumores sólidos malignos humanos poseen las ganancias o pérdidas en numerosos cromosomas [21], [22], y la amplificación puede ser una diana adecuada para la quimioterapia del cáncer. Durante el proceso carcinogénico de este tipo de tumores, se cree que la inestabilidad cromosómica de contribuir como factor de conducción [23]. Entre los modelos de roedores de carcinogénesis de tipo salvaje, sin embargo, son pocos los modelos de informe utilizando muestras de tumores primarios grandes alteraciones genéticas debido a la inestabilidad cromosómica [24], [25]. Inducida por radiación linfoma maligno murino [26] y el adenocarcinoma de pulmón murino inducido por 4- (metilnitrosamino) -1- (3-piridil) -1-butanona, un carcinógeno presente en el humo del tabaco [27], revelaron ligeramente más aberraciones cromosómicas brutos que los correspondientes tumores espontáneos, aunque la baja resolución de la (serie de cromosomas artificiales bacterianos [BAC] del ~6,500) informe. Los hechos que controlan las ratas no muestran RCC [11], [12] y la inducida por Fe-NTA modelo RCC rata exhibe una equivalencia con los cánceres humanos en las alteraciones genómicas a nivel cromosómico apoyar firmemente la idea de que esta carcinogénesis modelo imita un proceso carcinogénico real los seres humanos que carecen de fuertes rasgos de susceptibilidad al cáncer.
Por el contrario, los ratones con múltiples genes asociados con el cáncer de ingeniería genética muestran alteración genética de este tipo [28]. Creemos que esos experimentos se corresponden con un fenotipo mutador establecida [29] y, por lo tanto, al proceso carcinogénico en seres humanos que tienen fuertes rasgos de susceptibilidad al cáncer, como el síndrome de Li-Fraumeni (
p53
) [30] o el melanoma linajes (
p16
) [31]. Como un modelo de rata CCR hereditario, también se analizaron los RCC de ratas Eker, que no muestran características agresivas, tales como metástasis [32], [33], [34]. Hemos observado que estos RCC mostraron alteraciones genéticas nulos o sutiles (Fig. S5). Por consiguiente, el estrés oxidativo, incluyendo la inducida por el exceso de hierro, podría ser una de las causas de la carcinogénesis renal humano. De hecho, numerosos estudios epidemiológicos han asociado los trabajadores de la industria del acero y de hierro con un mayor riesgo de RCC [35].
Un análisis gráfico de frecuencias reveló dos características notables. En primer lugar, las aberraciones cromosómicas mostraron una preferencia para la pérdida en contra de la ploidía de cada genoma del cáncer. Sobre todo, la aberración fue representado por una deleción, ya sea a nivel cromosómico conjunto (monosomía) o en un nivel segmental (Fig. 1B). El objetivo más común de pérdida fue la
CDKN2A /2b
locus. El predominio de la pérdida en el perfil de alteraciones cromosómicas se puede atribuir a la primera etapa de la carcinogénesis. Hemos demostrado previamente que las células con una deleción hemizygous a
CDKN2A
aparecen ya en unas pocas semanas después de iniciar la administración de Fe-NTA [36].
Nuestro análisis reveló que presente la pérdida de monoallelic el cromosoma 5 en su totalidad o de una región equivalente amplia es la principal primer evento. De hecho, sólo hemos encontrado un caso (6,7%) de una pérdida monoallelic de una región muy estrecha (~ 350 kilobases;. Las figuras 2A y 2B). Fe-NTA cataliza la generación de radicales hidroxilo a través de una reacción de Fenton específicamente en la lumina de los túbulos proximales renales, lo que conduce a la degeneración y necrosis /apoptosis de estas células [37], [38]. Debido a que el riñón es un órgano vital que realiza la excreción de urea, la reabsorción de moléculas valiosos, así como el mantenimiento de la homeostasis iónica, la regeneración de las células tubulares restantes se promueve intensamente. En situaciones de estrés oxidativo crónico por las administraciones repetidas Fe-NTA, este proceso de degeneración y regeneración continuaría durante meses o años, lo que aumenta el riesgo de eventos mitótico simultáneamente con la reparación del daño oxidativo del ADN. Creemos que este estrés oxidativo provoca la replicación del ADN anormal y missegregation cromosómica, lo que conduce a la aparición de células aneuploides. Sorprendentemente, esta serie de acontecimientos parece ocurrir en meses, lo que lleva a una alta incidencia (~ 90%) del CCR en ratas plazo de dos años. células aneuploides por lo general presentan fenotipos uniforme con una mayor necesidad de energía y el estrés proteotoxic. Sin embargo, la aneuploidía puede promover la tumorigénesis en las siguientes dos mecanismos hipotéticos: 1) aneuploidía puede causar una ventaja proliferativa a través de la pérdida de control de transición de G1 /S en las condiciones en que las células euploid normales no se dividen [39] y 2) aneuploidía puede avanzar la tumorigénesis por la promoción de la inestabilidad genómica, por lo tanto, el aumento de la capacidad de evolución de los tumores [40]. La eliminación frecuente de la
CDKN2A
/
2b
locus se observa en el mesotelioma peritoneal de rata, una sobrecarga de hierro asociada a tumor [41], inducida ya sea por otro compuesto de hierro (sacarato férrico) [ ,,,0],42] o por el amianto [43]. Estos rasgos comunes de los modelos animales sugieren fuertemente que
CDKN2A
/
2b
es un objetivo principal en la carcinogénesis mediada por el hierro. La misma alteración genética se observa en el mesotelioma de rata inducida por nanotubos de carbono de pared múltiple [44], en la que aún no se haya demostrado la participación de hierro. Nos gustaría añadir aquí por la importancia biológica de nuestros resultados que la deleción homocigótica del
CDKN2A /2B
se observa con frecuencia en el mesotelioma humana asociados con la exposición al amianto [45], [46].
algunos de los tumores con un remanente
CDKN2A
/
2b
alelo mostró niveles extremadamente altos de expresión de dos productos de este locus,
p16 /Ink4a
y
p19 /Arf.
Este es un tema debatido actualmente en el cáncer humano [47]. Existe considerable evidencia de que varias neoplasias presentan niveles significativos de p16 en el citoplasma [48]. Esto puede ser un intento fallido para detener la proliferación celular en el caso de aguas abajo
Rb
desregulación [49] o puede representar un mecanismo alternativo para la modulación de las vías no identificadas. Nuestra exhibición de datos ~ 50% de eliminación hemizygous
Rb
. Esto requiere una mayor clarificación con el análisis epigenético
.
La segunda característica determinada utilizando el análisis gráfico de frecuencias fue una alta incidencia de amplificación a lo largo de una región cromosómica limitada hacia el centrómero del cromosoma 4, que apunta a la
Met
lugar. Una región que abarca 80 Mb desde el centrómero del cromosoma 4 de rata es syntenic cromosoma humano 7. Los varios cánceres humanos, tales como el glioblastoma [50] y el cáncer de pulmón de células no pequeñas [51], se informó a albergar amplificaciones en el cromosoma 7. La tirosina quinasa MET es un receptor para un factor de crecimiento de hepatocitos y está situado aguas arriba de
ras
en la vía de transducción de señales, sirviendo así como una ventaja para la proliferación celular [52]. Por lo tanto, es concebible que el tamaño del tumor se asoció proporcionalmente con el
Met
nivel de expresión (Figs. 3C y 4A). Debido a diseccionar el animal tan pronto como reconocemos el tumor, creemos que los tumores de gran tamaño son más agresivos en la naturaleza. Es de notar que el tamaño del tumor también se relacionó con el patrón de alteración del genoma (Fig. 4B), y se asoció con la amplificación y sobreexpresión de
Zbtb38
localizado en el cromosoma 8 (Fig. S4). ZBTB38 (CIBZ) reprime la transcripción de las plantillas metilados [53], por lo tanto, presumiblemente, que regulan los mecanismos epigenéticos. Baja regulación de ZBTB38, una novela sustrato de la caspasa-3, induce la apoptosis [54] y de este gen se localiza en un locus de susceptibilidad al cáncer de próstata [54]. Estos resultados confirman la posibilidad de clasificación de los tumores utilizando CGH basados en matriz.
Met
surgió evolutivamente tarde y es aplicable sólo a los mamíferos [52]; que de este modo podría estar asociado con la amplificación única en todo el genoma.
amplificación genómica es la hipótesis de que se produzca a través del ciclo de rotura-fusión-puente [55], [56], [57]. Una reacción de Fenton causa de doble cadena-rotura del ADN [10]. Nuestros resultados revelaron que estas amplificaciones consistían en una mezcla de amplificaciones de bajo nivel de amplia gama y, amplificaciones de alto nivel estrechos fragmentados (Fig. 3A). Esto sugiere un mecanismo de retroalimentación positiva para la amplificación, a partir de la amplificación de toda la gama de bajo nivel. Tenemos la sospecha de una implicación de los dobles minutos, y una presencia de loci genómico susceptibles. Esta hipótesis queda en estudio. Es interesante observar que los genes supresores tumorales dos,
Cav1
[58], [59] y
ST7
[60], rodearon el
Met
locus (Fig. 3B) . Esta puede ser la razón por la
Met
locus fue un denominador para los RCC de rata. Todo el exoma o la secuenciación del genoma pueden revelar más nuevas conclusiones respecto de la mutación puntual y translocación cromosómica.
Por último, se compararon los resultados actuales de ratas con tumores humanos correspondientes mediante la transformación de los datos basados en synteny cromosómica (Figs. 5A y 5B). Se esperaba que la alteración genómica de rata inducida RCC-Fe-NTA fue más similar a la RCC humano presumiblemente porque las células diana son los mismos. Sin embargo, sorprendentemente, el mesotelioma humano era el segundo más similar. Ahora se ha establecido que la mayoría de los resultados de mesotelioma humana de la exposición al amianto, y el proceso patogénico primario implicado es la sobrecarga de hierro [8], [61]. El mismo origen mesodérmico de las células tubulares renales y células mesoteliales puede hacer que la similitud de los perfiles de CGH basadas en matrices. endodérmico del tumor, tales como adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC), y el tumor ectodérmica, tales como el glioblastoma multiforme (GBM), mostró una diferencia significativa en los perfiles genómicos.
En conclusión, hemos demostrado que repite reacciones Fenton en el medio silvestre tipo de ratas inducidas cáncer que recapitula alteraciones genómicas similares a los de los cánceres humanos, lo que sugiere la implicación del estrés oxidativo como un factor importante en la carcinogénesis humana. En este modelo de carcinogénesis renal, alteraciones preferidas eran eliminación;
CDKN2A /2B
deleción y
Met
de amplificación fueron las principales modificaciones de genes diana. Un análisis comparativo entre especies podría contribuir a la identificación de agentes cancerígenos candidatos.
Materiales y Métodos
inducida por Fe-NTA carcinoma de células renales Modelo
experimentos de carcinogénesis inducida por Fe-NTA eran realizado con ratas híbridas F1 masculinos que eran un cruce entre Fischer 344 y Brown-Noruega cepas puras (Charles River, Yokohama, Japón) como se describe anteriormente [62]. Trece casos de RCC se utilizaron en este estudio, y se determinó el grado histológico del tumor de acuerdo con la clasificación de la Organización Mundial de la Salud modificado como previamente hemos descrito [62]. Los datos se resumen en la Tabla 1. Los comités de experimentación con animales de la Facultad de Medicina, Universidad de Kyoto Escuela de Medicina de la Universidad de Nagoya y la Facultad de Medicina aprobó este estudio. líneas celulares FRCC001 y FRCC562 se establecieron a partir RCC primarias inducidas-Fe-NTA como se describe anteriormente [63].
Hibridación Genómica Comparativa
ADN genómico de los tumores y las líneas celulares basados en la matriz se ha aislado con el DNeasy (Qiagen, Valencia, CA). CGH basado-Array se realizó con un Agilent 185 genoma K rata CGH microarrays (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) como se describe anteriormente [64]. Trece tumores primarios y dos líneas celulares de RCC inducidos Fe-NTA se analizaron utilizando ADN extraído de referencia de un riñón normal de una rata de Brown-Noruega consanguíneos cepa. Una muestra de RCC de una hembra Eker rata [32] se analizó utilizando ADN de referencia extraída de un riñón normal de una rata macho Eker. Dos muestras adicionales RCC de ratas Eker masculinos fueron analizados con el genoma Rat CGH Microarray 105A (G4436A; Agilent Technologies), usando ADN extraído de referencia de un hígado normal de otro macho Eker rata. Los datos CGH basadas en matrices normalizados fueron procesados para generar un perfil segmentado por la segmentación binaria circular (CBS) [65] con un nivel de significación alterada (alfa = 0,0001). El procedimiento de procesamiento de datos para la estimación del número de copias se detalla en Métodos S1.
RT-PCR cuantitativa análisis
El ARN total se aisló usando reactivos Isogen (Nippon Gene Co. Ltd., Tokio, Japón ) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se sintetizó ADNc usando un kit RNA PCR ver. 3.0 (Takara Bio, Shiga, Japón) con cebadores aleatorios. Un kit Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG (Invitrogen, Carlsbad, CA) y un sistema 7300 Real-Time PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA) se utilizaron para el análisis de PCR cuantitativa en tiempo real. Rat β-actina se utilizó como control interno. Los cebadores utilizados fueron los siguientes:
p16
Ink4a
, 5'-aaacgccccgaacactttc-3 'y 5'-gttcgaatctgcaccatagga-3';
p19
Arf
, 5'-accccaagtgagggttttct-3 'y 5'-agagctgccactttgacgtt-3';
p15
INK4B
, 5'-tccacaggctagagggaaaa-3 'y 5'-gtgcaggtgactccttggtt-3';
Met
, 5'-ttaagcgagagcacgacaaat-3 'y 5'-ccacataggaaaacgcactgt-3';
Zbtb38
, 5'-gtagctgctgctccaaatcc-3 'y 5'-cctgttgagggtggtgaact-3'; β-actina, 5'-tgtgttgtccctgtatgcctctg-3 'y 5'-atagatgggcacagtgtgggtg-3'.
Datos humano
Hemos utilizado los datos CGH basadas en matrices humanas de adenocarcinoma ductal pancreático (hPDAC) [ ,,,0],28], las células T leucemia linfoblástica aguda (hTALL) [28], el glioblastoma (hGBM) [66], la línea celular mesotelioma (HMM) [67] y el carcinoma de células renales (CCDH) [56]. Los datos de Agilent CGH-array de los anteriores cuatro tipos de cáncer humano se obtuvieron de NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) sitio web (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). Los números de acceso GEO para los conjuntos de datos son GSE7599 (hPDAC), GSE7603 (hTALL), GSE9177 (hGBM) y GSE22237 (HMM). Los datos se obtuvieron RCC humano a través de los análisis con microarrays de BAC (4.361 clones) [68]. Definimos índice de similitud entre los dos perfiles de CGH basados en arreglos de la siguiente manera. En primer lugar, se calculó el coeficiente de correlación con log2 ratios del número de copias estimado para el cáncer de ploidía inferida por las posiciones genómicas correspondientes a todos los Agilent 44 sondas de microarrays de CGH K humana. A continuación, se multiplicó el valor en 1 × 10
3 después de cambiar el valor absoluto en su raíz cuadrada.
Apoyo a la Información
Figura S1.
perfiles de CGH-array de todos los RCC examinados. Las líneas rojas muestran log2 ratios de número de copias estimado más de ploidía cáncer inferido frente a la posición genómica para todas las sondas de microarrays de CGH
doi:. 10.1371 /journal.pone.0043403.s001 gratis (PDF)
figura S2.
Distribución de los valores de la relación de número de copias log2 estimada para todas las sondas en todos los microarrays realizadas.
doi: 10.1371 /journal.pone.0043403.s002 gratis (PDF)
Figura S3.
Ejemplo de expresión global cambia de acuerdo con alteración genómica. Las diferencias en el genoma y transcriptoma se analizan entre dos RCC, FB7-7 tener amplia gama de amplificación en el cromosoma 4 frente FB28-7 tener ninguna alteración sustancial genómica en el cromosoma 4. (A) Cielo azul círculo gráfico indica la relación del número de copias estimadas sobre la base de CGH basada en matrices (FB7-7
vs
FB28-7). parcela círculo rojo indica la relación de señales normalizadas en microarrays de expresión Affymetrix (FB7-7
vs
FB28-7). (B) Expresión valores de la relación se promedian a lo largo del cromosoma. Aquí, la trama círculo rojo indica el valor medio en las ventanas de 2 Mb
doi:. 10.1371 /journal.pone.0043403.s003 gratis (PDF)
figura S4.
Zbtb38
expresión de ARNm se asocia demostrable con su número de copias cromosómicas. perfiles (A) CGH-array de dos tumores RCC que albergan más de la amplificación
Zbtb38
locus en el cromosoma 8. Análisis (B) Expresión de
Zbtb38
en 13 tumores RCC por PCR en tiempo real. Los valores de la
y
eje x indican el nivel de expresión de ARNm relativa en comparación con un promedio de aquellos en los riñones normales de tres ratas de control
doi:. 10.1371 /journal.pone.0043403.s004
(PDF)
Figura S5. perfiles de CGH-array de tres
hereditaria (rata) Eker tumores renales.