Extracto
La mayoría de los casos clínicos de cáncer de hígado no pueden diagnosticarse hasta que han evolucionado a una etapa avanzada, lo que resulta en alta mortalidad. Es bien reconocido que la aplicación de métodos de detección temprana y el desarrollo de terapias dirigidas para el cáncer de hígado son esenciales para reducir las altas tasas de mortalidad asociadas con esta enfermedad. Para lograr estos objetivos, se necesitan sondas moleculares capaces de reconocer los objetivos específicos de las células de cáncer de hígado. Aquí se describe un panel de aptámeros capaces de distinguir hepatocarcinoma a partir de células hepáticas normales. Los aptámeros, que han sido seleccionados por SELEX basado en células (Evolución Sistemática de Ligandos por Enriquecimiento Exponencial), han kD valores en el rango de 64 a 349 nM hacia el celular de hepatoma humano HepG2 objetivo, y también reconocer las células de cáncer de ovario y adenocarcinoma de pulmón. El experimento tratamiento de proteinasa indicó que todos los aptámeros pueden reconocer las células HepG2 objetivo a través de proteínas de la superficie. Este resultado sugiere que estos aptámeros podrían ser utilizados como sondas potenciales para futuras investigaciones en estudios de cáncer, como el desarrollo de ensayos de detección temprana, terapias dirigidas, y agentes de imagen, así como para la investigación de las proteínas de membrana comunes en estos tipos de cáncer distinguibles.
Visto: Xu J, Teng TI, Zhang L, S Delgado, Champanhac C, Cansiz S, et al. (2015) El reconocimiento molecular de las células del cáncer de hígado humano Uso de aptámeros de ADN generados a través de la célula-SELEX. PLoS ONE 10 (5): e0125863. doi: 10.1371 /journal.pone.0125863
Editor Académico: Vittorio De Franciscis, Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR), Italia
Recibido: 26 Febrero, 2015; Aceptado: March 25, 2015; Publicado: 4 Mayo 2015
Derechos de Autor © 2015 Xu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
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Financiación:. Este trabajo fue financiado por los Institutos nacionales de Salud y GM079359 Institutos nacionales de Salud CA133086; Fondo de becas del Estado, PI = Jiehua Xu; Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China 81101866, PI = Jiehua Xu; Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China 81430041, PI = Jiehua Xu; y Fondos de Investigación Fundamental de la Universidad Central de 11ykpy41, PI = Jiehua Xu. Los proveedores de fondos no tiene función alguna en degign estudio, la recogida y el análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de hígado es el sexto cáncer más común en el mundo y la tercera causa principal de muerte relacionada con el cáncer [1], lo que resulta en 0,7 millones de muertes al año. A medida que el órgano interno más grande y el más grande de la glándula en el cuerpo humano, el hígado sirve para muchas funciones vitales, incluyendo la ruptura y el almacenamiento de nutrientes necesarios para la producción de energía o la reparación de tejidos, el filtrado y la degradación de desechos tóxicos en la sangre, la síntesis de la mayoría de los factores de coagulación que mantener el cuerpo de una hemorragia masiva, y la producción de productos químicos y hormonas necesarias para la regulación de muchas funciones corporales. A pesar de este papel fundamental, el desarrollo de cáncer de hígado rara vez se diagnostica en sus primeras etapas, ya que, en la mayoría de los casos, los signos y los síntomas no aparecen hasta las últimas etapas, por lo que es un tumor maligno altamente letal con una pequeña tasa de supervivencia a 5 años. Por lo tanto, el desarrollo de métodos de detección temprana y terapias dirigidas avanzado es esencial en la lucha contra el cáncer de hígado.
Los aptámeros son oligonucleótidos cortos, de una sola cadena de ADN o ARN capaces de unirse a una serie de moléculas diana correspondiente con una alta afinidad específica. El método de generación de aptámeros llamado SELEX (evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial) [2, 3] sigue una serie de pasos: 1) la síntesis química de una biblioteca de oligonucleótido que tiene 10
13-10
16 monocatenario moléculas de ácido nucleico, 2) exposición directa de la biblioteca para los objetivos que se diferencian hilos de unión de los espectadores, 3) la extracción y amplificación de los supervivientes, 4) el enriquecimiento de los supervivientes de aptámero por rondas iterativas, y, por último, 5) de secuenciación para identificar individuo candidatos.
la tecnología SELEX se desarrolló más en nuestro laboratorio para utilizar células completas como objetivos en el proceso de selección de aptámeros. El proceso de la célula-SELEX asegura que los oligonucleótidos candidatos se unen al estado nativo de los objetivos de proteínas en la superficie de células de cáncer [4]. El uso de células-SELEX, aptámeros pueden ser generados para las células enfermas sin conocimiento previo de la firma molecular de un objetivo determinado, por lo que es posible descubrir sondas moleculares para enfermedades con biomarcadores hasta ahora desconocidos, que posteriormente pueden ser identificados usando métodos de biología molecular química y [5 , 6]. Un número de aptámeros capaces de reconocer diferentes tipos de células, incluyendo las células rojas de la sangre (RBC) [7], y células de la leucemia linfocítica [4], la leucemia mieloide [8], el cáncer colorrectal [9], cáncer de mama [10], de ovario cáncer [11], el cáncer de pulmón de células pequeñas [12], el cáncer no microcítico de pulmón de células [13, 14], y el cáncer de páncreas [15], han sido generados usando este método. Además, los pares de biomarcadores-aptámero varios de la superficie celular han sido identificados, incluyendo la fosfatasa alcalina placentaria-como 2 (ALPPL-2) [15], Prominin-1 (CD133) [16], factor de crecimiento epidérmico receptor (EGFR) [17] , factor de crecimiento epidérmico humano receptor 2 (HER2) [18, 19], de inmunoglobulina de la cadena mu pesada (IGHM) [20], proteína tirosina quinasa 7 (PTK7) [4, 5], y sus correspondientes aptámeros. El descubrimiento de los aptámeros específicos de cáncer ofrece un gran potencial en la investigación biomédica y en el desarrollo del diagnóstico específico de la célula y la terapéutica [21], sobre todo cuando los biomarcadores de la superficie celular están a menudo relacionadas con las regulaciones de células o vías de señalización.
Como oligonucleótidos , aptámeros son fácilmente reproducibles mediante síntesis química con mínimas variaciones de lote a lote. Por otra parte, con la modificación química, es fácil introducir módulos funcionales en aptámeros para satisfacer las necesidades específicas, tales como fluoróforos [22-25], enlazadores químicos [26, 27], terapéutica [28-30], o incluso nanopartículas [31- 33]. Con las notables propiedades anteriormente mencionadas, el desarrollo de aptámeros se ha explotado en diversos campos, particularmente aquellos que involucran aplicaciones biomédicas [34-41]. Otras investigaciones han llevado a la mejora de la especificidad y la eficacia de la entrega de imágenes, o agentes de diagnóstico, terapéuticos con aptámeros de escolta [24, 33, 42].
El objetivo del presente estudio fue descubrir aptámeros que reconocen hepatocelular carcinoma (HCC), que es la principal forma de cáncer de hígado, que representa el 90% de todos los cánceres de hígado [43]. Aquí, se utilizó el método de células-SELEX para generar aptámeros capaces de diferenciar línea celular de carcinoma hepatocelular humano HepG2 hígado de la línea normal de las células epiteliales de hígado THLE-2. Estos aptámeros se pueden usar como herramientas en estudios biomédicos y aplicaciones clínicas.
Materiales y Métodos
Cultivo de células y Buffers
HepG2 (carcinoma hepatocelular) y THLE-2 ( las células normales del hígado) fueron elegidos como células de selección positivos y negativos, respectivamente. Otras líneas de células, incluyendo células HeLa (cáncer cervical), MCF-7 y MDA-MB-231 (adenocarcinoma de mama), PL45 (cáncer de páncreas), H226 (pulmón carcinoma escamoso), A549 (adenocarcinoma de pulmón), Ramos (linfoma de Burkitt), CCRF-CEM (leucemia de células T), y TOV-21G (cáncer de ovario), se utilizaron para examinar la selectividad de los candidatos de aptámero. Todas las líneas celulares se adquirieron de la American Tissue Culture Collection (ATCC). HepG2, A549, MCF-7, y PL45 se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM); células Ramos, CCRF-CEM, H226 y HeLa se mantuvieron en RPMI-1640. La línea de células TOV-21G se mantuvo en cultivo con MCBD 105: Medio 199 (1: 1). Todos los medios anteriores se adquirieron de Sigma-Aldrich. La línea celular MDA-MB-231 se cultivaron en medio L-15 de Leibovitz (ATCC) a 37 ° C y impidió comunicarse con CO
2. BEGM Kit Bullet (Lonza /Clonetics Corporation) se utilizó para preparar un medio de crecimiento para THLE-2 células. Gentamicina /anfotericina (GA) y epinefrina se descartaron del kit, pero un 5 ng extra /ml de factor de crecimiento epidérmico (EGF), 70 ng /ml de fosfoetanolamina, y todos los otros aditivos en el kit se incluyeron en medio basal. Todos los medios se complementaron con suero inactivado por calor 10% fetal bovino (FBS) (Gibco) y 1% de penicilina-estreptomicina (100 unidades /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina) (Gibco). Todas las células, a excepción de MDA-MB-231, se incubaron a 37 ° C bajo un 5% de CO
2 atmósfera.
Tampón de lavado se preparó a partir salina tamponada con fosfato de Dulbecco (PBS) con cloruro de calcio y cloruro de magnesio (Sigma-Aldrich) con glucosa adicional (4,5 g /L) y MgCl
2 (5 mM). El tampón de unión se preparó añadiendo tRNA de levadura (0,1 mg /ml) (Sigma-Aldrich) y BSA (1 mg /mL) (Fisher) para el tampón de lavado.
Síntesis y purificación de Biblioteca y cebadores de ADN
El avance y los cebadores inversos fueron marcadas con FAM y biotina, respectivamente, en sus extremos 5 '. La secuencia del cebador directo fue 5'-FAM-AGA GAC GAC AAC TGC GAA-3 '; la secuencia del cebador inverso era 5'-Biotina-AAG AAG CCA CCG TGT CCA-3 '. La biblioteca de ADN consistía en una región de 25-nt aleatorizado flanqueado por los sitios de unión de cebadores: 5'-AGA GAC CCT GAC TGC GAA- (N
25) -TGG ACA CGG TGG CTT CTT-3 '. Todos biblioteca y cebadores secuencias fueron adquiridos de Tecnologías de ADN integrado (IDT) y se purificó por HPLC de fase inversa.
polimerasa reacción en cadena de
parámetros de amplificación de PCR se optimizaron antes el proceso de selección. Todas las mezclas de PCR contenían 50 mM de KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), MgCl 1,5 mM
2, dNTPs (0,2 mM cada uno), 0,5 M de cada cebador, y Taq ADN de arranque en caliente de la polimerasa (0.015 unidades /l) . PCR se llevó a cabo ya sea en un T100 BioRad o C1000 Thermo Cycler, y todos los reactivos de PCR se adquirieron de Takara. Cada ciclo de amplificación se realizó a 90 ° C durante 30 seg, 57 ° C durante 30 seg, y 72 ° C durante 30 seg, seguido de una extensión final de 3 minutos a 72 ° C.
la selección in vitro
el proceso de la célula-SELEX se realizó en base al protocolo [44] desarrollado por nuestro grupo, con algunas modificaciones. La selección se realizó sobre monocapas de células, ya que tanto HepG2 positivo y negativo THLE-2 utilizados aquí son líneas de células adherentes. Para la primera ronda de la selección, la combinación de ADN consistía en 20 nmol de la biblioteca de oligonucleótidos en 700 ml de tampón de unión. Para las rondas posteriores, se utilizaron 250 nM de oligonucleótidos amplificados a partir de la piscina restante anterior. La biblioteca de ADN se calentó a 95 ° C durante cinco minutos, seguido por enfriamiento rápido en hielo durante 5 minutos antes de la incubación, permitiendo que las secuencias de ADN para formar las estructuras secundarias más favorables. A continuación, la biblioteca de ADN se incubó con las células HepG2 en monocapa durante 1 hora a 4 ° C después de la eliminación de medio y lavar dos veces con tampón de lavado. El tiempo de incubación disminuyó a medida que progresaba la selección: 60 min para las rondas 1 y 2, 45 min para la ronda 3, y 30 min para todas las rondas posteriores. Entre cada ciclo, las células se lavaron tres veces con tampón de lavado para eliminar las secuencias no unidos. El tiempo de lavado y el volumen de tampón de lavado se aumentaron como la selección progresó para eliminar candidatos débiles y obtener aptámeros con alta especificidad y selectividad. Después las células se separan del plato con un raspador de células, y se recogió el escombros en 500 l de tampón de unión. El complejo se calentó a 95 ° C durante 10 minutos y después se centrifugó a 14.000 rpm durante 5 minutos. Se recogió el sobrenadante y estaba lista para la amplificación PCR durante las dos primeras rondas cuando no se incluyó la selección negativa. Para las rondas posteriores con la selección negativa, el sobrenadante se incubó con la monocapa de células negativas THLE-2 durante 1 hora a 4 ° C, y se recogieron los sobrenadantes.
El sobrenadante que contiene secuencias de ADN unido se amplifica por PCR usando FAM y cebadores marcados con biotina. El número de ciclos de amplificación de PCR optimizadas se confirmó con electroforesis en gel de agarosa. perlas de sefarosa recubiertas de estreptavidina (GE Healthcare Life Sciences) se utilizaron para aislar los productos de PCR de la mezcla de reacción. El ADN de cadena simple marcado con fluoróforo (ssDNA) fue entonces separada de la ssDNA antisentido biotinilado por eluyendo con NaOH 200 mM. Por último, el ssDNA se desaló con una columna NAP-5 (GE) y se redisolvió en tampón de unión.
El proceso de selección se repitió hasta que se obtuvo un enriquecimiento significativo sostenido en la 19a ronda. El enriquecimiento de las piscinas se analizó con citometría de flujo (Accuri C6, BD).
secuenciación de próxima generación y piscina Enriquecido 19 fue elegido Análisis
para la secuenciación. El ssDNA separada de la piscina 19 se amplificó por PCR de nuevo para agregar las secuencias adaptadoras (CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG TCT CCG ACT CAG AGA GAC AAC GAC TGC GAA y CCT CTC TAT GGG CAG TCG GTG ATA AGA AGC CAC CGT GTC CA ) y se purificó usando un kit de purificación de PCR (Qiagen). Las muestras purificadas se sometieron a Ion Torrent secuenciación de próxima generación en la Universidad de Florida, Centro de Secuenciación ICBR Core. Los productos fueron alineadas para identificar las secuencias más abundantes utilizando software Galaxy. Cualquiera con menos de 10 copias fueron retirados del análisis. El restante lee (501.084) y luego se agruparon, y las 20 secuencias más abundantes (Tabla S1 S1 en Archivo) se sintetizaron químicamente para una caracterización adicional.
Análisis de Unión
aptámeros candidatos recuperados fueron sintetizados por el método de fosforamidita convencional utilizando un sintetizador de ADN 3400 (Applied Biosystems) y se purificó por HPLC de fase inversa (Varian Prostar usando una columna C18 y acetato de acetonitrilo /trietilamonio como fase móvil). Reactivos para síntesis se adquirieron de Glen Research. se aplicó BD Accuri C6 citometría de flujo (BD Immunocytometry Systems) para controlar el enriquecimiento de las secuencias de ssDNA en las piscinas durante el proceso de selección y para evaluar la afinidad de unión y la especificidad de los candidatos seleccionados de aptámero. solución de disociación celular no enzimática se utilizó para separar las células, y luego las células dispersas se lavaron con tampón de lavado. Cuando se necesitaban células tratada con proteasa, la tripsina se utiliza en lugar de la solución de disociación celular no enzimática. La tripsina y la solución de disociación celular no enzimática fueron ambos adquiridos de Sigma-Aldrich. Los ensayos de unión se llevaron a cabo por citometría de flujo después de la incubación de 4 x10
5 células dispersas en 200 l de tampón con piscinas o aptámeros de unión a 250 nM durante 30 min a 4 ° C (o 37 ° C como se indica). Para cada candidato aptámero, la afinidad de unión (como K
d) se evaluó hacia la línea de célula diana HepG2 utilizando Sigma Plot mediante el ajuste de la intensidad de fluorescencia media relativa de la unión frente a la concentración de los aptámeros mediante la ecuación de saturación Y = B
maxX /(K
d + X) (y es de unión específica, a la concentración de aptámero = X en nanomolar, y Bmax es la unión máxima.) las células se incubaron a 4 ° C durante 30 min con una serie de concentraciones (0.1, 0.5, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 250, 500, 1000, 2000 nM) de cada recuperaron aptámero con marcado con biotina en el extremo 5 '. Las células fueron lavadas dos veces con 1 ml de tampón de lavado, se suspende en 200 l de tampón que contiene estreptavidina-PE de unión, y se tiñeron durante 20 min. Las células se lavaron de nuevo dos veces con 1 ml de tampón de lavado y luego se suspendieron en 100 l de tampón de unión para el análisis de citometría de flujo. La biblioteca no seleccionada marcado con biotina se utilizó como control negativo para determinar la unión de fondo. La intensidad de fluorescencia media de la biblioteca no seleccionada fue restada de la del aptámero correspondiente con las células diana para determinar la unión del aptámero marcado específico. Todos los ensayos de unión se repitieron tres veces.
Resultados y Discusión
El proceso de selección se inició con una biblioteca al azar que contiene aproximadamente 1,2 × 10 secuencias
16 (20 nmol) ssDNA de 61 nucleótidos ( nt), seguido por la unión secuencial con la diana células HepG2, la elución y la posterior amplificación por PCR de un total de 19 rondas. Contra-selección con THLE-2 células se introdujo en la tercera ronda y se llevó a cabo en todas las rondas siguientes para eliminar la posibilidad de cualquier oligonucleótidos que reconocen marcadores de manera uniforme a ambas líneas celulares negativas objetivo y. progreso de enriquecimiento se monitorizó ensayando la unión de ssDNA recuperado de cada ronda en las células diana mediante citometría de flujo. No se observaron cambios graduales en la intensidad de fluorescencia en las siguientes rondas. La señal fluorescente dejó de aumentar entre las rondas 17 y 19, lo que implica que saturada de unión de las combinaciones enriquecidas que se ha logrado (Fig 1A). No hay un aumento de intensidad de fluorescencia obvio fue encontrado con las células normales THLE-2 de hígado en la piscina 19 (figura 1B), lo que indica que, en comparación con la biblioteca inicial, enriquecido ssDNA piscina 19 mostró unión preferencial a las células HepG2, no THLE-2 células.
(a) los ensayos de unión mostraron un cambio notable en la mayor unión de la piscina a las células de cáncer de hígado (HepG2) y dejó de aumentar después de la 17
ª ronda de selección. se observó (B) Una disminución sutil en la intensidad de fluorescencia para las células normales del hígado (THLE-2), alcanzando un desplazamiento mínimo en el 19
ª ronda. La curva roja representa las células incubadas con la biblioteca inicial no seleccionada.
El ssDNA se recuperó de ronda 19 se presentó para la próxima generación de secuenciación profunda. Los más abundantes 20 secuencias (Tabla S1 S1 en File) se sintetizaron químicamente, marcado con biotina en el extremo 5 ', y después se purificó por HPLC. Las secuencias se cuantificaron (UV 260/280) y se diluyeron a concentraciones estándar.
análisis de unión se realizó mediante la incubación de células positivas o negativas con 250 nM de cada candidato aptámero. De acuerdo a fluir resultados de análisis de citometría, ninguno de los oligonucleótidos muestra la unión con las células del hígado epiteliales normales THLE-2, mientras que los siete candidatos aptámeros mostraron cambios aparentes en la intensidad de fluorescencia en las células HepG2 con respecto a una secuencia aleatoria (Fig 2, Tabla S2 en S1 File), lo que implica que todos los aptámeros seleccionados podrían diferenciar las células de cáncer de hígado a partir de células hepáticas normales.
los aptámeros seleccionados mostraron aparente de unión a las células de hepatoma HepG2 (a), mientras que no mejora la fluorescencia se encontró con las células del hígado epiteliales normales (B), utilizando citometría de flujo. Los experimentos se realizaron a 4 ° C.
Las afinidades de unión de los aptámeros seleccionados se determinó entonces mediante la evaluación de las constantes de disociación (K
d). A menor K
valor d indica una unión más fuerte del aptámero seleccionado a las células objetivo. Tal como se recoge en la Tabla 1, los aptámeros reportados en este estudio mostraron afinidades de unión hacia las células HepG2 en el rango nanomolar (64-349 nM), lo que sugiere que estos aptámeros unidos fuertemente a sus células HepG2 objetivo.
para evitar que las secuencias de unión de ser internalizado, se realizó la
in vitro
selección a 4 ° C, así como los ensayos de unión mencionadas anteriormente. Los aptámeros seleccionados no pierden su reconocimiento a las células diana HepG2 a temperatura fisiológica (Fig 3A). El cambio de fluorescencia de células incubadas con aptámeros en comparación con las células incubadas con la biblioteca se conservó cuando las pruebas de unión se llevaron a cabo a 37 ° C.
(A) El cambio de intensidad de fluorescencia en HepG2 se incubaron con cada una de las aptámeros seleccionados mantuvieron a 37 ° C. (B) Las intensidades de fluorescencia no cambian cuando las células HepG2 se trataron con tripsina durante 30 min antes de la incubación, lo que indica que las proteínas de membrana son los objetivos probables.
Se ha informado de que los aptámeros interactúan específicamente con las superficies de las células diana durante la selección [5, 20]; Por lo tanto, se realizó otra serie de pruebas de unión (37 ° C) utilizando células HepG2 tratadas con tripsina durante 30 min antes de la incubación con sondas para examinar si los aptámeros seleccionados se dirigen a proteínas de membrana en HepG2. Como se muestra en la figura 3B, todos los aptámeros seleccionados perdieron su unión preferencial a la biblioteca con las células HepG2 tratadas con proteasa, indicando los objetivos de estos aptámeros son probablemente las proteínas de membrana.
Se ha informado de que ciertas proteínas son asociada al cáncer [45, 46]. Por lo tanto, la identificación de las proteínas comunes presentados por las células del cáncer y la investigación de su relevancia para el cáncer puede proporcionar pistas sobre el desarrollo del cáncer. Después de la prueba de los aptámeros seleccionados fueron capaces de diferenciar el carcinoma hepatocelular a partir de células epiteliales normales del hígado, se examinaron además la selectividad de unión de los aptámeros contra líneas celulares de otros tipos de cáncer, incluyendo el carcinoma pulmonar de células escamosas (H226), adenocarcinoma de pulmón (A549), de cuello de útero adenocarcinoma (HeLa), adenocarcinoma de mama (MCF-7, MDA-MB-231), adenocarcinoma de ovario (TOV-21G), adenocarcinoma de páncreas (PL45), y leucemia (Ramos, CCRF-CEM) (Tabla 2). Se encontró que los siete aptámeros también muestran una unión significativa hacia adenocarcinoma de pulmón, cáncer de ovario y células de riñón embrionario, lo que indica la fuerte posibilidad de algunas proteínas comunes expresados por estas células, mientras que, al mismo tiempo, que no mostraron afinidad para la leucemia o cervical Células cancerígenas. Dado que el cáncer de pulmón es un destino común de metástasis del cáncer de hígado [47], este resultado podría apoyar el uso de estos aptámeros como sondas moleculares para estudiar la metástasis del cáncer. Además, todos los aptámeros mostraron reconocimiento hacia la línea de uno de los senos de células de cáncer, MCF-7, pero no la otra línea celular de cáncer de mama, MDA-MB-231. Esta diferencia puede atribuirse al hecho de que son dos subtipos distintos de cáncer de mama. Por ejemplo, MCF-7 cae en el subtipo luminal A con receptor altamente expresado de estrógeno (ER) y receptor de progesterona (PR), y MDA-MB-231 pertenece al subtipo basal-como que es negativo para ER y PR [48] . En consecuencia, este resultado sugiere que estos aptámeros pueden aplicarse a estudios de cáncer hormono-dependientes
Conclusión
Los siete aptámeros reportados son capaces de distinguir hepatoma de las células normales del hígado.; demostraron altas afinidades hacia la línea celular HepG2 a 4 ° C (K
d's de 64 a 349 nm), así como a 37 ° C, mientras que no es detectable la unión de las células normales del hígado se observó. Los experimentos de tratamiento de proteinasa indicaron que todos los siete aptámeros reconocen célula diana HepG2 a través de proteínas de la superficie. Además, estos aptámeros mostraron reconocimiento hacia el cáncer de pulmón, cáncer de ovario y cáncer luminal A subtipo de mama. Estos resultados sugieren que estos aptámeros pueden ser sondas potenciales para futuras investigaciones en estudios de cáncer, como el desarrollo de ensayos de detección temprana, terapias dirigidas, y agentes de imagen, así como para la investigación de las proteínas de membrana comunes en estos tipos de cáncer distinguibles.
Apoyo a la Información
S1 archivo. . Archivo de apoyar las tablas combinadas sobre Table S1: Número de lecturas y el porcentaje para las 20 secuencias más abundantes. Secuencia#es designado en el orden de la abundancia. El total de#lee en todo el conjunto de ADN es 501.084. Entre los más abundantes secuencias de veinte, siete de ellos son reportados como aptámeros dirigidos células HepG2. Tabla S2: La intensidad de fluorescencia detectada a partir de las células incubadas con 250 nM de cada uno de los aptámeros o una biblioteca de ADN 61-mero aleatorio. (G-media: media geométrica)
doi: 10.1371 /journal.pone.0125863.s001 gratis (DOCX)
Reconocimientos
Los autores agradecen al Dr. Kwame Sefah para el diseño cebadores y proporcionar consejos útiles que contribuyeron a este trabajo, la doctora Kathryn R. Williams, por su revisión crítica del manuscrito, y el núcleo de la secuenciación del ADN, ICBR, de la Universidad de Florida en busca de ayuda durante la secuenciación profunda de próxima generación.