Extracto
activación aberrante de la vía /β-catenina vía es fundamental para el inicio y la progresión de la mayoría de los cánceres de colon. Esta activación provoca la acumulación de β-catenina nuclear y la inducción de sus genes diana.
Apc
min /+
ratones son el modelo más utilizado para el cáncer de colon. Que albergan una mutación
Apc
alelo y desarrollar adenomas y carcinomas intestinales durante los primeros meses de vida. Este fenotipo es causada por la mutación de la segunda
Apc
alelo y la consiguiente acumulación de β-catenina nuclear en las células afectadas. Aquí se describe que el receptor de la vitamina D (VDR) es un modulador importante de los niveles de β-catenina nuclear en el cáncer de colon
in vivo
. Por medios de selección apropiada de
Apc
min /+ ratones
y
Vdr
+/-
ratones tenemos animales generados que expresan una mutación
Apc
alelo y dos , una, o ninguna
Vdr
alelos de tipo salvaje. La falta de
Vdr
aumentó el número de criptas aberrantes del colon focos (ACF), pero no la de adenomas o carcinomas, ya sea en el intestino delgado o el colon. Es importante destacar que, ACF de colon y tumores de
Apc
min /+ Vdr
- /- ratones
había aumentado β-catenina nuclear y los tumores alcanzaron un tamaño más grande que los de
Apc
min /+ Vdr
+ /+
. Tanto la ACF y carcinomas en
Apc
min /+ Vdr
- /-
ratones mostraron una mayor expresión de β-catenina /TCF genes diana. En línea con esto,
VDR
knock-down en las células de cáncer de colon humano cultivadas mejoradas contenido y el gen diana expresión nuclear β-catenina. Consistentemente,
VDR
agotamiento abrogó la capacidad de 1,25 (OH)
2D
3 para promover la reubicación de β-catenina del núcleo de la membrana plasmática y para inhibir la β-catenina /TVC genes diana. En conclusión, VDR controla el nivel de β-catenina nuclear en las células de cáncer de colon y por lo tanto puede atenuar el impacto de las mutaciones oncogénicas que activan la vía /β-catenina vía
Visto:. Larriba MJ, Ordóñez-P Morán , Chicote I, Martín-Fernández G, I Puig, Muñoz A, et al. (2011) Receptor de Vitamina D deficiencia Mejora de Wnt /β-catenina y la carga tumoral en el cáncer de colon. PLoS ONE 6 (8): e23524. doi: 10.1371 /journal.pone.0023524
Editor: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 23 Marzo, 2011; Aceptado: July 19, 2011; Publicado: 15 de agosto 2011
Derechos de Autor © 2011 Larriba et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Fondo de Investigación Sanitaria-Instituto de Salud Carlos III (ISCIII, PI081356), Vall d'Hebron Instituto de Oncología de la Fundación Olga Torres, Fundación de la Asociación Española de Lucha Contra el Cáncer (AECC), Ministerio de Ciencia e Innovación (SAF2010-18302) y la Red Temática de Investigación Cooperativa en Cáncer (ISCIII, RD06 /0020/0009). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de colon es la segunda causa más común de muerte por cáncer en los países desarrollados [1]. Probablemente, sabemos más acerca de las alteraciones genéticas que causan cáncer de colon que para cualquier otra neoplasia sólida. Las mutaciones en
APC
/poliposis adenomatosa coli,
CTNNB1
/β-catenina o
AXIN
genes que activan la vía /β-catenina vía son responsables de la iniciación de la mayoría de colon tipos de cáncer [2]. El primer paso de la tumorigénesis de colon implica la formación de cripta aberrante Foci (ACF), que más tarde progresa a adenoma [3]. Posterior malignización de adenoma a carcinoma requiere la adquisición de nuevas alteraciones en los genes que están relacionados con la señalización /β-catenina vía o pertenecen a otras vías que actúan de forma sinérgica en el proceso [2].
Apc
min /+
ratones portadores de una línea germinal inactivación de mutación en uno
Apc
alelo desarrollan múltiples adenomas y carcinomas intestinales después de tres meses de edad [4]. Este fenotipo se produce como consecuencia de la mutación espontánea de la restante
Apc
alelo (pérdida de heterozigosidad) y la activación de la vía de señalización /β-catenina Wnt. Este modelo de ratón se ha convertido en el estándar de oro de la iniciación del cáncer intestinal.
vía Wnt /β-catenina regula la capacidad de la proteína β-catenina para impulsar la regulación de genes específicos [5], [6]. En resumen, en ausencia de una señal Wnt o la activación de mutaciones, β-catenina sólo está presente unido a E-cadherina en el intercelular
las uniones adherentes
, como la proteína libre se fosforila rápidamente por la caseína quinasa-Iβ ( CK-Iα) (Ser45) y glucógeno sintasa quinasa-3 (GSK-3β) (Ser33, Ser37 y Thr41) en un complejo formado también por las proteínas supresoras de tumores APC y Axin. etiquetas de fosforilación ß-catenina para la ubiquitinación y la degradación por el proteasoma [7]. En tales condiciones basales factor de potenciador (TCF /LEF) proteínas /linfoides de factor de células T de ADN unido a interactuar con corepressors transcripcionales para bloquear la expresión del gen diana en el núcleo. La unión de Wnt ligandos a sus complejos de receptores de la superficie celular (Frizzled-LRP) da como resultado el reclutamiento de Axin citoplásmica a la membrana plasmática, activación de la proteína Dishevelled y otros efectos no bien caracterizados que conducen a la inhibición de la fosforilación de β-catenina. Esto permite β-catenina se acumule y entrar en el núcleo, donde interacciona con miembros de la familia TCF /LEF y provoca la activación de sus genes diana de otro modo reprimidos [5], [7]. La vía /β-catenina vía es la principal fuerza impulsora detrás de la proliferación de las células epiteliales del colon y es esencial para el mantenimiento de los compartimentos progenitoras [8], [9]. Sin embargo, las mutaciones encontradas en el resultado de cáncer de colon en la activación aberrante de la vía e inducen la expresión constitutiva de sus genes diana (que participan principalmente en la proliferación celular y la desdiferenciación), lo que lleva a la formación de adenomas sin embargo, de larga vida benignas. La acumulación de la progresión del tumor combustibles genéticos y epigenéticos alteraciones adicionales
.
Muchos estudios epidemiológicos y experimentales indican que la vitamina D
3 (colecalciferol), su metabolito más activo 1α, 25-dihidroxivitamina D
3 (calcitriol , 1,25 (OH)
2D
3) y varios análogos protegen contra el cáncer de colon [10] - [12]. Nos han informado de que la 1,25 (OH)
2D
3 inhibe la proliferación y promueve la diferenciación epitelial de las células de cáncer de colon humano mediante la inducción de la expresión de E-cadherina y antagonizando la vía /β-catenina vía. Este último es el resultado de dos mecanismos principales: a) la inducción de la unión directa de receptor de la vitamina D (VDR) para ß-catenina, que se opone a la formación de complejos de β-catenina /TCF transcripcionalmente activos, y b) la inducción de β catenina exportación nuclear y relocalización en la membrana plasmática
las uniones adherentes
como consecuencia de la e-cadherina regulación positiva [13]. Además, la 1,25 (OH)
2D
3 aumenta la expresión de Dickkopf-1 (DKK1), una proteína secretada que inhibe la señalización Wnt de sus receptores de membrana plasmática [14]. También hemos descrito que el ser humano
VDR
gen es un objetivo directo de SNAIL1 y Snail2 /SLUG represores de transcripción, y que la expresión de VDR en pacientes con cáncer de colon se reduce en etapas avanzadas de la enfermedad asociados a la regulación positiva de estos factores [15], [16]. En consecuencia, alta SNAIL1 /2 de expresión en células de cáncer de colon cultivadas aumenta la β-catenina actividad transcripcional mediante la represión de la expresión de VDR y su actividad antagonista sobre Wnt /β-catenina señalización [16], [17].
β-catenina tiene una amplia gama de efectos pleiotrópicos que no pueden ser explicados únicamente probablemente por la modulación de la acción TCF /LEF. Por lo tanto, β-catenina se ha descrito recientemente para unir varios factores de transcripción de la superfamilia de receptores y proteínas nucleares homeobox [13], [18], [19]. En la mayoría de los casos, la unión β-catenina aumenta la actividad transcripcional de estos factores y afecta a la expresión de conjuntos alternativos o adicionales de los genes diana implicados en las decisiones de destino celular a lo largo del desarrollo, la homeostasis del tejido, o el cáncer [19], [20]. Nuestra descripción inicial de la interacción directa de β-catenina con VDR en células de cáncer de colon humano se ha confirmado en otros sistemas celulares [21] - [24]. β-catenina /interacción VDR implica la función de activador 2 (AF-2) dominio de transactivación de VDR y el dominio C-terminal de β-catenina [21]. En la piel del ratón, β-catenina /VDR controla los genes diana, el destino de células madre epiteliales y el desarrollo de tumores [20]. En este sistema, el aumento de β-catenina nuclear promovió la iniciación del tumor, mientras que los ligandos de VDR protegen contra el cáncer mediante la reducción de la fuerza de Wnt /β-catenina de señalización [20]. En consonancia con esto, el tratamiento de
Apc
min /+ ratones con 1,25
carga (OH)
2D
3 o análogos reduce tumor [25] o el número de pólipos y la carga [ ,,,0],26].
es importante destacar que el nivel de β-catenina en el núcleo definir la fuerza de la señal de Wnt y en consecuencia el destino o el comportamiento de varios tipos de células normales y tumorales [5], [27]. Además de la activación de mutaciones de los componentes de la vía Wnt /β-catenina, otras alteraciones genéticas, como mutaciones en
K-RAS
[28] o la activación de las vías oncogénicas como HGF /c-Met señalización [29] mejorar nuclear ß-catenina acumulación durante la progresión del cáncer de colon. En tal escenario, agentes capaces de disminuir el contenido nuclear β-catenina y así atenuar la señal /β-catenina Wnt podrían ser potencialmente utilizados en la terapia del cáncer, siempre y cuando las células tumorales muestran la adicción vía Wnt.
En este estudio se evaluar las consecuencias de
VDR
deficiencia en la iniciación y el desarrollo de cáncer intestinal impulsado por la activación de la vía /β-catenina Wnt. El efecto de
VDR
ausencia se ha analizado tanto
in vivo
y
in vitro
: en los tumores generados en
Apc
min /+ Vdr
- /-
ratones y en células de cáncer de colon humano cultivadas en el que
VDR
expresión fue derribado por medio de shRNA. Además, hemos estudiado el efecto de VDR reconstitución en células de cáncer de colon humano VDR-negativas. Nuestros resultados establecen una relación directa entre la función VDR y los niveles de β-catenina nuclear, que es crucial para controlar la actividad de la señalización /β-catenina en el cáncer de colon
in vivo.
Uso disponible
Apc
min /+
y
Vdr
+/-
ratones se generaron por los cruces adecuados
Apc
min /+ Vdr
+ /+, Apc
min /+ Vdr
+/-
y
Apc
min /+ VDR
- /-
animales. El análisis histológico a los cinco meses de edad reveló que
Vdr
deficiencia no afectó el número total de tumores en
Apc
min /+
ratones, ya sea en el intestino delgado o en el colon (Figura 1a, 1b). Por el contrario, los tumores de colon en
Apc
min /+ Vdr
- /-
ratones fueron significativamente mayores que en
Apc
min /+ Vdr
+ /+
o
Apc
min /+ Vdr
+/-
ratones (Figura 1c). Aunque diferentes en tamaño, adenomas y carcinomas de colon eran histológicamente equivalente en todos los ratones con independencia de su estado Vdr (Figura 1d). Además, el número de colon ACF fue mayor en
Apc
min /+ Vdr
- /- ratones que en
Apc
min /+ Vdr
+ /+
o
Apc
min /+ Vdr
+/-
ratones (Figura 2a).
número total de tumores (adenomas y carcinomas) en el intestino delgado (a) o en el colon (b) de
Apc
min /+ Vdr
+ /+
,
Apc
min /+ Vdr
+/-
y
Apc
min /+ Vdr
- /- ratones
. Cada punto corresponde a un ratón analizada y la línea horizontal indica la media. (C) El tamaño de los tumores de colon (adenomas y carcinomas) de
Apc
min /+ Vdr
+ /+
,
Apc
min /+ Vdr
+ /- Opiniones y
Apc
min /+ Vdr
- /- ratones
. Cada punto corresponde a un tumor analizado y la línea horizontal indica la media. Se muestra el valor p para un solo sentido el análisis de ANOVA. Los asteriscos indican diferencias significativas entre los grupos de comparación múltiple de Bonferroni sobre post-test. (D) las imágenes hematoxilina /eosina tinción representativa de los carcinomas de colon de
Apc
min /+ Vdr
+ /+
y
Apc
min /+ Vdr
- /-
ratones. Barra de escala, 300 micras.
(a) Número total de ACF colon en
Apc
min /+ Vdr
+ /+
,
Apc
min /+ Vdr
+/-
y
Apc
min /+ Vdr
- /- ratones
. Cada punto corresponde a un ratón analizada y la línea horizontal indica la media. (B) Los paneles superiores, imágenes de tinción hematoxilina /eosina representativas de colon ACF en
Apc
min /+ Vdr
+ /+
y
Apc
min /+ Vdr
- /- ratones
. Las puntas de flecha indican la ACF. Barra de escala, 50 micras. Media paneles, imágenes de inmunofluorescencia representativas que muestran la expresión β-catenina y la localización en el colon ACF de
Apc
min /+ Vdr
+ /+
y
Apc
min /+ Vdr
- /- ratones
. Las puntas de flecha indican la ACF. Barra de escala, 100 micras. Los paneles inferiores son una ampliación de los del centro. Barra de escala, 50 micras. (C) La cuantificación del nivel nuclear de β-catenina en el colon ACF de
Apc
min /+ Vdr
+ /+
,
Apc
min /+ Vdr
+ /- Opiniones y
Apc
min /+ Vdr
- /- ratones
. Cada punto corresponde a una lesión analizado y la línea horizontal indica la media. (D) La cuantificación de nivel nuclear de β-catenina en adenomas de colon y carcinomas de
Apc
min /+ Vdr
+ /+
,
Apc
min /+ Vdr
+/-
y
Apc
min /+ Vdr
- /- ratones
. Cada punto corresponde a una lesión analizado y la línea horizontal indica la media. (A, c, d) Se muestran los valores de p para el análisis unidireccional ANOVA. Los asteriscos indican diferencias significativas entre los grupos de comparación múltiple de Bonferroni sobre post-test.
A continuación se evaluó el estado de activación de la vía Wnt en lesiones de colon mediante el análisis de la expresión de β-catenina. A pesar de ACF en
Apc
min /+ Vdr
+ /+
,
Apc
min /+ Vdr
+/-
y
Apc
min /+ Vdr
- /- ratones fueron indistinguibles
por hematoxilina /eosina (/e H) tinción, se observó un incremento neto en los niveles de β-catenina nuclear y citosólico en ausencia completa de
VDR gratis (Figura 2b). Mientras que la tinción β-catenina fue alta y bastante homogénea entre las células en ACF (Figura 2b), que era muy heterogéneo en los carcinomas de los tres tipos de animales (Figura S1a). Este fenómeno también se observó en carcinomas primarios de colon humano (Figura S1b), en la que el nivel de β-catenina nuclear es heterogénea y, probablemente, define el potencial tumorigénico de las diferentes poblaciones de células cancerosas presentes en el tumor [29]. Esta heterogeneidad puede explicar por qué un aumento estadísticamente significativo en el nivel de β-catenina nuclear se encuentra en la ACF de
Apc
min /+ Vdr
- /-
en comparación con
Apc
se observó min /+ Vdr
+ /+
o
Apc
min /+ Vdr
+/-
ratones (Figura 2c), pero sólo una tendencia de menor importancia en los adenomas y carcinomas (Figura 2d).
Para demostrar una relación causal entre el
VDR
pérdida y el aumento de la β-catenina nuclear, hemos estudiado las células de cáncer de colon humano SW480-ADH en la que
VDR
fue derribado por medio de shRNA. Estas células albergan la mayor parte de las anomalías genéticas que caracterizan a los cánceres de colon avanzados, tales como la mutación de
APC
y
TP53
genes supresores de tumores, la activación de
K-RAS
oncogen y
c-MYC
amplificación [13]. De acuerdo con el
in vivo
resultados, un fuerte aumento en el contenido de β-catenina nuclear se encuentra en las células SW480 shVDR-ADH en comparación con las células shControl (Figura 3a, 3b). Además,
VDR
knock-down abrogó la capacidad de 1,25 (OH)
2D
3 para inducir E-cadherina expresión y β-catenina reubicación del núcleo a la membrana plasmática ( Figura 3a). Además,
VDR
derribo impedido la reorganización del citoesqueleto de β-tubulina y el cambio en la morfología celular inducida por la 1,25 (OH)
2D
3 que conduce a la formación de epitelioides compacto islas (Figura 3b).
imágenes de inmunofluorescencia representativo que muestra β-catenina y e-cadherina (a) o β-catenina y la β-tubulina (b) la expresión y localización en las células SW480-ADH infectadas con lentivirus que expresan shVDR o shControl y tratados con 1,25 (OH)
2D
3 o vehículo durante 72 h. Barra de escala, 20 micras.
Hemos querido analizar si el aumento en el nivel de β-catenina nuclear se tradujo en una señalización /β-catenina Wnt más fuerte. Con este fin, se estudió la transcripción de β-catenina /TCF-dependiente en células de cáncer de colon. células shControl y shVDR SW480-ADH fueron infectadas con lentivirus que codifica la proteína eGFP reportero bajo el control de siete copias de un TCF consenso /LEF sitio de unión (Figura 4a) [30]. La presencia en la construcción lentiviral de la rojo mCherry proteína fluorescente controlado por un promotor constitutivo permitió identificar las células infectadas con un microscopio fluorescente y citometría de flujo. De manera similar a la tinción de ß-catenina en los tumores de colon, encontramos cierta heterogeneidad en la actividad /TCF β-catenina entre el cultivo celular: la expresión de eGFP variable en células infectadas por igual (Figura 4b). El análisis de toda la población de células por citometría de flujo mostró que el porcentaje de células de alta eGFP era superior en shVDR que en cultivos de células shControl (Figura 4c). Además, las células shVDR tenían un promedio significativamente más alta que la señal eGFP shControl células (Figura 4d). También se encontró que la disminución en la acumulación de eGFP causada por 1,25 (OH)
2D
3 en shControl células (reducción del porcentaje de células de alta-EGFP y media de la señal de EGFP) fue atenuada en las células shVDR ( Figura 4c, 4d).
(a) Esquema de la construcción lentiviral 7xTCF /LEF-eGFP-SV40-mCherry utilizado para infectar células shControl y shVDR SW480-ADH. (B) Representante de contraste de fases y las imágenes de fluorescencia que muestra la expresión de eGFP y mCherry en las células SW480-ADH infectadas con el vector 7xTCF /LEF-eGFP-SV40-mCherry. Las puntas de flecha indican células que tienen una expresión variable de EGFP parecida infectados. Las barras de escala, 20 m. (C) La citometría de flujo análisis de la expresión eGFP en células shControl y shVDR SW480-ADH infectadas (mCherry positivo) con el vector 7xTCF /LEF-eGFP-SV40-mCherry y se trató con 1,25 (OH)
2D
3 o vehículo durante 96 h. Porcentaje de células en cada puerta se indica. (D) Cuantificación de la citometría de flujo de datos que muestran el promedio de expresión de eGFP en las células mCherry-positivas infectadas. Los datos corresponden a tres experimentos independientes. Se muestra el valor p para un solo sentido el análisis de ANOVA. Los asteriscos indican diferencias significativas entre los grupos de comparación múltiple de Bonferroni sobre post-test. (E) Análisis por QRT-PCR de
VDR
,
AXIN2
,
LEF1
y
c-MYC
la expresión de ARNm en shControl y shVDR SW480- ADH células tratadas con 1,25 (OH)
2D
3 o vehículo durante 48 h. La media geométrica de la expresión de SDHA y TBP genes de limpieza se utilizó para la normalización de la expresión del ARN como se indica en Materiales y Métodos. Los números indican el porcentaje de inhibición por 1,25 (OH) 2D3 en el tratamiento de cada tipo de célula. Los datos corresponden a tres experimentos independientes
Es importante destacar que la elevación de los niveles de β-catenina nuclear se reflejó en un aumento de la expresión de varios β-catenina /TCF genes diana:. QRT-PCR análisis reveló altos niveles de
AXIN2
,
LEF1
y
c-myc mRNA en
shVDR que en las células shControl (Figura 4e). Además, la inhibición de la expresión de β-catenina /TCF genes diana por 1,25 (OH)
2D
3 se redujo en las células shVDR (Figura 4E). La reducción de la expresión de VDR por shRNA también se analizó mediante qRT-PCR (Figura 4e) y se traduce en niveles indetectables de proteína ([31] y datos no mostrados). Como control se estudió la expresión de
CDH1
/E-cadherina y
CYP24A1
en estas células, dos genes de 1,25 (OH)
2D
3 de destino. La inducción de ambos genes se inhibió drásticamente en las células shVDR (Figura S2a).
A continuación, hemos ampliado nuestros estudios a otras líneas celulares de cáncer de colon humano.
VDR
knock-down en las células HCT116 y HT29 también promovió un aumento en los niveles de β-catenina nuclear (Figura S2b) y la activación de la transcripción TCF /LEF-dependiente (Figura S2c), dando lugar a una mayor expresión de los genes diana β-catenina
AXIN2
y
DKK1 gratis (Figura S2d). Tal regulación de genes fue acompañada por una pérdida general de la organización epitelial (Figura S2b). Como era de esperar, la reducción de los
VDR
expresión bloqueó la capacidad de 1,25 (OH)
2D
3 para inducir su gen diana
CYP24A1 gratis (Figura S2d). Sin embargo, y contrariamente a los datos de las células SW480-ADH, 1,25 (OH)
2D
3 no tuvieron efecto sobre la ubicación β-catenina o la actividad transcripcional en las células HCT116 y HT29 (Figura S2d y los datos no se muestran) . La razón puede ser que estas células expresan alto nivel de E-cadherina y, por tanto β-catenina se encuentra en la membrana plasmática en ausencia de 1,25 (OH)
2D
3.
La expresión transitoria de VDR tipo salvaje exógena en células SW620 humana de cáncer de colon metastásico VDR-negativos redujo sus niveles de β-catenina nuclear altas (Figura S3). Por el contrario, VDR- ΔAF2 y VDR-L417S mutantes que son incapaces de unirse β-catenina y reclutar coactivadores clásicos [21] no cambió el contenido nuclear de β-catenina (Figura S3). Del mismo modo, la expresión de un mutante VDR incapaz de unirse coactivators clásicos pero capaz de unirse β-catenina (VDR-E420Q) [21] no tuvo ningún efecto en el contenido nuclear β-catenina en las células SW620 (figura S3).
el aumento observado en el contenido de β-catenina nuclear mediante
VDR
knock-down no es una consecuencia de la reducción de la actividad de las quinasas CK-Iα o GSK-3ß ya que el nivel de fosforilación de β-catenina en Ser45 o Ser33 /Ser37 /Thr41 no fue modificado en las células SW480 shVDR-ADH (Figura S4A). Como la fosforilación de β-catenina en Ser552 y Ser675 por la proteína quinasa A y /o AKT se ha propuesto para promover la β-catenina localización nuclear y /o actividad transcripcional [32] - [34], también se analizó la posibilidad de que estas quinasas estaban involucrados en el efecto del VDR knock-down de β-catenina. Se encontró que la fosforilación de β-catenina en Ser552 y Ser675 se redujo en las células SW480 shVDR-ADH (Figura S4).
A continuación, el objetivo fue confirmar el efecto de la deficiencia de VDR en el blanco β-catenina genes
in vivo. Con este fin, se analizaron por inmunofluorescencia y se cuantificó el nivel de expresión de dos genes diana /TCF β-catenina (
CCND1
/ciclina D1 y
Lef1
) en ACF carcinomas de colon y de
Apc
min /+ Vdr
+ /+
,
Apc
min /+ Vdr
+/-
y
Apc
min /+ VDR
- /- ratones
. En consecuencia con los datos de las células cultivadas, un incremento en la expresión significativa de ambos productos génicos se encontró en las lesiones de
Apc
min /+ Vdr
- /-.
Ratones (Figura 5)
la cuantificación de la ciclina D1 (a) y Lef1 (d) la expresión de proteínas en las lesiones del colon de
Apc
min /+ Vdr
+ /+
,
Apc
min /+ VDR
+/-
y
Apc
min /+ Vdr
- /- ratones
. Cada punto corresponde a una lesión analizado y la línea horizontal indica la media. Se muestran los valores de p para el análisis unidireccional ANOVA. Los asteriscos indican diferencias significativas entre los grupos de comparación múltiple de Bonferroni sobre post-test. Inmunofluorescencia imágenes representativas que muestran β-catenina y la ciclina D1 (b, c) o β-catenina y Lef1 (e, f) la expresión y localización en ACF dos puntos (B, E) y los carcinomas (c, f) de
Apc
min /+ Vdr
+ /+
y
Apc
min /+ Vdr
- /- ratones
. Barras de escala, 50 micras (b, e) y 200 m (c, f). Los asteriscos indican una tinción inespecífica.
Finalmente, se analizó el grado de diferenciación de las ACF y los carcinomas presentes en el colon de
Apc
min /+ Vdr
+ /+
,
Apc
min /+ Vdr
+/-
y
Apc
min /+ Vdr
- /- ratones
. Los anticuerpos contra citoqueratinas (pan-citoqueratina) y villin1 que se utilizaron marcadores de diferenciación epitelial (Figura S5). ACF expresó niveles muy bajos de estas proteínas como se espera de el fenotipo progenitor impuesta por la señalización /β-catenina alta Wnt (Figura 6a, 6b). En carcinomas la expresión de ambos marcadores fue heterogénea (Figura 6c, 6d), que está de acuerdo con la expresión heterogénea de β-catenina se ha descrito previamente (Figura S1a). No se encontraron diferencias sustanciales en la expresión de citoqueratinas y villin1 entre las lesiones de
Apc
min /+ Vdr
+ /+
,
Apc
min /+ Vdr
+/-
y
Apc
min /+ Vdr
- /-
ratones, lo que sugiere que estos dos marcadores de diferenciación se pierden temprano durante la tumorigénesis de colon, probablemente como consecuencia de la activación inicial de la vía Wnt /β-catenina.
imágenes de inmunofluorescencia representativo que muestra β-catenina y villin1 (a, c) o β-catenina y pan-citoqueratina (b, d) la expresión y localización en la ACF de colon (una , b) y carcinomas (c, d) de
Apc
min /+ Vdr
+ /+
y
Apc
min /+ Vdr
- /-
ratones. líneas punteadas delimitan ACF. Los números indican las regiones con diferente patrón de expresión de las proteínas analizadas dentro del mismo tumor: 1) alta β-catenina, bajo villin1 /citoqueratinas; 2) baja β-catenina, alta villin1 /citoqueratinas. Las barras de escala, 50 micras (a, b) y 200 m (c, d).
Discusión
El nivel de β-catenina nuclear define la fuerza de la Wnt /β señalización-catenina y, en consecuencia, el destino y el fenotipo de muchos tipos de células normales y cancerosas. la activación aberrante de la señalización de Wnt /β-catenina debido a alteraciones en los componentes de la vía es responsable de la iniciación de la mayoría de los cánceres de colon humano, que pone de relieve la importancia de controlar la acumulación de β-catenina nuclear [28], [29], [35] . A pesar de que el inicio de la tumorigénesis de colon se considera clonal [36], los carcinomas de colon muestran la expresión de β-catenina nuclear en gran medida heterogénea. Esto se conoce como la paradoja β-catenina y ha conducido a la búsqueda de vías alternativas de modulación ubicación y la actividad β-catenina. Entre ellos,
K-RAS
mutación y miofibroblastos derivados de HGF se han propuesto recientemente para aumentar el contenido nuclear de β-catenina [28], [29].
Se sabe muy poco acerca de los mecanismos de disminuir el nivel de β-catenina dentro del núcleo. Hemos descrito que la 1,25 (OH)
2D
3 y varios análogos de menos calcémicos interfieren la vía /β-catenina Wnt en una serie de líneas celulares de cáncer de colon humano en varios modos: aumentan la unión de VDR a ß-catenina que dificulta la formación de complejos /TCF β-catenina, inducir la expresión de la DKK1 inhibidor de Wnt, y promover la reubicación de β-catenina del núcleo hacia la membrana plasmática donde se une la e-cadherina en
adherens uniones
[13], [14]. mecanismos putativos para este último efecto incluyen la inducción de β-catenina nuclear de exportación o el secuestro de recién sintetizada y /o citosólicas proteína β-catenina por E-cadherina, cuya expresión está fuertemente inducida por 1,25 (OH)
2D
3. Otro mecanismo de la inhibición /β-catenina Wnt en cáncer de colon ha sido propuesto por Kaler y cols .: 1,25 (OH)
2D
3 disminuye la síntesis y secreción por macrófagos THP-1 de interleucina-1β, una citoquina que activa la vía /β-catenina Wnt en células de cáncer de colon a través del bloqueo de la fosforilación de β-catenina por GSK-3β [37]. Sin embargo, la función de todos estos mecanismos celulares-autónoma y no células autónomas
in vivo
sigue siendo desconocido.
En este estudio examinamos si
VDR
deficiencia altera β catenina nuclear y contenidos vía Wnt /β-catenina en el modelo animal más utilizado para el cáncer de colon, el
Apc
min /+
ratones. Nuestros resultados muestran que
Vdr
deficiencia en
Apc
min /+ ratones
aumenta los niveles nucleares β-catenina y expresión de los genes diana de Wnt /β-catenina y, de acuerdo con los siguientes efectos , mejora la carga total del tumor de colon. Consistentemente, golpeando hacia abajo
VDR fotos: por shRNA en células de cáncer de colon humano aumenta el contenido nuclear de β-catenina, su actividad transcripcional, y la expresión de Wnt /β-catenina genes diana. Por otra parte, la restauración transitoria de expresión VDR tipo salvaje en células de cáncer SW620 de colon humano VDR-negativas disminuye el nivel de β-catenina nuclear, mientras que VDR-ΔAF2, VDR-L417S o mutantes VDR-E420Q, incapaz de unirse coactivadores clásicos y activar la transcripción de genes [21 ], no lo hizo. Curiosamente, entre ellos solamente VDR-E420Q es capaz de obligar a β-catenina [21] y su re-expresión en
Vdr
- /- ratones rescata la alopecia, pero no el raquitismo fenotipo [38]. Parece, por tanto, que el nivel y la actividad β-catenina nuclear dependen de la capacidad de VDR para reclutar coactivadores transcripcionales clásicos.
Nuestros datos muestran que el VDR knock-down en las células SW480-ADH no afecta a β-catenina fosforilación por CK-Iα o GSK-3β, descartando un papel de VDR regula la acumulación total de β-catenina. Considerando nucleares de nivel de β-catenina aumenta en ausencia de VDR, la cantidad celular total de la proteína β-catenina no se altera (Figura S4a). Inesperadamente, también se encontró que la fosforilación de β-catenina en Ser552 y Ser675 propone aumentar β-catenina actividad transcripcional se reduce en las células SW480 shVDR-ADH. Sin embargo, el efecto inhibidor putativo que la reducción de estas fosforilaciones puede tener sobre la actividad transcripcional β-catenina parece ser sobrepasado por el efecto de la deficiencia de VDR aumento de β-catenina translocación nuclear. En conjunto, estos datos sugieren que el VDR no controla la degradación de β-catenina pero lo más probable favorece su redistribución al núcleo celular.
Nuestros resultados revelan una novela
in vivo
función del VDR como modulador fundamental de la intensidad de la señal Wnt /β-catenina en el cáncer de colon. El hallazgo de que
VDR
deficiencia no cambia el número de tumores, pero aumenta la carga tumoral indica que VDR no bloquea las mutaciones iniciales que provocan la pronta activación de la vía /β-catenina Wnt, pero que tiene preferentemente un efecto protector a largo plazo sobre el crecimiento tumoral mediante la limitación de la fuerza de la señal oncogénica Wnt /β-catenina. Concordante con nuestros resultados, un informe muy reciente ha demostrado que
Apc
min /+ Vdr
- /- ratones
presentan tumores intestinales más grandes que
Apc
min /+ Vdr
+ /+ ratones
, aunque los mecanismos moleculares detrás de este fenotipo no se ha investigado [39]. La concordancia de los dos estudios paralelos confirma sus principales conclusiones.
Los resultados de nuestro estudio son relevantes para la clínica, como la expresión de VDR es downregulated en aproximadamente dos tercios de los tumores de colon avanzados asociados a la regulación positiva de
Snai1 Opiniones y
SNAI2
genes que codifican para SNAIL1 represores /Snail2 transcripcional [15], [16], [40]. Barra de escala, 500 micras. Barra de escala, 100 micras.