Extracto
proteínas y microRNAs exosomas han ganado mucha atención como herramientas de diagnóstico y el potencial biomarcador en diversos tumores malignos, incluyendo el cáncer de próstata (CaP). Sin embargo, el papel de los exosomas y los receptores asociados a la membrana, en particular epidérmico receptor del factor de crecimiento (EGFR) como mediadores de la proliferación celular y la invasión en la progresión del CaP permanece sin explorar. EGFR se sobreexpresa con frecuencia y se ha asociado con formas agresivas de CaP. Mientras que las células y los tejidos con CaP expresan EGFR, se desconoce si los exosomas derivados de células de CaP o suero del paciente CaP contiene EGFR. El objetivo de este estudio fue detectar y caracterizar EGFR en exosomas derivados de células de CaP, xenoinjerto LNCaP y en el suero de pacientes CaP. Los exosomas se aislaron de medio acondicionado de diferentes líneas de células de CaP; LNCaP suero xenoinjerto, así como el plasma del paciente /suero por centrifugación diferencial y ultracentrifugación en un gradiente de densidad de sacarosa. Los exosomas se confirmaron mediante microscopía electrónica, la expresión de marcadores exosomal y NanoSight
™ análisis. la expresión de EGFR se determinó por análisis de transferencia Western y ELISA. Este estudio demuestra que los exosomas fácilmente se pueden derivar de líneas de células de CaP, suero obtenido de CaP xenoinjerto de ratones y muestras clínicas procedentes de pacientes con CaP cojinete. La presencia de EGFR exosomal en exosomas de pacientes con CaP puede presentar un nuevo método para la medición del estado de enfermedad. Nuestro trabajo permitirá construir en este hallazgo para la futura comprensión de exosomas con CaP y su posible papel en la progresión del CaP y biomarcadores invasivos como mínimos para CaP
Visto:. Kharmate G, Hosseini Beheshti-E, J Caradec, Chin MI, ES Tomlinson armas (2016) Crecimiento epidérmico receptor del factor en el cáncer de próstata derivadas de exosomas. PLoS ONE 11 (5): e0154967. doi: 10.1371 /journal.pone.0154967
Editor: Daotai Nie, Escuela de Medicina de la Universidad del Sur de Illinois, Estados Unidos |
Recibido: 9 Enero, 2015; Aceptado: 21 Abril de 2016; Publicado: 6 Mayo 2016
Derechos de Autor © 2016 Kharmate et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
financiación:. EG recibió fondos de la Fundación Terry Fox. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata (CaP) es la segunda causa principal de muerte entre los hombres occidentales. actividad conservada del receptor de andrógenos es el principal motor de CaP progresión y metástasis [1, 2]. etapa temprana CaP es curable, sin embargo, un tercio de los casos evolucionan a un CaP más agresivo con una mala supervivencia de los pacientes [3]. A pesar de la disponibilidad de varias estrategias terapéuticas dirigidas a las metástasis, y la gestión de recaída de la enfermedad sigue siendo un reto. Por lo tanto, la detección temprana éxito del CP es de gran importancia. Aparte de los procedimientos /pruebas de diagnóstico de uso común, tales como pruebas de antígeno prostático específico (PSA) y el tacto rectal [4], una necesidad crítica que nos queda por descubrir nuevos biomarcadores y desarrollar un análisis más sensibles aún mínimamente invasivas para el diagnóstico mejor y más temprana del CP.
Existe una creciente evidencia que sugiere que el cáncer de células liberan microvesículas de 30-100 nm de diámetro conocido como '
exosomas'
, y que los exosomas se encuentran fácilmente en los fluidos biológicos, como el plasma, suero, ascitis maligna, la orina y la leche materna [5, 6]. Los exosomas se derivan de endosomas tardíos conocidos como cuerpos multivesiculares (MVBs) y se liberan sobre la fusión de las MVBs con la membrana plasmática [7]. Los exosomas contienen proteína única y ARN de carga que se libera en el microambiente celular y por lo tanto puede promover la comunicación célula-célula, además de otros mecanismos [8, 9]. Recientemente, nuestro laboratorio y otros han demostrado que células de CaP benigna, así como con o sin andrógenos exosomas de liberación receptor (AR) [9, 10]. Además, un lípido general y un análisis proteómico reveló diferencias distintas en los perfiles de proteínas de exosomas derivados de benigna en comparación con líneas de células de CaP malignos [9, 11, 12]. Los estudios han demostrado que los exosomas contienen proteínas asociadas a la membrana que actúan como mediadores de crecimiento de las células y es probable que confieren cambio fenotípico celular a través de la comunicación celular [13-15]. Sin embargo, el papel de los receptores de factores de crecimiento asociados a la membrana de componentes de exosomas como mediadores de la proliferación celular y la invasión permanece sin explorar.
Además de los andrógenos, crecimiento de la próstata y la función está en parte regulada por varios factores de crecimiento y sus receptores afines, uno de los cuales es el factor de crecimiento epidérmico y su receptor (EGFR) [16, 17]. EGFR es un proto-oncogén y transmembrana del receptor de 170 kDa que es típicamente sobre-expresan en diversos tumores malignos incluyendo CaP [18]. la unión a EGFR ligando induce la dimerización, la fosforilación y la internalización de EGFR que luego desencadenar una red de vías de señalización intracelular, lo que resulta en la síntesis de ADN, la proliferación celular, la migración y la adhesión [18]. Se ha demostrado que casi el 30% de los casos de CaP sobreexpresan EGFR y que la desregulación de las vías de señalización mediada por EGFR se asocia con pobres resultados clínicos [19, 20]. Aunque EGFR se identifica como un objetivo importante anti-tumor, se ha demostrado que las terapias contra EGFR utilizando pequeños inhibidores de la tirosina quinasa tales como gefitinib, lapatinib y Erlotinib tener una eficacia limitada en el CaP [21-23]. Mientras que el tráfico intracelular, reciclado y degradación de EGFR se han investigado extensivamente, se sabe muy poco acerca de si EGFR escapa a la degradación lisosomal y en su lugar se libera selectivamente extracelularmente a través de exosomas.
In vitro
estudios han demostrado que los exosomas aislados de células inmunes y cancerosas contienen EGFR, los ligandos de EGFR y isoformas solubles de EGFR. Además, las células tumorales liberan exosomas y /o carga exosomal en la circulación sanguínea de los pacientes de cáncer [24-29]. Estas observaciones nos han llevado a la hipótesis de que el EGFR podría ser liberado de forma selectiva a través de los exosomas y muy bien pueden desempeñar un papel en la progresión del CaP. Además, la posibilidad de que la captación selectiva de EFGR en exosomas puede ser, al menos en parte, responsable de la falta de resultado clínico no puede ser anulada, sin embargo no análisis comparativo entre los contenidos exosomal y las células tumorales se ha hecho en este manuscrito. Para determinar si los exosomas derivados CaP contienen EGFR, hemos aislado y caracterizado exosomas de un panel de células de CaP, así como suero de ratones xenoinjertados LNCaP y en el suero /plasma de pacientes con CaP. Se trata de un primer informe que muestra que el EGFR está contenida en los exosomas derivados de las líneas celulares de CaP, tanto LNCaP xenotrasplante y el suero de pacientes CaP. Estas observaciones son alentadores para seguir investigando el posible papel de los exosomas contienen EGFR en favor de la supervivencia y mecanismos de resistencia a tratamiento, así como posibles marcadores biológicos en el diagnóstico y la progresión del CaP.
Materiales y Métodos
Ética declaración
Frozen CaP plasma del paciente /suero fue adquirido de una sangre y el tejido depósito privado, Global biorepositorio BioServe, 9000 Virginia Manor Road, suite 207, Beltsville, MD 20705 EE.UU. (http://www.bioserve.com/-muestras humanas /-biorepositorio-overview.cfm global). El suero de control se obtuvo de 31 años de edad voluntario varón sano con un consentimiento verbal aprobado por el comité de ética (Certificado#H09-01010). La Universidad de Columbia Junta Ética de Investigación Clínica británica (certificado#H09-01010) aprobó el uso de suero humano adquirido comercialmente que se utilizará para el propósito de esta investigación.
La aprobación para el trabajo con animales se obtuvo de la Universidad del Comité Institucional de Cuidado de Animales de la Columbia británica (IACC,#A11-0337). Durante el estudio, el cuidado, alojamiento y uso de los animales se realizó de acuerdo con el Consejo Canadiense para el Cuidado de Animales Directrices y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento.
Cell Culture
cáncer de próstata humano células, las células LNCaP [30] y C4-2 se mantuvieron en medio RPMI 1640 mientras que DU145 y PC3 en Dulbecco medio de Eagle modificado (DMEM) suplementado con 5% de SFB (Invitrogen) y los antibióticos, a 37 ° C en 5% de CO2. células benignas RWPE-1 también se cultivaron en queratinocitos-SFM (KSFM) con suplemento de crecimiento (GIBCO) y 1% de penicilina-estreptomicina (Invitrogen). Las células fueron cultivadas a 60-70% de confluencia y privaron de suero durante 48-72 horas antes de exosomas aislamiento. Todas las líneas celulares se obtuvieron de ATCC.
se prepararon muestras de suero
ratones portadores de xenoinjertos de LNCaP tal como se describe anteriormente [31, 32]. Brevemente, los ratones atímicos se inocularon con células de 2 x 10
6 LNCaP. Los tumores se cultivaron durante 28 días después de lo cual el suero se deriva de la sangre extraída por punción cardiaca en euthanisation. Las muestras de suero se recogieron por a partir de tres ratones desnudos de control y tres ratones con diversos tamaños de los tumores: pequeño (& lt; 400 mm
3); medio (400-1000mm
3) y grandes (& gt; 1000 mm
3). Congelado CaP plasma del paciente /suero fue adquirido de una sangre y el tejido depósito privado, Bioserve (Beltsville, MD, EE.UU.). Cuatro muestras de plasma y tres de suero humano obtenidas de pacientes con CaP (Tabla 1) se analizaron en este estudio. El suero de control se obtuvo de dos 31 años de edad varones sanos. La aprobación se obtuvo de la Universidad de British Columbia Junta Ética de Investigación Clínica de suero humano que se utilizará para el propósito de esta investigación
Los anticuerpos
Los anticuerpos utilizados fueron:. Anti-ratón CD-9 (C-4,#sc-13118), ratón anti-Alix (1a12,#sc-53540) y de cabra anti-EGFR (N-20,#sc-31155) de Santa Cruz Biotechnology Inc, (Santa Cruz , CA); conejo anti-LÁMPARA2 (# ab37024) de Abcam (Toronto, ON) y de conejo anti-GRP94 (# 2104) de Señalización Celular Tecnología (Whitby, ON). Todos los anticuerpos primarios se utilizaron a una concentración de 1: 1000 para los análisis de transferencia de Western. Los anticuerpos secundarios utilizados para la detección fueron Alexa Harina 680 burro anti-conejo (# A10043, 1: 10000), burro anti-ratón (# A10038, 1: 10.000) y burro anti-cabra (# A21084, 1: 10000) de la Vida Technologies (Invitrogen), Burlington ON.
Preparación de fracciones exosomas
Los exosomas de células de CaP se aislaron mediante método de centrifugación en serie como se describe anteriormente [9]. muestras de suero de pacientes de plasma /suero o de xenoinjerto LNCaP congeladas se diluyeron con tampón de fosfato salino (PBS) en una relación 1: 1 [33]. Las muestras de plasma /suero fueron pre-tratados con anticuerpo anti-IgG (dilución 1: 500) acoplado a A /G sepharose perlas (25 l) para precipitar las inmunoglobulinas no específicas excesivas. Después de una incubación durante la noche a 4 ° C, las muestras pretratadas se centrifugaron a 5000x
g
por 15 min y el suero pre-aclarado se usó para el aislamiento de exosomas usando un método estándar de ultracentrifugación se informó anteriormente [9, 33 ]. Brevemente, las muestras de suero pre-aclarado pasaron por una serie de etapas de centrifugación (2000x
g
durante 20 min y 20.000X
g
de 45 min) y después se transfirieron a solución de sacarosa al 30%, seguido por ultra-centrifugación a 110,000x
g
durante 2 h. exosomas aislados fueron recuperados de la solución de sacarosa y se almacenaron a -80 ° C hasta su análisis adicionales.
microscopía electrónica de transmisión (TEM)
Los exosomas aislada de suero de xenoinjertos de LNCaP y el plasma del paciente PCA /suero eran adsorbido sobre resplandor dados de alta 300 Formvar malla /rejillas TEM recubiertas de carbono (Ted Pella, Redding California, EE.UU.) durante 5 min. Las muestras se tiñeron negativamente con acetato de uranilo acuoso al 2% durante 5 min y se observaron con un Hitachi H7600 TEM operado a 80 kV (Hitachi High-Technologies Corp., Tokyo, Japón). Las imágenes fueron capturadas con un lado montado 1K AMT Advantage cámara digital (Técnicas de microscopía avanzada, Corp. Woburn, MA, EE.UU.) [9].
NanoSight
™ rastreo de partículas análisis
La tamaño y concentración de los exosomas aislados fueron analizados utilizando el NanoSight
™ sistema de LM10-HS10 (NanoSight Amesbury, Reino Unido) como se ha descrito recientemente [34]. Cada muestra se diluyó en exosomas exosomas libres PBS pre-filtrada para obtener la concentración medible entre 0,5 × 10
8 y 5 × 10
9 partículas /ml. Para el análisis, un haz de láser monocromática (405 nm) se aplicó a los exosomas de plasma diluido que se inyectó en una unidad de visualización LM12 utilizando un láser sistema de jeringa controlada. NanoSight
™ seguimiento de análisis (NTA) software de la versión 2.3 se analizaron las muestras a una temperatura constante (25 ° C) con una velocidad de obturación de la cámara a los 60 milisegundos y la ganancia establecida en 1400. El software NTA producido seis vídeos de una duración de 60 segundos, con un retardo de 5 segundos entre las grabaciones de la creación de seis replicados histogramas que se promediaron para dar la estimación final del tamaño de partícula y la concentración de los exosomas. ajustes NTA fueron pre-optimizado y mantienen constantes entre las muestras.
Western blot
exosome muestras se procesaron en el ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) tampón para liberar el contenido exosomal. a continuación, la concentración de proteína se midió usando el kit de ensayo de proteínas BCA de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Thermo Scientific Pierce). La misma cantidad de proteína (30μg) se cargó para cada muestra en un gel de SDS-PAGE 10%. marcadores exosomal se identificaron utilizando anticuerpos primarios específicos para lisosomal asociada a membrana de proteína-2 (LAMP-2) (1: 1000), CD-9 (1: 1000) y Alix (1: 1000). La expresión de EGFR en exosomas derivados de líneas celulares de CaP plasma /suero, así xenoinjerto o humano se detectó usando anticuerpo de cabra anti-EGFR que detecta EGFR de origen humano y de ratón.
ELISA para la detección de EGFR
niveles de EGFR en exosomas aisladas de LNCaP xenoinjerto y el plasma /suero del paciente se determinó usando el kit de ELISA EGFR (Sigma Aldrich,#RAB0160) de acuerdo con el protocolo del fabricante. se añadieron liofilizado estándar humano EGFR proteína, plasma /suero completo y exosomas muestras a la placa de 96 pocillos que fue pre-revestido con anticuerpo anti-EGFR humano para 2,5 h a TA. RWPE-1 lisado celular se utilizó como control positivo. Se añadió anticuerpo biotinilado EGFR durante 1 hora a temperatura ambiente siguientes lavados. entonces HRP-estreptavidina se incubó durante 45 min. se añadió ELISA colorimétrico 3,3 ', 5,5-tetra-tetrametilbenzidina (TMB) se añadió durante 30 min en la (solución de parada) oscuro y 0,2 M de ácido sulfúrico inmediatamente para detener la reacción en la que el producto de color amarillo se midió a 450 nm usando un lector de ELISA automatizado (Rayto, RT-1904C analizador químico, Atlanta GA, EE.UU.) a 450 nm. Los resultados representan la cantidad de EGFR en plasma sin procesar y exosomas purificados como ng /ml. El ensayo se repitió dos veces y con cada muestra por triplicado.
Análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó utilizando GraphPad Prism 6.0. La diferencia entre exosomal EGFR en pacientes con CaP y sujetos control se analizó aplicando el test t de Student. Los datos se expresan como media ± SEM.
Resultados
tres veces enriquecimiento de exosomas en el suero de pacientes CaP que los controles sanos
Caracterización de los exosomas aisladas de suero de ratón LNCaP y xenoinjertado plasma del paciente PCA /suero se llevó a cabo usando TEM, NanoSight analiza
™ y Western blot, colectivamente. Los análisis TEM reveló una mayoría de vesículas en el rango de tamaño de 100 nm, que eran características de los exosomas, de acuerdo con su morfología clásica en forma de copa, en células representativas C4-2 CaP, LNCaP suero xenoinjerto, así como suero de paciente PCA (Fig 1). La presencia de exosomas se confirmó adicionalmente usando NanoSight
™ tecnología como descrito recientemente [34]. Las figuras 2 y 3 mostraron perfiles de NTA de exosomas con un único pico que representa el tamaño medio de los exosomas (85-150nm), como por el tamaño de los exosomas reportados rutinariamente en la literatura. Hemos observado que la concentración total de los exosomas derivados de suero de los ratones de control era de 1,98 x 10
11 partículas /ml (Figura 2A). Es interesante que el número de partículas aumenta en el suero derivado de ratones portadores de pequeña (2,2 x 10
11, figura 2B), media (3,98 x 10
11 Fig 2C) y grandes (6,66 x 10
11 Fig tumores 2D) que sugieren que los exosomas son más abundantes en los ratones portadores de tumor que los ratones normales. Además, se midió el número de exosomas de suero derivado de pacientes con CaP humano control y. Fig 3A mostró que el suero humano de control contenía 4,15 x 10
11 partículas /ml, mientras que el CaP plasma del paciente (13,3 x 10
11) y suero (9,9 x 10
11) mostró un aumento de dos veces en el número de las partículas que indican que las células tumorales producen más exosomas que las células normales (Fig 3B y 3C). El NanoSight analizó entre 3000-4000 partículas y por lo tanto el SEM fue baja entre ± 0,12 hasta 0,35.
Imágenes representativas TEM de exosomas derivados de a) el suero LNCaP xenoinjerto C42 CaP línea de células B) y C) por el plasma del paciente método de ultracentrifugación. Los exosomas se tiñeron negativamente con acetato de uracilo 2% después de la eliminación de la humedad. Las flechas indican las estructuras en forma de copa que se identifican como exosomas (30-100 nm de diámetro).
El análisis mostró que significa que el tamaño de los exosomas aisladas de ratón de control fue de 126 nm (a) mientras que xenoinjerto LNCaP ratones portadores de tumor pequeño fue 81nm (b), 137 nm a partir de medio (c) y 67 nm de tumores grandes (d). La concentración de los exosomas secretada aumenta con el aumento del tamaño del tumor.
NTA perfiles de exosomas muestran un solo pico que representa el tamaño medio de las partículas y la concentración de los exosomas del sujeto normal (a) y el plasma del paciente ( b) y suero (c). El tamaño medio de partícula de 120 nm ~ nm confirmó la presencia de exosomas. Los exosomas derivados de pacientes CaP fue significativamente más alto que el suero humano de control.
Identificación de marcadores confirmar exosomas el aislamiento del suero
Se realizaron análisis de Western blot para determinar la expresión de exosome-específica marcadores. Como se muestra en la figura 4A, CD-9 (tetraspanin), un marcador exosomal unida a la membrana de uso común fue mayor en el suero de pequeñas xenoinjertos de LNCaP, en comparación a la de los exosomas de control del ratón nude. Curiosamente, no hemos visto una expresión significativamente mayor en los tumores de gran tamaño. Estos datos también se correlacionó con los datos NanoSight (Fig 2) que muestra el mayor número de exosomas en el suero de los ratones portadores de tumor que el suero de control del ratón. A fin de validar la pureza de las fracciones de exosoma obtenidos, se determinó la presencia de un conocido marcador de GRP94 retículo endoplásmico en los exosomas aisladas a partir de muestras de suero de xenoinjerto. Nuestros datos muestran falta de GRP94 en las fracciones de exosoma, lo que indica el enriquecimiento de éxito y el aislamiento de exosomas de muestras de suero a través de sacarosa asistida por ultra-centrifugación. La expresión de lisosomal asociada a membrana de proteína-2 (LAMP-2) y Alix también fue investigado como un marcador exosome alternativa. La figura 4B y 4C mostraron que se detectó LAMP-2 y Alix en fracciones de suero exosome CP /derivados de plasma y era dependiente de la concentración. Mientras que el plasma completo estaba desprovista de LAMP-2, indicando de nuevo la calidad de los exosomas enriquecidos para durante el aislamiento.
a) CD9 estaba presente en exosomas derivados de ratones de xenoinjerto LNCaP portadores de tumores LNCaP pequeñas, medianas y mientras que el control suero de ratón carecía de CD9. GRP94, una conocida proteína del retículo endoplasmático que se utiliza como un control negativo estaba ausente en los exosomas que sugieren enriquecimiento b) LAMP2 estaba presente en exosomas derivados de plasma del paciente mientras que CaP ausencia de LAMP2 en plasma entero indicado enriquecimiento exitoso. c) Alix estaba presente en exosomas derivados de plasma del paciente a diferentes concentraciones de proteína exosomal.
exosomas derivados CaP contienen EGFR
EGFR es un regulador potente celular asociada con la progresión del CaP avanzado. A continuación se determinó si las células de CaP y exosomas derivados de suero contienen EGFR. Fig 5A muestra la expresión diferencial de longitud completa 170kDa EGFR en lisados de células totales, así como exosomas fracciones derivadas de un panel de AR-positivo (LNCaP, C4-2, RWPE-1) y AR-negativo (DU145, PC3) líneas celulares . En general, la presencia de EGFR en lisados de células totales es mayor que sus homólogos exosome, mientras que los exosomas derivados de células muestran el contenido de EGFR variable para diferentes líneas celulares. A continuación se determinó la presencia de EGFR en los
in vivo
muestras. Los exosomas de suero ratones control mostraron sin embargo no EGFR exosomas aislado a partir de suero de xenoinjertos de LNCaP contenida EGFR independientemente de la presencia del tamaño del tumor y el tumor (Fig 5B).
EGFR estaba presente en exosomas derivados de a) el panel de AR -responsive células y AR-realidad, o de próstata benigna epiteliales (RWPE-1) y en comparación con el lisado celular, b) el control del ratón nude y suero de xenoinjertos de LNCaP. c) EGFR está contenida en exosomas derivados de plasma cuatro diferentes CaP de los pacientes (1-4), 3 muestras de suero (5-7) y sujeto de control y en el plasma sin procesar desde sujeto de control y el paciente (1 y 2). d) La expresión de EGFR en 170kDa y 110 kDa en suero y plasma se incrementa con el aumento de la concentración de proteína de carga. Curiosamente, no es una cantidad significativa de EGFR en plasma sin procesar que es en adición a la fracción exosomal. El histograma (e) muestra los niveles de EGFR (ng /ml) medidos por ELISA en el plasma sin procesar a partir de sujetos control y CaP paciente plasma /suero y exosomas derivados de correspondiente plasma /suero. Los niveles de EGFR en suero son relativamente similares en los sujetos control y PCA mientras que los exosomas aislados de suero de paciente CaP contenían cantidades significativamente mayores de EGFR que el sujeto control. Los datos representados como media ± SEM, * p & lt;.
0,05
Con el fin de validar la relevancia clínica de EGFR exosomal, se examinó si los exosomas aisladas de plasma del paciente PCA /suero contenía EGFR. Los análisis de transferencia Western mostró niveles detectables de una de longitud completa 170kDa EGFR en dos de las cuatro fracciones de exosoma del plasma del paciente CaP y las tres muestras de suero, mientras que los exosomas de muestras de control fueron negativos para EGFR (figura 5C). Como se muestra en la figura 5D, exosomas contenían EGFR de una manera dependiente de la concentración. Más interesante, el suero completo no procesado también mostró niveles considerables de EGFR que sugiere la presencia de la forma EGFR soluble circulante en el suero de pacientes con CaP como se informó anteriormente para el suero del paciente de cáncer de páncreas en un estudio de la exploración de los exosomas en el suero de esta población de pacientes [35] . Además, se detectaron niveles de EGFR en todo el plasma /suero y exosomas derivados de pacientes con CaP y sujeto de control utilizando el ensayo ELISA (Figura 5E). medición de ELISA mostró que los niveles de EGFR solubles en el plasma o suero del paciente no fueron notablemente diferente que el suero de control; Sin embargo, los niveles de EGFR fueron significativamente mayores en los exosomas derivados del plasma /suero de pacientes con CaP en comparación con el sujeto de control.
Discusión
Los exosomas que circula en la sangre puede proporcionar información importante que puede ser a menudo descuidado en las evaluaciones de pronóstico. Nuestro laboratorio ha publicado recientemente un extenso análisis proteómico y lípidos de los exosomas derivados de células de CaP
in vitro
con el fin de proporcionar una idea de biomarcadores de proteínas candidatas que exosomas tienen el potencial de producir [9]. También hemos establecido un método reproducible para el aislamiento y la cuantificación de los exosomas de suero humano [34]. La liberación de los exosomas en sangre, orina y otros fluidos biológicos así, la posibilidad de utilizar métodos no invasivos para la evaluación de pronóstico y diagnóstico de CaP en pacientes. Este trabajo, centrándose en la relevancia de EGFR en el CP, describe el aislamiento y caracterización de los exosomas derivados de
in vitro
,
in vivo
y muestras clínicas CaP como una extensión de nuestro trabajo previo en el CaP líneas celulares [9] [34].
Nuestro estudio demuestra la presencia de EGFR en exosomas purificados a partir de células de CaP cultivado
in vitro
, suero de ratones portadores de xenoinjertos de LNCaP y en el suero de pacientes CaP. Varios informes han indicado la presencia de EGFR en exosomas derivados de glioblastoma, de páncreas, cáncer de mama y de ovario líneas celulares
in vitro Opiniones y en exosomas de suero de los pacientes de cáncer de pulmón, sin embargo limitada se sabe de EGFR en exosomas derivados [CaP ,,,0],36-39]. EGFR es a menudo pasado por expresa y se asocia con la señalización aberrante que conduce a enfermedades malignas agresivas y pobre tasa de supervivencia de los pacientes [40]. En CaP, hiperactividad de EGFR está vinculada con la independencia de andrógenos y la metástasis de las células de cáncer de próstata [41, 42]. Desde exosomas están involucrados en la comunicación celular por células que altera el fenotipo de las células receptoras /objetivo [43-45], exosomal-EGFR expresado por varios tipos de tumores, incluyendo CaP puede jugar un papel importante en la progresión del cáncer. Hemos observado que el número de exosomas fue significativamente mayor en el suero y CaP xenoinjerto que el control, lo que sugiere que los exosomas pueden presentar una herramienta para diferenciar el estado normal y la enfermedad. Nuestros resultados están de acuerdo con un estudio reciente realizado por Turay y col donde muestran que los números exosome aumentaron específicamente en el suero de pacientes con CaP en comparación con sus homólogos de control [46]. Se cree que el tumor exosomas tener papel en el desarrollo de resistencia a las terapias anti-tumorales [47, 48]. Sin embargo mientras que los datos pre-clínicos indican que EGFR desempeña un papel significativo en la progresión del CaP [21]; ensayos clínicos con inhibidores de EGFR (gefitinib, erlotinib o lapatinib) han demostrado un beneficio limitado a los pacientes con CaP [22, 23, 49].
isoformas solubles de EGFR (sEGFR) también se han identificado en los medios acondicionados de mama, el cáncer no microcítico de pulmón de células y células de cáncer pancreático, así como que circula en la sangre [35, 50, 51]. Sin embargo, existe poca información acerca de la función mecánica y propiedades bioquímicas de estas isoformas. Hay evidencia de que de longitud completa EFGR somete a escisión proteolítica y novedosas isoformas [52, 53]. Por otra parte, un receptor de cuerpo entero y una isoforma soluble de 65 kDa se han identificado en los exosomas liberados a partir de líneas celulares de queratinocitos humanos [50]. Del mismo modo, se observó una longitud completa 170kDa EGFR y una banda a 110 kDa en el plasma del paciente y los exosomas derivados del suero lo que sugiere que las isoformas solubles de EGFR pueden estar presentes en exosomas, además de la 170kDa EGFR. Curiosamente, en líneas celulares de CaP y LNCaP xenoinjerto de suero de ratón llevan este tipo de bandas no se observaron. Nuestra observación está apoyada por un estudio similar en células de cáncer de mama y el suero del paciente que especula la presencia de factores de crecimiento solubles que circulan en el paciente suero [54]. También se detectó una banda a 110 kDa en el plasma /suero del paciente que posiblemente podría ser la isoforma soluble libre de EGFR. informes anteriores que muestran la proteína EGFR soluble en el suero de pacientes con cáncer de mama metastásico y el cáncer de pulmón podría apoyar nuestros resultados [39, 54]. Aunque en pacientes con cáncer de mama, las isoformas solubles de EGFR se asociaron con una tasa de supervivencia a corto, algunos implica una mayor sEGFR o ninguna diferencia entre los individuos sanos y pacientes [39]. Sin embargo, la estimación de los niveles de sEGFR en exosomas y sangre periférica puede proporcionar relevancia clínica en cánceres metastásicos. Las isoformas de EGFR que están presentes en el suero del paciente CaP tienen claramente un papel no identificado en la tumorigénesis y se necesitan más ensayos cuantitativos para la evaluación de estas isoformas en exosomas derivados de PCa. En resumen, el presente estudio muestra exosomas son secretadas en abundancia en el suero de ratones portadores de tumores xenoinjertados y pacientes con CaP que sus homólogos de control. Además, este estudio EGFR identificado en exosomas secretadas y proporciona pruebas convincentes de que circula EGFR puede ser constitutivo en exosomas y la evaluación adicional de los exosomas EGFR en suero de paciente CaP puede identificar su papel en la resistencia de las terapias EGFR dirigidos a prueba en la clínica contra la progresión CaP ( representación esquemática de la función de EGFR, como se muestra en la figura 6).
La unión del ligando induce la activación rápida y la internalización de EGFR y la endocitosis. Ya sea EGFR escapa a la degradación lisosomal y se libera extracelularmente a través de los exosomas se desconoce. La transferencia de EGFR a través de exosomas puede alterar significativamente el microambiente del tumor y podría ser relevante para la progresión de un CaP agresivo.
Apoyo a la Información
S1 Lista de verificación. NC3Rs LLEGA Directrices Lista de verificación
doi:. 10.1371 /journal.pone.0154967.s001 gratis (DOCX)
S1 Fig. El análisis de transferencia Western que muestra la expresión de CD9 en exosomas derivados de ratones de xenoinjerto LNCaP portadores de tumores LNCaP pequeñas, medianas y que el suero de control del ratón carecía CD9
doi:. 10.1371 /journal.pone.0154967.s002 gratis (TIF)
. S2 figura . Transferencia Western que muestra de gel sin recortar llena de GRP94 Empresas El exosomas carecía de la presencia de GRP94 confirmando el éxito en el aislamiento
doi:. 10.1371 /journal.pone.0154967.s003 gratis (JPG)
Agradecimientos
Agradecemos el apoyo de la Fundación Terry Fox para apoyo salarial que permitió a la finalización de los trabajos descritos.